Name: 관류의 공간 측정, 고체 종양에 삽입 유체 압력과 리포좀 축적 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 배우세요 고체 종양에서 관류, 간질액 압력, 리포좀 축적의 공간적 매핑 방법을. 이 기술은 종양 미세환경 특성과 나노입자 분포를 공동 지역화하여 나노의학 연구에 활용됩니다.

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저자는 MDA-MB-231 세포를 배양하고 MDA-MB-231 이종이식을 이식하는 데 도움을 준 Javed Mahmood 박사와 CT-리포좀을 준비한 Linyu Fan에게 감사를 표합니다. Shawn Stapleton은 CIHR의 자연 과학 및 공학 연구 대학원 장학금 프로그램과 21세기 방사선 연구 우수성을 위한 Terry Fox Foundation 전략 이니셔티브(EIRR21)의 자금 지원에 감사드립니다. 이 연구는 Terry Fox New Frontiers Program(020005)과 Canadian Institutes of Health Research(102569)의 보조금으로 지원되었습니다.

모든 생체 실험은 대학 건강 네트워크 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 하였다. 1. 동물 모델 <ol><li> 함께 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린 - 스트렙토 마이신을 100 배 희석 DMEM에 5 × 106 개 MDA-MB-231 7 유방 선암종 종양 세포와 배양. </li><li> 수확 된 세포들은 0.05 % 트립신 EDTA 용액을 이용하여 80 %의 컨 플루 언트 할 ​​때. 3 ~ 5 분 후 DMEM의 3 배 부피의 트립신 EDTA를 중화. 세포의 15 μL 나누어지는을 가지고 혈구를 사용하여 계산합니다. 200 XG에서 5 분간 원심 분리로 펠렛 세포는 ml 당 10 × 106 세포의 농도로 HBS 재 정지. </li><li> 임플란트 피하 (SC) 각각 8 내지 12 주령의 암컷 SCID 마우스의 뒷다리에 1 × 106 (2) 세포 주입함으로써 종양 (N = 5). 주입을위한 표준 25 G 바늘을 사용합니다. </li><li> 모니터 t사우스 캐롤라이나 종양 볼륨&gt; 200mm 3 (약 7 ~ 9 일)에 도달하면 umor 성장하여 캘리퍼 (볼륨 = 0.5 ×의 길이 x 너비 2)는 측정을 시작합니다. </li></ol> 2. CT-리포좀의 제조 및 특성 <ol><li> 리포좀의 제조 <ol><li> 1,2- 디 팔미 토일 - SN 글리세로 -3- 포스 포 콜린 (DPPC), 콜레스테롤 (CH) 및 1,2- 디스 테아 SN 글리세로 -3- 포함 CT-지질 리포좀에 대한 성분 (200 밀리몰 / L)에 용해시키고 40 : 5 DPPC : CH : PEG2000-DSPE 55의 몰비로 70 ℃에서 무수 에탄올 -phosphoethanolamine-N - 폴리 (에틸렌 글리콜) 2000 (PEG2000-DSPE). </li><li> 70 ° C로 가열 유지하여 에탄올을 증발시키고, 그 용액에 CT 조영제 iohexol (요오드 300 ㎎ / ㎖)을 추가하도록 최종 지질 농도는 100 mm이다. </li><li> 자주 텍싱 4 시간 동안 70 ° C에서 솔루션을 유지합니다. </li><li> 샘플 5 팀을 돌출, 단일 층 소포를 얻으려면두 ES 내지 250 psi의 압력에서 200 nm의 기공 크기 막을 적층하고, 10 ㎖ 지질 압출기를 사용하여 400 psi에서 두 개의 적층 된 80 nm의 기공 크기는 막을 통해 5 회 다시 돌출. 각 압출 사이클의 처음에 압출기에 리포좀 10 ㎖를 피펫 각 압출 사이클 후의 멸균 튜브 또는 원추형 유리 바이알로 모은다. </li><li> 100 kDa의 분자량이 0.02 mM의 HEPES 완충 생리 식염수 (HBS, 산도 7.4)의 250 배 용량 초과에 대한 (MWC) 투석 가방을 잘라 사용하여 투석을 16 시간으로 취소 캡슐화 iohexol를 제거합니다. 예를 들어, 커에 백 바깥 HBS 250ml를 투석 백에 리포좀 용액 1 ㎖를 배치했다. </li><li> 제조자의 지시에 따라 75 nomical MWC 상업적 접선 흐름 방식을 이용한 CT-리포좀을 농축시킨다. 