Name: 단백질 Bioconjugates의 합성를 통해 시스테인 - 말레이 미드 화학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 학습하세요 시스테인-말레이미드 화학을 이용한 단백질 바이오컨쥬게이트 합성 방법을. 사이토크롬 C를 환원하고 FPLC로 정제한 후 루테늄 말레이미드와 반응시켜 고특이성 생체결합물을 제조합니다. 이 기술은 항체-약물 컨쥬게이트 및 형광 현미경 연구에 활용됩니다.

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질량 분석 및 NMR 시설에 접근할 수 있도록 P.T.와 UNSW의 Mark Wainwright 분석 센터에 ARC Future Fellowship(FT120100101) 및 ARC Centre of Excellence CE140100036) 보조금을 제공한 ARC(Australian Research Council)에 감사드립니다.

참고도 1에 나타낸 바와 같이 다음과 같은 프로토콜은 단백질 염색 bioconjugate의 합성 설계 메모를 삽입하여 막 단백질을 지원하기 위해 해당되는 그것이 자유 표면 시스테인 함유 단백질과 말레이 미드의 반응을위한 일반적인 프로토콜이다. bioconjugates 단백질 폴리머 bioconjugates, 합성 단백질 이량 체 (단백질 - 단백질) bioconjugates. 특히이 경우, 단백질 이소 한 시토크롬 C는 매우 구체적인 표시가 발생할 수있게 반응 할 수 일면 시스테인 잔기를 갖는다. 목적 단백질 다중 시스테인 잔기를 갖는 경우, 동일한 프로토콜이 특이 제품의 균질성의 손실이라도 적용된다. 특이성이 요구되지 않는 경우, N -hydroxysuccinimidyl 에스테르 또는 이소 티오 시아 네이트를 사용하여 화학 타겟팅 표면 리신 잔기는 단순한 방식 일 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54157/54157fig1.jpg" /> <strong&gt;도 1 바이오 콘쥬 게이션 반응식. 일례의 경우, 광 수확로서, 루테늄 계 안테나 분자 (CYS102) 루테늄 계 안테나 분자 펜던트 말레이 미드 및 노출 된 시스테인 잔기의 마이클 부가 통해 시토크롬 C에 부착 될 단백질에. CYT의 C면의 빨간색 영역은 헴 그룹을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54157/54157fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 시토크롬 C 1. 정제 참고 :이 단계는 모든 단백질에 적용 할 수 없습니다. 그러나, 상업적 공급 업체로부터 얻은 단백질을 추가로 정제 (13)에 의해 제거 할 수있는 다른 원하지 않는 단백질 이소 형을 포함 할 수 있다는 것을 아는 것이 중요하다. <ol><li> PR에 초순수에 1 L (= 120g 몰 -1 승 M) 인산이 수소 나트륨 2.4 g을 녹이고20 밀리미터에 NaH 2 PO 4를 함유하는 완충액을 epare. pH 7로 1 M NaOH로 pH를 조정합니다. 주 :이 프로토콜에서 사용하는 인산 버퍼 매일 신선하게 제조하고, 사용 전에 0.2 ㎛의 셀룰로오스 멤브레인 필터를 통해 여과한다. </li><li> 20 밀리미터에 NaH 2 PO 4, 1 M의 NaCl 완충액을 염화나트륨 29.22 g (w M = 58.44 g 몰 -1)하는 20 mM의 NaH 2 PO 4 완충액 500ml에 녹인다. 이 단계 1.6)의 정제에 대해 용출 버퍼이다. </li><li> pH가 7하는 20 mM 인산 완충액 6 ml의 동결 건조 시토크롬 C (CYT의 C) 12.0 mg을 녹이고. </li><li> 별도로 1 M 스톡 용액을 제조 초순수 95.3 μL 디티 오 트레이 톨에 14.7 mg의 (DTT, w M = 154.25 g / 몰)을 녹인다. 주 :이 시약 수용액 산화 비활성화되기 쉽다 같이 DTT 원액이 새로 제조한다. </li><li> 씨단백질 용액에 1 M DTT 용액 60 ㎕를두기가이 CYT의 C를 줄일 수 있습니다. 용액의 색이 혼합에 밝은 빨간색 진한 빨간색으로 변경됩니다. </li><li> 모든 크로마토 그래피 매체 상으로 주입하기 전에 0.22 ㎛의 저 단백질 결합 주사기 PVDF 필터를 통해 감소 된 단백질 용액을 필터. </li><li> 주입 루프와 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC) 악기의 UV-마주 검출기 사이에 3.3 ml의 강한 양이온 교환 컬럼을 연결합니다. </li><li> 1 ml / 분의 유속을 사용하여 20 mM의 pH를 7 포스페이트 완충액의 3 컬럼 부피 다음 초순수의 3 컬럼 부피로 컬럼을 평형화. </li><li> 로드 1 주입 루프로 감소 원유 CYT (c)의 ml의 328에서 그라데이션 방법 시작 - 5 열 볼륨을 통해 450 mM의 염화나트륨을. 자외선 마주 검출기의 280 nm 내지 410 nm의 채널을 모니터링하고, 가장 큰 피크를 수집합니다. </li><li> 이소 - 2 시토크롬을 용출 1 M 2 열 볼륨에 염 농도를 증가전자 C 및 열 플러싱 한 후, 다음 조 분취 량을 주입하기 전에 인산 완충액 20 mM의 2 컬럼 부피로 열을 재 - 평형. </li><li> 모든 원유 단백질을 정제 할 때까지 반복 1.9-1.10 단계를 반복합니다. </li><li> 이소-1 포함하는 분획을 수영장과 3.5 kDa의 분자량 컷오프 (MWCO) 스핀 필터를 사용하여 X g 3,000에서 원심을 집중한다. </li><li> 3.5 kDa의 MWCO 투석 카세트에 집중 단백질을로드하고 물이 변경, 초순수 하룻밤에 투석. </li><li> 10 μl를 복용 초순수 100 μL로 희석하고, 흡광 스펙트럼을 취함으로써 순수, 농축 된 단백질 용액의 농도를 결정한다. 적은 양을 사용하여 100 ㎕의 석영 큐벳 단백질 흡광도 스펙트럼을 얻었다. 100 μM - 전형적으로, 희석 된 단백질 농도는 50 정도이다. <ol><li> concentratio을 정량화하는 CYT (c)의 특성 410 nm의 피크를 사용하여N 97.6 cm -1 mM의 -1의 몰 흡수율 값과 맥주 - 램버트 법칙을 사용하여 : A = ε × C × ι A는 흡광도이고, ε는 몰 흡광 계수는, C는 mm 단위 농도이고, ι는 13 cm 큐벳의 광로 길이이다. </li></ol></li><li> 이 때, 1 mL의 분취 액으로 단백질을 분할하여 사용하기 전까지 -20 ℃에서 냉동 보관. CYT C는 냉동 구조 나 기능의 손실없이 해동하지만, 반복주기는 단백질을 변성 시작합니다 할 수 있습니다. 참고 : 단백질은 다른도에 냉동 용납. 예를 들어, 5,9 냉동되지 않아야 녹색 형광 단백질 대신 냉장고에 보관. </li></ol> Bioconjugates C 시토크롬 2. 합성 <ol><li> 루테늄 0.9 mg의 용해 (II) bisterpyridine maleimIDE (RU (II) (TPY) 2 말레이 미드, 0.975 μmol, 6 당량)을 아세토 니트릴 600 ㎕를한다. 주 : 사용 된 말레이 미드가 수용성 인 경우 물 대신에 아세토 니트릴의 스톡 용액을 제조 하였다. 말레이 미드를 반응 완충액에 용해되는 것이 중요하다. 디메틸 술폭 시드, N, N 디메틸 포름 아미드, 아세토 니트릴은 모두 공통의 저 분자량 (12)들은 소수성 말레이 미드 시약의 용해 보조제를 돕기 위해 사용된다. </li><li> 20 mm로 희석시 EDTA가 용해 될 때까지 통상적으로 (수 g을 고체 수산화 나트륨을 추가의 pH 7에서 100 mM의 포스페이트 완충액, 100 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA, M w = 292.24 g / 몰)을 함유하는 완충액을 준비 ) 및 pH를 7로 조정합니다. </li><li> (286.65 g / 몰 = W TCEP 15 M) 초순수 한 용액에가 10mM의 스톡 용액을 제조 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀 하이드로 클로라이드 2.87 mg을 녹인다. 이 단계는 수입입니다개미는 단백질의 시스테인이 완전히 (15)를 결합 말레이 미드 이전에 감소되는 것을 확인합니다. 