마우스 배아 심장에서 심 외막 세포의 체외 배양에서

이 외피 배양의 전반적인 목표는 배아 심외막 세포의 배양을 촉진하여 심외막 세포 생물학에서 특정 유전자의 역할에 대한 탐구를 용이하게 하는 것입니다. 이 방법은 심외막 세포가 심혈관 발달, 질병 및 재생에 어떻게 기여하는지와 같은 심장 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 순수한 외막 세포 집단의 장기 배양을 가능하게 한다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 심실을 분리하는 데 연습을 통해서만 얻을 수 있는 정밀도가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 배아 심실을 채취하려면 먼저 배아 12.5일째에 시간이 지정된 임신한 마우스를 해부 테이블의 누운 자세로 놓고 복부를 70% 에탄올로 소독합니다. 배꼽 위의 피부를 들어 올리고 정중선을 따라 1-2cm 절개를 만듭니다.

그런 다음 절개 부위의 양쪽을 당겨 복벽을 드러내고 벽을 잘라 자궁 뿔을 드러냅니다. 그런 다음 멸균 집게를 사용하여 뿔을 들어 올리고 뿔에 붙어 있는 지방 조직과 혈관을 조심스럽게 잘라냅니다. 자궁경부를 마지막으로 절개하여 자궁을 채취하고, 자궁경적을 차갑고 멸균된 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다.

티슈를 부드럽게 헹구고 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다. 가위를 사용하여 태반 반대쪽에 있는 자궁 뿔의 정중선을 잘라 배아를 노출시킵니다. 그런 다음 멸균 집게를 사용하여 배아 난황낭을 잘라 배아를 추출하고 각 배아를 수확할 때 차갑고 멸균된 PBS가 들어 있는 새 페트리 접시에 넣습니다.

참수 후 각 배아에 대해 차례로 흉벽을 잘라 심장을 드러냅니다. 멸균 겸자를 사용하여 심장을 들어 올리고 심장을 가슴에 연결하는 혈관을 잘 잘라냅니다. 그런 다음 각 심장에서 유출로와 양쪽 심방을 잘라내고 얼음 위에 차가운 PBS가 담긴 새 접시에 심실을 놓습니다.

유리 챔버 슬라이드에서 심외막 외식재를 배양하려면 8개의 웰 챔버 슬라이드의 각 웰에 500마이크로리터의 심외막 배양 배지를 추가하고 절제된 심실 면이 아래로 향하게 하여 각 웰의 중앙에 파종합니다. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 48-72시간 동안 부드럽게 넣어 외식이 챔버 슬라이드 표면에 부착되도록 합니다. 심외막 세포를 평활근 세포로 분화시키기 위해, 분화 배지에서 심외막 단층을 6일 동안 더 배양합니다.

콜라겐 겔에서 심외막 세포를 배양하려면 먼저 피펫팅으로 적절한 양의 콜라겐 용액과 5 x DMEM을 혼합합니다. 솔루션이 노란색으로 바뀝니다. 다음으로, 혼합과 함께 해당 부피의 중화 용액을 첨가하십시오.

용액이 분홍색으로 바뀔 것입니다. 이제 100마이크로리터의 콜라겐 용액을 96웰 플레이트의 각 웰로 옮기고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣어 겔이 중합될 수 있도록 합니다. 30-60분 후 각 웰에 200마이크로리터의 심외막 외막 배양 배지를 추가하고 절제된 면이 아래로 향하게 하여 절제된 심실을 각 웰의 중앙으로 옮깁니다.

플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 3일 동안 부드럽게 넣습니다. 3일째에는 심실을 제거하고 플레이트를 인큐베이터에 2일 더 넣습니다. 48시간에서 72시간의 배양 후, 적색 형광 단백질 면역형광등과 명시야 이미지의 중첩은 심실에서 이동하는 대부분의 세포가 심외막에서 기원한다는 것을 보여줍니다.

이러한 1차 심외막 세포 배양에서 분리된 RNA의 qPCR 분석은 또한 심근세포 마커 유전자 발현이 거의 없는 표피 특이적 유전자의 강력한 발현을 보여줍니다. 여기서, 원형질막에 대한 ZO-1의 국소화는 세포가 아직 상피에서 중간엽으로의 전이를 거치지 않았음을 나타냅니다. 또한, alpha Tubulin에 대한 면역염색은 표심 세포의 편광 미세소관 정렬을 보여주어 전이 중 세포의 방향성 이동을 촉진합니다.

6일간의 배양 및 분화 배지 후, 평활근 액틴의 존재는 심외막 세포가 평활근 세포로 성공적으로 분화되었음을 입증합니다. 실제로, 콜라겐 겔 침습 분석법의 팔로이딘 면역 염색은 심외막 유래 세포의 이동 능력을 보여줍니다. 콜라겐 매트릭스에 대한 세포 침투 깊이를 결정하기 위해 심외막 유래 세포 침투의 z-stack 시각화를 위해 컨포칼 이미지에서 3D 재구성을 생성할 수 있습니다.

심실을 적출하는 동안 외심 손상을 피하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 심외막 세포의 분화, 이동 및 세포 표면 단백질 발현을 평가하는 다른 방법을 수행하여 그 기능에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 방법은 심장 분야의 연구자들이 마우스 모델을 사용하여 심외막 생물학을 탐구하는 데 도움이 될 수 있습니다.