약 55 밀리그램 ml의 최종 농도 요오드 농축 -1. </li></ol></li><li> 리포좀 특성 <ol><li> ioxehol을 해제 한 다음 탈 이온수 100 배 체적 과량을 사용하여 희석 된 에탄올의 10 배 부피 초과 량을 사용하는 CT-리포좀 파열에 의해 밀봉 효율을 측정한다 (리포좀 즉, 10 ㎕의 100 에탄올 μL 후 희석을 이용하여 파열 10 ㎖의 최종 부피). </li><li> 245 nm의 파장에서 검출와 UV 분광계를 이용하여 농도를 결정 iohexol. 제의 양을 방출 iohexol 제의 비율 량을 고려하여 캡슐화 효율 계산은 제조시 첨가. </li><li> 제조자의 지시에 따라 동적 광산란 입도 분석기 시스템을 이용한 유체 역학적 직경 제타 전위를 측정한다. 측정을 용이하게하기 위해 탈 이온수 (최종 부피 1 ㎖의 리포솜 예 5 μL) 200X하여 CT-리포좀 용액을 희석. </li></ol></li></ol> 종양 미세과 CT-리포좀 3. CT 영상분포 참고 : 다른 소프트웨어 버전 또는 장비를 사용하는 경우 체적 검사를 수행하기위한 제조업체의 지침을 따르십시오. <ol><li> 의료 공기 또는 산소와 혼합 2 % 이소 플루 란을 사용하여 각 마우스를 마취하고 발가락을 곤란하게하고 어떤 반응을 관찰하지에 의해 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. 얇은 플라스틱 판에 발 테이핑하여 엎드린 자세 동물 고정시킨다. </li><li> 측면 꼬리 정맥에, PE10 튜브에 20cm에 연결된 사용자 지정 27 G 카테터를 삽입하고 테이프의 여러 조각 제자리에 고정합니다. </li><li> 중부 표준시 - 리포좀의 최소 200 μl를 포함하는 1 ML의 주사기를 준비합니다. 카테터를 세척 할 때 사용하는 식염수로 1 ML의 주사기를 준비합니다. (부피비 9 : 1) 마지막으로, 식염수와 혼합 자유 iohexol 적어도 150 μL와 함께 1 ml의 주사기를 준비한다. </li><li> 마이크로 CT 스캐너 침대에 발생하기 쉬운 마우스를 놓습니다. tumo을 배치 레이저 측위 시스템을 사용하여각 스캔에 대한 거의 같은 방향으로 연구. </li><li> 주사기 펌프에서 CT-리포좀 주사기를 놓고 주사기에 카테터를 연결합니다. 초 당 10 μL의 펌프 속도를 설정합니다. </li><li> CT 스캐너 콘솔 소프트웨어를 이용하여 명암 조정 스캔을 수행하여 시스템을 초기화한다. 관심의 각 영상 프로토콜에 대한 명암 스캔 옵션을 선택 드롭 다운 메뉴에서 명암을 선택하고 교정을 시작하려면 스캔 버튼을 누릅니다. </li><li> 어떤 조영제 주입하기 전에 종양 체적 해부학 마이크로 CT를 수행한다. 연동 장치가 해제 된 CT 스캐너의 안전을 보장하기 위해 CT 스캐너 콘솔 소프트웨어 표시 봐. 중부 표준시 스캐너 콘솔 선택 검사에서 80 kV의 70 mA의 관 전류의 X 선 에너지를 선택하고 시간이 16 초 이상 1,000 이미지 전망을 캡처합니다. 스캔을 시작하려면 스캔 버튼을 누릅니다. </li><li> 400 mg의 요오드 kg의 농도로 CT-리포좀 루스를 주입하기 위해 주사기 펌프를 사용하여-1. 약 150 μL (25 g을 마우스를 가정)의 볼륨을 주입하는 펌프를 설정합니다. 주입하는 펌프의 &#39;시작&#39;버튼을 누릅니다. 수동 주입 전체 에이전트 양을 보장하기 위해 (두 카테터의 체적)의 생리 식염수를 50 μL로 카테터를 플러싱 카테터 분명하다. </li><li> CT-리포좀의 주입 후 10 분을 기다린 후 3.5에 설명 된 것과 동일한 방법 및 설정을 사용하여 두 번째 해부 검사를 수행합니다. </li><li> 3.3에서 설명 된 것과 동일한 주입 속도 설정을 사용하여 (부피비 9 : 1) 식염수와 혼합 자유 iohexol 100 ㎕의 부피를 주입 주사기 펌프를 설정하여 DCE-CT 스캔을 수행. <ol><li> CT 스캐너 콘솔 획득 매 10 초에서 80 kV로, 90mA의 튜브 에너지의 X 선 에너지 설정을 사용하며, 처음 30 초 동안 416 화상 돌기 매 초를 캡처하고 그 다음 5 분 동적 주사를 선택할 . DCE-CT 데이터를 5 초를 캡처 한 다음 injectio에 시작 버튼을 누릅니다n 개의 펌프. </li><li> 는 DCE-CT 검사 후 체적 해부학 마이크로 CT 스캔을 수행합니다. </li></ol></li><li> 단계 3.5에 기재된 바와 같이 동일한 체적 CT 설정을 사용하여 CT-리포좀 48, 72 시간 포스트 분사 사이의 해부학 CT 영상 캡처. </li><li> GPU가 재건​​축 소프트웨어를 사용하여 해부 CT 및 DCE-CT 데이터를 재구성. <ol><li> 재건 소프트웨어로 이미지를로드합니다. 