참고 :이 시약은 수용액에서 산화 비활성화에 영향을 받기 쉽다 같이 TCEP 원액이 각 반응에 갓 준비를해야합니다. </li><li> 50㎖의 플라스틱 튜브에서 100 mM의 인산 / EDTA 원액 3 ㎖로 초순수 11.4 ml의 결합. 단백질과 말레이 미드 재고 솔루션을 추가로 희석하면 버퍼 농도는 20 mM의 것입니다. 주 : 표지되는 단백질은 막 관통 단백질 인 경우, 적합한 세제는 단백질을 가용화 버퍼에 추가되도록. 세제를 사용하지 않는 경우, 막 단백질을 천천히 반응 수율에 부정적인 영향을 미칠 것이다 석출된다. 모든 후속 정제 단계에서 세제를 사용하십시오. </li><li> 인산-EDTA 버퍼로 정제 CYT (c)의 0.15 μmol (50 μM 용액 3 ㎖, 1 당량)를 추가합니다. </li><li> TCEP 스톡 오디오 솔루션의 7.5 μl를 추가단백질 용액에 이온 (0.075 μmol, 0.5 당량) 및 시스테인 산화에 의한 이량 체화 할 수있는 어떤 단백질을 줄이기 위해 5 분 동안 교반를두고. 참고 : 관심의 단백질이 쉽게 이량하지 않는 경우 TCEP를 추가하지 마십시오. 비 환원 조건 하에서 단백질 젤을 실행하여이 옵션을 선택합니다. </li><li> 24 시간 동안 실온에서 어두운 곳에서의 Ru (II) (TPY) CYT C의 감소, 완충 용액이 말레이 미드의 아세토 니트릴 용액을 600 μL를 추가하고, 반응 액의 교반을 떠난다. </li><li> 3.5 kDa의 MWCO 스핀 필터를 사용하여 상기 반응 혼합물에, 3000 × g으로 원심 분리 여과 분명히 실행까지 신선하는 20 mM 인산 완충액으로 2-3 회 반복을 농축시킨다. 정제의 다음 단계 전에 가능한 반응 혼합물로부터 많은 미 반응 말레이 미드를 제거한다. 주 :이 시점에서, 조 바이오 콘쥬 게이션 혼합물을 어두운 곳에서 냉장고에 저장 될 수있다. CENTR에 의해 미 반응 말레이 미드 염료를 제거하는 것이 중요하다저장 전에 투석 ifuge 말레이 미드로 천천히 비특이적 단백질의 표면 상에 리신 잔기와 반응 할 수있다. </li></ol> 사이토 크롬 c Bioconjugates 3. 정제 <ol><li> 20 밀리미터에 NaH 2 PO 4, 0.5 M NaCl을 함유하는 완충액을 제조 인산이 수소 나트륨 2.4 g과 초순수의 1 L의 염화나트륨 29.22 g을 녹인다. 이 고정화 된 금속 친 화성 크로마토 그래피 (IMAC) 정제 누적 버퍼이다. </li><li> 이미 다졸 17 g (w M = 68.077 g 몰 -1)하는 20 mM의 NaH 2 PO 4, 0.5 M의 NaCl 완충액 500ml에 녹인다. 이것은 IMAC 정화용 용출 버퍼이다. </li><li> 1 M 수산화 나트륨 또는 염산을 사용하여 pH 7로 모두 버퍼의 pH를 조정하고 FPLC에 사용하기 전에 0.22 μm의 재생 셀룰로오스 멤브레인을 통해 필터링. </li><li> 구입 한 IMAC 열이 COL에로드 된 금속 이온 않은 상태로 제공되기 때문에UMN 초순수 3 초순수 ㎖, 100 mM의 아세트산 니켈 수용액 3 ㎖, 6 ㎖로 칼럼을 세척하여 니켈 2+ 기반 정제 용 컬럼을 준비한다. 열을 즉시 사용하지 않으면 20 % 에탄올 3 mL를 통해 세척 및 박테리아 성장을 방지하기 위해 냉장고의 열을 저장한다. </li><li> 나 Ni 2+가 주입 루프와 UV-마주 검출기 사이의 FPLC에 1 ml의 IMAC 열을 -loaded 연결합니다. </li><li> 20mM의​​ 인산의 3 컬럼 부피, 0.5 ㎖ / 분의 유속을 사용하는 0.5 M의 NaCl 완충액으로 칼럼을 평형화. </li><li> 로드 니켈 2+ IMAC 컬럼에 (0.22 μm의 주사기 필터를 통해 여과), 조 반응 혼합물의 100 μL. 루테늄 bisterpyridine - 시토크롬 C의 bioconjugate을 용리 125 내지 3mm 이상의 컬럼 부피에 0 내지 다졸 구배이어서 미 반응 CYT에 c 용출 완충액을 실행하는 3 컬럼 부피로 컬럼을 씻으 (RU (II) -cyt c) . </li><li> ㄴ을 씻으십시오모든 원유 bioconjugate 정제 될 때까지 olumn 5 열 볼륨 250 mM의 이미 다졸 버퍼, 다음 20 mM의 인산, 0.5 M의 NaCl 단계를 반복 3.7과 열을 다시 평형. </li><li> bioconjugate 분수 수영장과 3,000 x g에서 원심 분리, 3.5 kDa의 MWCO 스핀 필터를 사용하여 집중한다. </li><li> 3.5 kDa의 MWCO 투석 카세트에 집중 bioconjugate를 넣고 물 2 변경, 초순수 하룻밤에 투석. </li><li> 이소 시토크롬 C 1과 동일한 몰 흡광 계수 값을 이용하여, UV-비스하여 순수한 bioconjugate 농축 용액의 농도를 결정 (97.6 mM의 -1 cm-1) 410 nm에서. 100 μM - 일반적 bioconjugate 농도는 50 정도이다. </li><li> 25 μL 씩에 bioconjugate를 나누고 필요할 때까지 -20 ℃에서 냉동 보관합니다. </li></ol> 사이토 크롬 c Bioconjugates 4. 특성 <ol><li> 그만 두게 하다MALDI-TOF MS에 의해 bioconjugate 질량의 mination <ol><li> 아세토 니트릴 / 물 / 트리 플루오로 아세트산 수용액 1 ㎖에 카페 산 10 ㎎을 용해 (20 : 80, 0.1, V / V / V). </li><li> 카페 인산 용액 5 μL 농축 단백질 용액 5 μL를 희석. </li><li> 스팟 0.5 MALDI 대상 접시에 카페 산 용액의 μL 및 솔루션을 건조 할 수 있습니다. </li><li> 스팟 0.5이 카페 산 지점의 상단에 시료 / 매트릭스 솔루션 μL, 현장 건조 할 수 있습니다. &quot;샌드위치&quot;매트릭스의 층 사이의 샘플이 위에 시료 매트릭스의 또 다른 0.5 μl를 발견하고, 건조 할 수 있습니다. </li><li> 단백질 16에 적합한 기기 설정을 사용하여 선형 모드에서 질량 스펙트럼을 획득. </li></ol></li><li> 겔 전기 영동에 의해 bioconjugates의 조사 <ol><li> 각각의 단백질 시료 10 μL는 미리 혼합 리튬 도데 실 설페이트 (LDS, 산도 8.4) 버퍼 (4 배) t으로 단백질 시료를 희석하여 실행 준비OA 아니라 당 약 20 μg의 최종 농도. 조건을 줄일 필요 웰를 들어, 500 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT) 제 (10 배) 감소 1 μl를 추가합니다. </li><li> 10 분 동안 70 ℃에서 가열 된 샘플. </li><li> 겔 실행 버퍼를 준비하는 혼합 50 ml의 1 M MES, 1 M 트리스베이스, 2 % SDS, 20 mM의 EDTA (PH 7.7) 초순수 950 ml의에 상용 소스에서 버퍼 혼합물 (20 배)를 실행을 추가합니다. </li><li> 겔에서 플라스틱 빗를 제거하고 젤 실행중인 탱크에 젤을 배치합니다. 우물은 버퍼로 덮여되도록 젤 실행 버퍼 탱크를 채우십시오. </li><li> 로드 샘플을 조심스럽게 프리 캐스트 12 % 비스 - 트리스에 1 mm의 긴 피펫 팁을 사용하여 10 웰 젤 로딩을 지원합니다. 분석을 돕기 위해 젤의 중간 잘으로 미리 염색 10 단백질 분자량 마커 (3-188 kDa의)를 넣습니다. </li><li> 35 분 동안 200 V 일정한 전압에서 젤을 실행합니다. </li><li> 2 시간 동안 상용 쿠마 블루 용액으로 젤 얼룩 및 ultrap 씻어48 시간 동안 URE 물. </li></ol></li><li> UV - 마주 분광에 의한 bioconjugate 순도의 결정 <ol><li> 의 Ru (II) (TPY) 2 말레이 미드, 이소 - 1 CYT의 c 및의 Ru (Ⅱ) -cyt (c)의 5 μm의 솔루션을 120 μl를 준비합니다. </li><li> 250 ㎚ 내지 650 ㎚, 초순수만을 함유하는 석영 큐벳의 기준선 스펙트럼을 측정한다. </li><li> 큐벳을 세정하고 각 측정 사이에 건조 있도록 각 구성 요소의 스펙트럼을 측정한다. </li><li> 파장의 함수로서 각각의 성분의 흡광도를 플롯하고, 하나를 결정하기 위해 최종 생성물과 출발 물질의 선형 합과 비교 :의 Ru (II) (TPY) CYT C까지 2 말레이 미드의 한 비 반응했다. </li></ol></li></ol>

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<li>Müller, M., Azzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+labeling+of+beef+heart+cytochrome+oxidase+subunit+III+with+eosin-5-maleimide%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Selective labeling of beef heart cytochrome oxidase subunit III with eosin-5-maleimide.</a> FEBS Lett. 184 (1), 110-114 (1985).</li>
<li>Shen, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nat. Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).</li>
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바이오 콘쥬 게이션 전에 출발 물질의 정제는 매우 중요하다. 상업 재조합 소스에서 얻은 단백질은 종종 다른 표면 화학 및 반응성을 가질 수 있습니다 관심있는 단백질의 다른 이성체를 포함한다. 예를 들어, 설명 바이오 콘쥬 게이션에서 시판 CYT C는 모두 ISO-1, ISO-2 CYT C 형 12,14,17의 혼합물을 포함한다. ISO -2- 이소 -1- 시토크롬 C 형태의 주요 차이는 ISO-1 시토크롬 C의 C 말단 근처의 자유 시스테인 잔기의 존재 인 상태 상동 크게한다. 여기 실시 예에서, 정제는 강한 수용성 달성된다 양이온 교환 FPLC 그러나, 이러한 음이온 교환, 친 화성, 소수성 또는 크기 배제 크로마토 그래피와 같은 다른 형태의 FPLC 더 적용될 수있다. 단백질은 또한 관심 단백질의 시스테인 잔기 (여기서 시토크롬 C)는 푸이되도록하여이 단계에서 감소에서야 베드로 말레이 미드 링크 대상으로 바이...