관심 영역을 선택 마우스를 사용하여 이미지를 통해 투자 수익 (ROI)을 그려 재구성한다. 재구성 된 군데의 저장 위치와 파일 이름을 설정하고 &#39;.MAT&#39;로 출력 파일 형식을 선택합니다. 참고 : 소프트웨어가 자동으로 해부학 적 검사를위한 0.153 X 0.153 X 0.153 mm 3에 복원 된 복셀 크기를 설정하고 DCE-CT 검사에 0.153 X 0.153 X 0.462 mm 3. &#39;재건을 시작&#39;버튼을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 을 계산 CT-리포솜의 주입 전 10 분간 주입 후 스캔을 사용하여혈장 부피 분율은 앞서 설명한 3. 또한, 이전에 7 바와 같이 간극 체적 분율을 계산하는 사전 주입 iohexol 5 분 후 분사 스캔을 사용한다. </li><li> 종양 체적 내에 ROI (region of interest)를 식별하는 기능을 제공하는 소프트웨어에 DCE-CT 데이터를 가져 시간 강도 곡선 (TICS)을 얻었다. 그 후 시간의 함수로서 ROI의 평균 CT 향상을 계산한다. 이 실험에서 사용자 지정 소프트웨어는 투자 수익 (ROI)을 식별하고 TIC를 계산하기 위해 개발되었다. </li><li> 두 구획 추적 운동 모델을 사용하여 측정 틱 피팅에 의해 관류 및 혈관 투과성의 정량적 추정치를 얻습니다. 피팅 DCE-CT 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하고, 두 구획 트레이서 동역학 모델에서 고정 된 파라미터로서 선험적 플라즈마 체적 분율의 추정 및 삽입 부피비를 사용할 수있다. 원형질의 선험적 추정치를 얻기 위해 이전에보고 된 방법을 사용하여a와 간질 볼륨 분수 14. </li></ol> 종양 간질 유체 압력 4. 공간 측정 <ol><li> IFP는 PE20 폴리에틸렌 튜브 50cm 통한 압력 변환기 및 상기 IFP 수집 시스템 25 G 척추 바늘을 연결 측정합니다. 헤파린 설페이트 / 식염수 (1시 10분)으로 시스템 전체를 세척. 사용하기 전에 70 % 이소 프로필과 바늘을 소독. </li><li> 획득 시스템의 전원을 켜고 IFP 수집 소프트웨어를 실행하고 mmHg로의 IFP 측정을 획득 할 수있는 시스템을 보정하기위한 설정 파일을로드합니다. 지속적으로 IFP 데이터를 수집하기 위해 취득 버튼을 클릭합니다. </li><li> 4.8에 기술 된 방법을 사용하여 리포좀 CT-48, 72 시간 포스트 분사 사이 IFP 측정 (이것은 종양의 CT-리포좀 피크 누적의 대략적인 시간에 상당)을 수행. 중부 표준시 - IFP 로봇에 IFP 바늘을 연결합니다. </li><li> 에 대한 좌표계를 정렬 교정 검사를 수행중부 표준시 - IFP 로봇과 CT 스캐너. 중부 표준시 - IFP 로봇에 기준 마커 첨부 파일을 추가하고 네 개의 다른 위치에 기준 마커와 네 메스 CT 스캔을 수행합니다. <ol><li> 은 CT-IFP 로봇 컨트롤러 소프트웨어를 실행 로봇을 초기화하고, X, Y, Z 대상 위치를 입력하고 &#39;이동&#39;버튼을 클릭하여 세 가지 위치로 로봇을 이동합니다. </li><li> 다음 X에서 CT 스캔을 가지고, Y는 Z 좌표 (1) 0,0,0; (2) -10,0,0 단계; (3) 0,7,0 단계; (4) 0,0,10합니다. 90 kV로, 10mA, 16 스캔을 시작하기 위해 CT 스캐너 소프트웨어를 눌러 &#39;시작&#39;을 사용하여 초 스캔을 선택합니다. 3.10에 기술 된 바와 같이 검사를 재구성. </li></ol></li><li> 중부 표준시 - IFP 로봇 정렬 소프트웨어를 실행합니다. 다음 &#39;열기&#39;클릭 &#39;등록 데이터&#39;영역에 들어있는 &#39;추가&#39;버튼을 클릭하고 4.3에서 얻은 네 재구성 등록 검사를 선택합니다. 주 : 기준 마커의 픽셀 위치가 자동으로 softwa에 입력됩니다레. <ol><li> &#39;계산 변환&#39;버튼을 클릭 한 다음 &#39;변환 적용&#39;버튼을 클릭합니다. 이것은 CT-IFP 로봇 좌표계 CT 스캐너 좌표계로 변환하는 데 사용되는 정렬 데이터를 생성한다. 보정이 완료되면 CT-IFP 로봇에 동물 플랫폼을 연결합니다. </li></ol></li><li> 의료 공기 또는 산소와 혼합 2 % 이소 플루 란을 사용하여 각 마우스를 마취하고 발가락을 곤란하게하고 어떤 반응을 관찰하지에 의해 확인합니다. CT-IFP 로봇 플랫폼 동물 고정화 종양의 CT-IFP 로봇 시스템에 액세스 할 수 있도록 마우스를 위치. 이 IFP 바늘 삽입 동안 이동하지 않도록 테이프를 사용하여 종양을 고정시킨다. </li><li> IFP 바늘을 삽입하기 전에 해부학 마이크로 CT 스캔을 수행합니다. 3.10에 기재된 단계를 사용하여 CT 데이터를 재구성한다. </li><li> 중부 표준시 - IFP 로봇 정렬 소프트웨어에 사전 바늘 삽입 CT 데이터를로드합니다. 종양을 시각화 할 수있는 창 레벨을 조정합니다. 일을 클릭모든 이미지에서 종양의 전자 림, 다음 두 번째 림 위치를 클릭합니다. 주 : 소프트웨어가 두 위치 사이의 직선을 따라 위치의 시리즈를 계산합니다. 는 X, Y 및 Z 참고 목록에서 5~8 균등 위치 일련의 좌표. </li><li> 삽입하기 전에 헤파린 생리 식염수와 바늘을 세척하여 IFP 시스템을 준비합니다. </li><li> 중부 표준시 - IFP 로봇 제어 소프트웨어에, X, Y, Z에 첫 번째 미리 결정된 바늘 위치를 입력하고 키를 누릅니다-이동 &#39;이동&#39;버튼을 원하는 위치로 로봇을 이동합니다. 조직에 바늘을 삽입하려면 &#39;삽입 바늘&#39;버튼을 클릭합니다. <ol><li> IFP 측정이 증가하고는 IFP 수집 소프트웨어에 값을-곤란 사전에 반환 지적 바늘이 IFP 바늘과 곤란과 PE20 튜브를 해제하여 조직 사이 좋은 유체 소통을 위해 삽입 한 후. 기준에 반환하지 않는 측정을 거부합니다. </li></ol></li><li> 취득삽입 된 바늘 해부학 CT 검사 후 조직에서 바늘을 철회하기 위해 CT-IFP 로봇 제어 소프트웨어의 &#39;후퇴 바늘&#39;버튼을 클릭합니다. IFP 값이 상기 바늘의 인출 후에 프리 바늘 삽입 값으로 복귀하지 않는 IFP 측정을 거부한다. 이 바늘은 측정 중에 걸려 수도 의미한다. 반복 4.8 각각의 바늘 위치에 대한 4.10 단계를. </li><li> 바늘 후 삽입 메스 CT 스캔에서 식별 된 종양 부피의 질량 중심 니들 포트 상대의 x, y, z 위치를 계산하여 종양 체적 내에서 바늘의 위치를​​ 결정한다. </li><li> 모든 측정이 완료된 후 자신의 케이지에 동물을 돌려줍니다. 무인 동물을두고 의식을 회복하고는 흉골 드러 누움을 유지 할 수 있습니다 때까지 그들을 관찰하는데주의를 기울여야하지 마십시오. </li></ol>

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여기에 제공된 이미지 기반의 측정 방법은 종양 미세 속성, IFP, 및 CT-리포좀 축적의 공간 분포의 결정을 할 수 있습니다. 이러한 속성에 관한 이전의 시도는 다수의 종양 함유 동물 걸쳐 대량 측정을 수행에 의존하기 때문에 일반적으로 나노 크기의 약물 전달 시스템 (15)에 대해 관찰 된 인트라 종양 축적 이질성을 담당 메커니즘을 밝히기 감도 부족했다. DCE-CT는 종양 미세 특성의 내 종양 변화를 측정 할 수있는 도구를 제공 메스 CT는 CT-리포솜 증착 동력학의 정확한 묘사를 제공하고, CT-IFP 로봇 시스템에 IFP의 공간 맵핑을 수행하기위한 도구를 제공한다 같은 동물. 또한, DCE-CT 영상이 연구 잠재적으로 임상 transl의 연구 결과를 임상 설정에서 종양의 혈류 역학을 측정하기위한 임상 승인 된 방법은테이블. 측정의 복잡성을 감안할 때, 강인 데이터 세트의 수집을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 요소가있다. 종양 미세의 DCE-CT 기반...