바이오 콘쥬 게이션는 공유와 같은 염료, 약물 또는 고분자로 합성 분자 다른 또는 하나의 생체 분자를 연결하는 것을 포함한다. 단백질 바이오 콘쥬 게이션 방법은 현재 광범위하게 단백질로 만드는 형광 염료 라벨 1, 2에 이르기까지 응용 프로그램과 많은 화학, 생물학 및 나노 기술 연구 그룹에 사용된다 (항체) 3 (항체 약물 접합체 - ADC)는 -prodrugs 단백질 이량 체 4,5의 합성을 , 나노 의학 (8) 및 시스템 화학 (9)에 사용되는 자기 조립 단백질 폴리머 하이브리드 6,7에 이르기까지. 화학 반응의 특이성은 항상 중요하지 동안 표적 단백질의 활성 부위를 방해하지 않도록, 가장 기능적 단백질 bioconjugates위한 가장 중요하다 바이오 콘쥬 게이션을 위해 사용된다. 관심의 단백질에 ⅰ) 대상으로 드문 또는 고유 사이트 : 이상적인 바이오 콘쥬 게이션 반응은 다음과 같은 몇 가지 기준을 충족해야합니다ⅱ) ⅲ) 전개 단백질을 방지하기 위해 비 변성 조건에서 진행이 대상으로 선택하고 표적 단백질은 일반적으로 서브 밀리몰 농도에서만 사용할 수 있습니다로 ⅳ) 높은 산출을합니다. 말레이 미드 - 시스테인 마이클 부가이 모든 기준을 충족에 근접하고, 그 이유는 긴 bioconjugate 화학 (10)의 분야에서 특별한 지위를 주장하기위한 있습니다. ⅰ) 그 표면에 단 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 다수의 단백질이 유전자 정확한 pH에서 반응 시스테인 향해 높은 선택성 II)가 설계 될 수 있기 때문에, Ⅲ)는 수성 완충액 원활하게 진행하고, ⅳ) 매우 빨리이다 일부 경우 11 M 5000 -1 초 -1 초과보고 시스테인 - 함유 단백질 말레이 미드의 2 차 속도 상수. (12) 관심의 단백질이 유기의 작은 (≈ 5 ~ 10 %) 금액 견딜 수 제공 공동 용매, 거의 모든 말레이 미드 기능화 된 염료, 포lymer은 표면 또는 다른 단백질을 단백질에 결합 될 수있다. 또한, 말레이 미드는 높은 pH에서 다른 친핵체와 반응하는 경향이다 요오도 아세트 아미드,보다 단백질에 시스테인에 대한보다 구체적인이다; 및 이황화 교환 (13)을 방지하기 위해 산성 pH를 유지해야 이황화 활용형보다 안정적. 여기에서 우리는의 Ru (II) 기반 발색단 및 예로서, 산화 환원 단백질의 사이토 크롬 C의 반응을 사용하여 단일 시스테인 잔기를 함유하는 단백질의 말레이 미드 - 작용 분자의 결합을위한 일반적인 프로토콜을보고한다. 이 프로토콜은 접근 가능한 표면 시스테인 잔기 및 대응 말레이 미드 기능화 대상을 포함한 대부분의 다른 단백질에 동일하게 적용 가능하고, 그것을 또 다른 단백질, 형광 염료, 발색단 또는 합성 중합체 일 수.

<table><tbody><tr><td>인산 이수소 나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>71496</td><td></td></tr><tr><td>수산화 나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>71691</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>73575</td><td></td></tr><tr><td>시토크롬 c, saccaromyces cerevisiae</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>C2436</td><td></td></tr><tr><td>디티 오 트레이톨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>TSKgel SP-5PW</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Tosoh SP-5PW, 07161</td><td>3.3 ml 강력한 양이온 교환 컬럼</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15&nbsp;</td><td>Merck-Millipore</td><td>UFC900308</td><td>3.5 kDa 스핀 필터</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 미니 투석 장치</td><td>Thermo Scientific</td><td>66333</td><td>3.5 kDa 투석 cassetes</td></tr><tr><td>Ru(II) 비스터피리딘 말레이미드</td><td>Lab made</td><td></td><td>참조 참조 (14)</td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3396</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03609</td><td></td></tr><tr><td>트리스 (2- 카르 복시 에틸) 포스 핀 하이드로 클로라이드&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93284</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>니켈 아세테이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244066</td><td></td></tr><tr><td>AcroSep IMAC 하이퍼셀 컬럼</td><td></td><td>VWR을 통한 Pall: 569-1008</td><td>1ml IMAC 컬럼</td></tr><tr><td>0.2미크론 셀룰로오스 멤브레인 필터</td><td>Whatman</td><td>Z697958</td><td>완충액용 47mm 필터</td></tr><tr><td>0.2미크론 PVDF 멤브레인 필터</td><td>Merck-Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td>단백질 용 주사기 필터</td></tr><tr><td>염산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84426</td><td>부식성이 매우 뛰어납니다! 주의하십시오.</td></tr><tr><td>카페인산</td><td>시그마-알드리치</td><td>60018</td><td>MALDI 매트릭스</td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>91707</td><td>매우 부식성! 주의 사항</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC6060</td><td>Coomassie blue solution</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0342BOX</td><td>precast protein gels</td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC5925</td><td>premade protein ladder</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0008</td><td>사전 제작된 겔 시료</td></tr><tr><td>버퍼 NuPAGE 시료 환원제(10개)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0004</td><td>사전 제작된 겔 환원제</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS 러닝 버퍼(20개)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0002</td><td>사전 제작된 겔 러닝 버퍼</td></tr><tr><td>Voyager DE STR MALDI 반사판 TOF MS</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acta FPLC</td><td>GE</td><td></td><td>Fast Protein Liquid Chromatography</td></tr><tr><td>Cary 50 Bio Spectrophotometer</td><td>Varian-Agilent</td><td></td><td>UV-Vis</td></tr><tr><td>Milli-Q 초순수 디스펜서</td><td>Merck-Millipore</td><td></td><td>초순수</td></tr><tr><td>저용량 UV-Vis 큐벳</td><td>Hellma</td><td>105-201-15-40</td><td>100 마이크로리터 큐벳</td></tr></tbody></table>