나노 입자 약물 전달 시스템의 종양 내 축적을 측정하면, 세포 독성 약물의 적절한 농도는 종양 내에서 달성되었는지 확인하기위한 중요한 도구를 제공 할 수있다. &quot;화상 수&quot;리포좀 시스템의 개발이 비 침습성 정량을 허용 생체 같은 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 한 광학 형광 2, 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 3 등의 영상 방식을 이용하여 약물 전달 비히클의 검출, (4) 및 자기 공명 영상 (MRI) 5. 이미징 약동학 및 리포좀 전달 시스템의 생체 분포를 결정하기 위해 나노 입자 축적 -6,7- 인 인터 피사체 내 종양 이질성의 정도를 나타 내기 위해 사용되었다. 그러나, 나노 입자의 영상은 혼자 자신의 가난한 축적 및 유통에 기여 생물학적 장벽을 식별하지 않습니다. 이 지식은 연구에 매우 중요합니다ational 더 효과적인 제제의 개발 및 전략을 내 종양 축적 (8)을 향상시킬 수 있습니다. 치료 전략이 향상된 나노 반송 구 결과 특정 생물학적 장벽을 변조하는데 적용될 수 있음을 증명하고있다. 또한, 나노 입자 제제는 특히 특정 생물학적 전송 배리어 (10)를 극복하기 위해 개발되었다. 두 시나리오에서, 생물학적 장벽 측정 적합한 나노 입자 약물 전달 전략의 사용을 유도하는데 사용될 수있다. 종양 미세과 높은 IFP 고체 종양 9,11 이러한 리포좀으로 나노 입자의 내 종양 축적의 두 가지 주요 결정 요인이 될 것으로 생각된다. 그러나 가난한 리포좀 축적에 기여할 수있는 다른 장벽은 조밀 한 세포 외 기질, 불 침투성 혈관, 고체 조직 압력 (12)을 포함한다. 이 장벽은 시공간에 관련방법 비정상적인 혈류 상승 간질 유체의 압력은 나노 입자의 초기 전달 및 혈관 외 유출 구동 두 가지 중요한 요인으로되고. 전술 한 바와 같이, 종양 미세 상승 IFP 및 리포좀 내 종양 축적 간의 관계를 확립하는 리포솜 촬상 데이터의 적절한 해석에 필수적이다. 여기서 정량 방법은 고형 종양에서 종양 미세 상승 IFP 및 나노 입자의 축적의 관계를 측정하는 것이 제시되어있다. 이것은 동적 콘트라스트 컴퓨터 단층 촬영을 개선하여 부피 CT 영상 종양 미세을 이용한 CT 리포좀 조영제 인트라 종양 분포 공동화 측정을 수행함으로써 달성하고, 영상 유도 로보트 침 위치 확인 시스템을 이용하여 종양 IFP는 불린다 중부 표준시 - IFP 로봇 13.