단백질 bioconjugates의 합성<em&gt;를 통해</em&gt; 시스테인 - 말레이 미드 화학

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

형광 염료, 약물, 폴리머 및 기타 단백질에 대한 단백질의 화학적 연결 또는 생체 접합은 항체 약물 접합체(ADC) 및 나노 의학, 형광 현미경 및 시스템 화학의 개발과 같은 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다. 이러한 많은 응용 분야에서 사용되는 생체 접합 방법의 특이성은 주요 관심사입니다. 표적 단백질에 maleimides와 cysteine을 함께 Michael이 첨가하는 것은 매우 선택적이며 가벼운 조건에서 빠르게 진행되므로 단백질 생체 접합에 가장 널리 사용되는 방법 중 하나입니다.
여기에서 우리는 효모 사이토크롬 c에서 표면에 접근할 수 있는 유일한 시스테인 잔류물을 루테늄(II) 비스터피리딘 말레이미드로 변형한 것을 보여줍니다. 단백질 bioconjugation은 겔 전기영동에 의해 검증되고 분리된 단백질 물질의 27% 수율에서 수성 기반 고속 단백질 액체 크로마토그래피로 정제됩니다. 그런 다음 MALDI-TOF MS 및 UV-Vis를 사용한 구조 특성 분석을 사용하여 생체 접합이 성공적인지 확인합니다. 여기에 표시된 프로토콜은 단백질을 다른 단백질, 염료, 약물 또는 폴리머에 결합하는 다른 시스테인-말레이미드 결합에 쉽게 적용할 수 있습니다.