<table><tbody><tr><td>MDA-MB-231 전이성 유방 선암 종양 세포&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 개조 이글 매체(DMEM)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 페니실린-스트렙토마이신 100x 솔루션</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td><td>Avanti Lipids Inc., USA</td><td>850355P</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤 (CH)</td><td>Avanti Lipids Inc., 미국</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-폴리(에틸렌 글리콜) 2000 (DSPE-PEG2000)</td><td>Avanti Lipids Inc., 미국</td><td>880128P</td><td></td></tr><tr><td>Omnipaque (Iohexol) 요오드/ml 300 mg;</td><td>GE Healthcare, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>80 nm 기공 크기 Track-Etch 폴리카보네이트 막</td><td>Whatman Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 nm 기공 크기 Track-Etch 폴리카보네이트 막</td><td>Whatman Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 m Lipex Extruder&nbsp;</td><td>Nothern Lipids Inc, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>투석 백 분자량 차단(MWCO) of 8 kDa</td><td>Spectrum Labs, USA&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>750,000 nomical molecular weight cut off (NMWC) 접선 흐름 컬럼&nbsp;</td><td>MidGee 초여과 카트리지, GE Healthcare, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프&nbsp;</td><td>Watson Marlow Inc., 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV 분광계</td><td>Helios &gamma;, Spectronic Unicam,&nbsp; 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>90Plus 입자 크기 분석기&nbsp;</td><td>Brookhaven, Holtsville, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>eXplore Locus Ultra 마이크로 CT 시스템&nbsp;</td><td>GE Healthcare, CA</td><td></td><td>CT-Console Software</td></tr><tr><td>AxRecon GPU 기반 재구성</td>을 사용하여 조작&<td>nbsp; Acceleware Corp. CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 G 카테터 SURFLO 날개 주입 세트</td><td>Terumo 의료 제품, 미국</td><td>SV*27EL</td><td></td></tr><tr><td>PE20 폴리에틸렌 튜빙</td><td>Becton Dickinson, 미국</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>펜 팁 25 G &times; 3.5&prime; &프라임; Whitacre 척추 바늘&nbsp;</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>405140</td><td>IFP 바늘</td></tr><tr><td>P23XL&nbsp; 압력 변환기&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus, CA</td><td>P23XL</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 4/35, Bridge Amp, LabChart Pro 7.0</td><td>ADInstruments Pty Ltd., USA</td><td>PL3504, FE221</td><td>IFP 수집 시스템 및 수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot)</td><td>Parallax Innovations, CA</td><td></td><td>CT-IFP 로봇 제어 소프트웨어를 사용하여 조작</td></tr><tr><td>CT-IFP 로봇 정렬 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>사용자 정의 Matlab 소프트웨어</td></tr><tr><td>DCE-CT 분석 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>사용자 정의 Matlab 소프트웨어</td></tr><tr><td>Matlab 2013b</td><td>Mathworks, 미국</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

관류의 공간 측정, 고체 종양에 삽입 유체 압력과 리포좀 축적

Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

리포좀의 이종 종양 내 축적 효능의 중요한 결정 인자이다. 혼돈 종양 미세하고 IFP 상승 모두는 나노 리포좀 계 약물 전달 시스템의 이종 종양 내 분포에 연결된다. 본 연구에서 종양 미세 상승 IFP 및 나노 입자의 축적이 관계는 생체 내 실험을 통해 조사 하였다. 이것은 동적 전산화 단층 촬영 (DCE-CT) 강화 된 콘트라스트 및 종양 IFP 측정 마이크로 CT 스캐너에 접속 된 새로운 영상 유도 로보트 바늘 배치 시스템을 사용하여 사용하여 종양 미세 평가함으로써 수행 하였다. 리포솜의 종양 내 축적 안정적 조영제 iohexol (CT-리포좀)를 캡슐화하는 나노 입자 리포좀 제제의 CT 이미지 기반의 평가에 의해 결정 하였다. CT 영상에서의 공간 분포의 공동 지역화 허용종양 혈역학 유방암의 각각의 피하 이종 이식 마우스 모델에서 IFP 및 CT-축적 리포솜. 측정 관류 플라즈마 부피 분율은 리포솜의 종양 내 분포의 강한 매개체이다 발견되었다. 또한, 결과는 IFP 혈류를 변조를 통해 리포좀 분포 매개 간접적 인 역할을 제안한다.

상기 프로토콜은, 각각 91.8 ± 0.3 nm 내지 -45.5 ± 2.5 MV를, iohexol의 캡슐화 농도 CT-리포좀을 수득 리포솜 직경 55 밀리그램 mL의 -1의 제타 포텐셜을 의미한다.도 1a는 대표적인 DCE-CT 영상을 포함 결과 iohexol의 종양 내 축적의 시간 변화를 표시 체적 데이터의 시계열을 얻었다. 종양 내에서 ROI를 선택하면 관류, 혈관 투과성, 혈장 부피 분율 및 간극 체적 분율 (도 1b)의 추정치를 얻기 위해 탐침 운동의 모델링 방법을 이용하여 정량화 될 수있는 TIC를 산출한다. matlab에 (14)에 구현 된 비선형 곡선 피팅 루틴을 이용하여 본 연구에서 두 구획 트레이서 동역학 모델을 사용하고, 측정 TIC 맞추기. 동일한 크기의 관심의 여러 영역으로 종양 볼륨을 세분화하면 t의 정량화 가능그는 종양 체적 (도 ...

리포좀의 이질적인 종양 내 축적은 비정상적인 종양 미세환경과 관련이 있습니다. 여기에서는 영상 유도 로봇 시스템을 사용하여 관류 이미징 및 상승된 간질유체압(IFP)을 통해 종양 미세순환을 측정하는 방법을 제시합니다. 측정은 volumetric micro-CT 이미징을 사용하여 결정된 리포솜의 종양 내 축적과 비교됩니다.

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and ...

본 실험의 전체적인 목표는 나노치료제의 종양 내 축적을 종양 미세혈관 순환 및 상승된 간질액압(IFP)을 포함한 종양 미세환경의 특성과 연관 짓는 것입니다. 이 방법은 나노의약품에 관한 중요한 질문들에 답할 수 있게 해줍니다. 예를 들어, 종양 내부에서 나노입자의 불균일한 흡수를 유발하는 요인은 무엇인가와 같은 질문입니다.이 기술의 주요 장점은 종양 미세환경의 특성과 나노입자의 종양 내 분포를 동일 위치에서 공간적으로 매핑할 수 있다는 것입니다. 토펜지로 적절한 마취 수준을 확인한 후, 마우스의 눈에 연고를 바르고 얇은 플라스틱 판 위에 엎드린 자세로 동물의 사지를 테이프로 고정합니다. 다음으로, 20 cm 길이의 PE10 튜브와 연결된 맞춤형 27G 카테터를 꼬리 외측 정맥에 삽입하고 튜브를 여러 개의 테이프로 고정합니다.이제 1 mL 주사기에 최소 200 µL의 컴퓨터 단층촬영(CT) 리포좀을 채우고, 다른 1 mL 주사기에는 free iohexol과 식염수를 부피비 9:1로 혼합한 용액을 최소 150 µL 채웁니다. CT 리포좀 주사기를 주입 펌프에 장착하고 주사기에 카테터를 연결한 후, 펌프 속도를 10 µL/sec에 해당하는 600 µL/min으로 설정합니다. 그런 다음 마우스를 micro CT 스캐너 베드에 올리고 레이저 포지셔닝 시스템을 사용하여 각 스캔 시 동일한 방향이 되도록 종양의 위치를 조정합니다.관심 있는 각 영상 프로토콜에 대해 CT 스캐너 콘솔 소프트웨어를 사용하여 드롭다운 메뉴에서 bright dark를 선택하고 스캔 버튼을 클릭하여 보정을 시작하고 시스템을 초기화합니다. 조영제를 주입하기 전 종양의 체적 해부학적 micro CT를 얻으려면, 먼저 CT 스캐너 콘솔 소프트웨어 표시기를 확인하여 CT 스캐너 안전 인터록이 해제되었는지 확인하십시오. 그런 다음 x-ray 에너지는 80 kilovolts, 관전류는 70 milliamps를 사용하며 1, 000장의 영상 투영을 캡처하는 스캔을 선택하십시오.그 다음, 스캔을 시작합니다. 스캔이 완료되면, 펌프가 약 150 µL의 리포좀 용액을 주입하도록 설정하고 시작 버튼을 눌러 55 mg I/mL 농도의 CT 리포좀 볼루스를 주입합니다. 리포좀 제제가 전량 주입되었는지와 카테터 내부가 비워졌는지 확인하기 위해 50 µL의 식염수로 카테터를 수동으로 플러싱합니다.10분 후, 방금 시연한 것과 같이 종양의 두 번째 해부학적 스캔을 수행합니다. DCE-CT를 수행하려면, iohexol 용액이 담긴 주사기를 주사기 펌프에 장착하고 펌프가 동일한 주입 속도로 iohexol 100 µL를 주입하도록 설정하십시오. 이 주입량은 표준인 200 µL보다 높지만, 회복 과정 동안 동물을 모니터링하였으며 어떠한 이상 반응도 관찰되지 않았습니다.그런 다음, 방금 시연한 바와 같이 CT 스캐너 콘솔에서 80 kilovolts의 x-ray 에너지와 90 milliamps의 관전류를 사용하여 5분 동적 스캔을 선택합니다. 이 스캔은 처음 30초 동안 1초마다 416개의 영상 투영을 캡처하고, 이후 10초마다 416개의 영상 투영을 캡처합니다. 