bioconjugates의 합성은 세 가지 주요 방법으로 확인 : 비행 질량 분석 (MALDI-TOF MS), 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동의 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 이온화 시간 및 자외선 - 가시 (UV-비스) 분광법,도 2에 나타낸 바와 같이, (3, 4). 첨부 된 작은 분자의 질량에 대응하는 질량의 증가, 및 미 반응 된 단백질의 부재의 Ru (II)을 성공적으로 공유 결합 (TPY) CYT (C) 및 bioconjugate 후속 정제 말레이 미드 (2)을 보여준다. bioconjugate의 조성을 유추 할 수있는 원료의 1 부가 스펙트럼 다음 bioconjugate의 자외선 - 가시 광선 스펙트럼 수율은 410 nm에서 및 예측 (1) 스펙트럼을 비교하여 흡광도를 산출 할 수있다. 위의 예에서, 수율은 FPLC 정수기 후 1...

이 프로토콜은 시약 정제 반응 조건 bioconjugate 정화 및 bioconjugate 특성화를 포함하여 말레이 미드로 단백질을 함유하는 시스테인의 바이오 콘쥬 게이션에 필요한 중요한 단계를 자세히.

단백질 Bioconjugates의 합성<em&gt;를 통해</em&gt; 시스테인 - 말레이 미드 화학

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

시스테인-말레이미드 화학을 통해 단백질 바이오컨쥬게이트를 합성하는 전반적인 목표는 단백질 내 수정 부위의 특이성을 확보하는 것입니다. 이는 결과적으로 항체-약물 접합체(antibody drug conjugates)와 같은 바이오컨쥬게이트의 활성에 영향을 미칩니다. 단백질의 구조나 기능에 관심이 있고 나노 의학, 형광 현미경 또는 시스템 화학 분야의 연구를 수행하고 있다면, 이 기술이 문제 해결에 도움이 될 것입니다.이 기술의 주요 장점은 다양한 조건 하에서 특이성이 높고 수율이 좋다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면, 12 mg의 동결 건조된 cytochrome C를 6 mL의 20 mM 인산염 완충액에 녹입니다. cytochrome C를 환원시키기 위해 갓 조제한 1 M DTT 용액 16 µL를 단백질 용액에 피펫으로 넣습니다. 용액을 혼합한 후, 크로마토그래피 매체에 주입하기 전 0.22 µm 저단백 결합 PBDF 시린지 필터로 여과합니다.다음으로 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)를 사용하여 환원된 조 cytochrome C 용액을 정제합니다. 강 양이온 교환 컬럼을 평형화한 후, 용액 1 mL를 기기의 인젝션 루프에 로드합니다. 그다음, 컬럼 부피의 5배에 걸쳐 328에서 450 mM NaCl까지의 그래디언트 방법을 시작합니다.UV viz 검출기의 280 및 410 nanometer 채널을 모니터링하고 가장 큰 피크를 수집하십시오. 이제 소금 농도를 1 molar로 높여 2 column volume 동안 흘려줌으로써 ISO2 cytochrome C를 용출하십시오. 컬럼을 세척한 후, 다음 조추출물 분획을 주입하기 전에 20 millimolar 인산염 완충액 2 column volume로 재평형화하십시오. 이때, 적절한 ruthenium maleimide complex 0.9 milligrams를 acetonitrile 600 microliters에 용해하십시오.TCEP 2.87 mg을 초순수 1 mL에 녹여 10 mM TCEP 용액을 준비합니다. 50 mL 플라스틱 튜브에 초순수 11.4 mL와 100 mM phosphate-EDTA 스톡 용액 3 mL를 혼합합니다. 그런 다음 phosphate-EDTA 용액에 정제된 cytochrome C 0.15 µmol을 첨가합니다.TCEP 스톡 용액 7.5 µL를 단백질 용액에 첨가합니다. 그리고 시스테인 산화로 인해 이량체화되었을 수 있는 단백질을 환원시

synthesis-of-protein-bioconjugates-via-cysteine-maleimide-chemistry

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연구

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Chemistry

화학

의 시스테인 잔류의 thiol 그룹의 용매 접근성을 분석하는...

시스테인 잔류 물을 용매 접근성에 대한 분석<em&gt; 옥수수 rayado fino 바이러스</em에서 생산&gt; 바이러스 같은 입자<em&gt; Nicotiana benthamiana</emVLPs에 펩티드의&gt; 식물과 교차 연결

페로센의 비대칭 종의 합성은 용액 기술을 사용하여 어렵습니다.  이 보고서는 고체상 합성을 통해 수행된 용이하고 깨끗한 반응을 사용하여 페로센-비오틴 생체접합체를 생성하기 위해 수행된 방법에 중점을 둡니다.  티올레이트 부분의 혼입은 금 표면에 고정화(immobilization)를 위한 능력을 부여하기 위해 보여진다.

고상 수지 기반의 방법론을 통해 비대칭 페로센 유래 바이오 복합체 시스템 용 합성 방법론

숙주 세포에 대한 박테리아 부착은 숙주 집락화 및 감염 과정에서 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 폴리머 결합 재조합 애착체의 생성을 생체 모방 물질로 설명하며, 이를 통해 다른 박테리아 요인과 독립적으로 이러한 과정에 대한 개별 애착체의 기여도를 분석할 수 있습니다.

박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료

당화 단백질의 생화학 및 구조 분석 균질 샘플 상대적으로 많은 양의 필요합니다. 여기, 우리는 효율적인 화학 반응 Cys thiols를 대상으로 박테리아에서 정화 하는 재조합 형 단백질의 사이트별 glycosylation 방법 제시.

재조합 형 단백질의 생체 외에서 사이트별 Glycosylation에 대 한 대상 시스테인 Thiols

우리 theranostic 나노 (HEVNP)으로 간염 E 바이러스 capsid 단백질을 설계 했습니다. HEVNP 자동으로 안정 된 icosahedral 점 막 배달에 조립. 여기, 시스테인, 특히 종양 세포를 묶는 합성 ligands 켤레를 표면 노출 잔류물을 변경 하 여 대상으로 하는 종양에 대 한 HEVNPs의 수정을 설명 합니다.

간염 E 바이러스 나노 화학 활용 방법을 사용 하 여의 표면 기능화

선물이 thioether/비닐의 건설에 대 한 프로토콜 황화 닿는 헬리컬 펩 티 드 사진 유도 thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation를 사용 하 여.

헬리컬 펩 티 드를 통해 사진 유도 Thiol-ene 또는 yne Hydrothiolation Thioether/비닐 황 화물-곁에 건설

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

시스테인 부유한 펩 티 드 그들의 이황화 연결에 따라 고유한 3 차원 구조로 접어. 개별 이황화가 성체의 타겟된 합성 필요한 때 버퍼 산화 원하는 이황화 연결 리드 하지 않습니다. 프로토콜 선택 합성 펩 티 드 3 이황화 결합 그리고 NMR 및 MS/MS를 사용 하 여 그들의 구조 분석을 다루고 있다.

합성 및 다른 아 황산 연결 된 μ-Conotoxin PIIIA이 성체의 구조 결정

이 프로토콜에서 포드는 phenyoxadiazolyl 메 틸 sulfone 기반 시 약 쓰이므로, 특히 항 체의 thiols 화물의 사이트 선택 첨부 파일에 대 한 종합을 설명 합니다. 또한, 합성 및 포드 베어링 bifunctional chelator 및 모델 항 체에의 활용의 설명 합니다.

합성 및 Bioconjugation의 Thiol 반응 시 약 사이트에 선택적으로의 창조에 대 한 수정 Immunoconjugates

여기에서, 우리는 통제된 순서로 단백질 중합체를 형성하는 효소에 의해 단백질 단량체를 융합하고 단 분자 힘 분광법 연구를 위한 표면에 그것을 고정화하는 프로토콜을 제시합니다.

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

학습하세요 시스테인-말레이미드 화학을 이용한 단백질 바이오컨쥬게이트 합성 방법을. 사이토크롬 C를 환원하고 FPLC로 정제한 후 루테늄 말레이미드와 반응시켜 고특이성 생체결합물을 제조합니다. 이 기술은 항체-약물 컨쥬게이트 및 형광 현미경 연구에 활용됩니다.

단백질 Bioconjugates의 합성

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