5초 동안 DCE-CT 데이터를 캡처한 후 주입 펌프를 시작하십시오. 스캔이 끝나면 세 번째 체적 해부학적 마이크로 CT 스캔을 수행합니다.48-70시간 후, 방금 시연한 것과 동일한 체적 설정을 사용하여 리포좀의 해부학적 CT 영상을 촬영합니다. IFP를 측정하려면, 종양이 고정되고 CT IFP 로봇 시스템이 접근할 수 있도록 동물을 CT IFP 로봇 플랫폼에 테이프로 고정합니다. 방금 시연한 방식대로 해부학적 마이크로 CT 스캔을 수행합니다.그런 다음 바늘 삽입 전 데이터를 CT IFP 로봇 정렬 소프트웨어에 로드하고, 윈도우 및 레벨을 조정하여 종양을 시각화합니다. 임의의 이미지에서 종양의 가장자리를 클릭한 다음, 종양의 인접한 측면에 있는 두 번째 가장자리 위치를 선택합니다. 소프트웨어는 두 지점 사이의 직선을 따라 일련의 위치를 계산합니다.그 다음, 목록에서 5~8개의 등간격 지점에 대한 X, Y, Z 좌표를 선택합니다. 이어서 IFP 시스템 바늘을 생리식염수 헤파린 용액으로 세척하고, 미리 결정된 첫 번째 바늘 위치를 CT IFP 로봇 제어 소프트웨어의 X, Y, Z 좌표 창에 입력합니다. 이동 버튼을 눌러 로봇을 원하는 위치로 이동시킵니다.그 다음, 각 바늘 위치 순서대로 바늘 삽입 버튼을 클릭하여 조직에 바늘을 삽입합니다. PE20 튜브를 집었다가 놓아 IFP 바늘과 조직 사이에 유체 소통이 원활한지 확인하고, IFP 획득 소프트웨어에서 IFP 측정값이 증가했다가 다시 핀칭 전 값으로 돌아오는지 관찰합니다. 마지막으로 바늘이 삽입된 상태에서 해부학적 CT 스캔을 수행하며, 스캔 종료 시 바늘 제거 버튼을 클릭하여 조직에서 바늘을 제거합니다.종양 내에서 관심 영역(ROI)을 선택하면 시간/강도 곡선을 얻을 수 있으며, 이를 통해 종양 내 특정 혈역학적 파라미터의 정량적 추정치를 산출할 수 있습니다. 종양 부피를 동일한 크기의 여러 관심 영역으로 분할하면, 종양 부피 내에서 이러한 파라미터들의 공간적 분포를 정량화할 수 있습니다. 주사 후 48시간 시점에서의 CT 리포좀 생체 분포 또한 관찰할 수 있습니다.보이는 바와 같이, 조영제는 여전히 혈관계에서 순환하고 있으며 비장과 간에서 상당한 섭취가 관찰됩니다. 이러한 CT 리포좀의 종양 내 축적은 불균일하며, 종양 조직의 중심부에 비해 주로 주변부에 축적되는 양상을 보입니다. 고해상도 마이크로 CT를 통해 바늘을 명확하게 식별할 수 있으며, 이를 통해 종양 부피 내 IFP 측정 위치를 공간적으로 국소화할 수 있습니다.혈류량(profusion)과 혈장 부피 분율(plasma volume fraction)의 공간적 공동 국소 측정 결과는 피하 종양 내 CT 리포좀의 축적과 유의미한 상관관계가 있음을 보여줍니다. 또한, 간질액압(IFP)의 방사형 분포는 다른 혈역학적 측정값들과 상관관계를 보이는데, 이는 종양 미세혈관 순환, IFP 및 리포좀의 종양 내 축적 사이에 복잡한 공간적/시간적 관계가 있음을 시사합니다. 이 절차를 수행할 때는 동물을 스캐너 베드에 단단히 고정하여 IFP 측정 간에 종양의 움직임을 최소화하는 것이 중요합니다.본 연구의 결과는 새로운 치료법 개발로 확장될 수 있습니다. 나노입자의 수송은 나노의학 기반의 효과적인 치료제를 구축하는 데 있어 핵심적인 첫 번째 단계입니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 종양 간질액 압력, 종양 미세순환 및 나노입자 분포를 공간적으로 매핑하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

spatial-measurements-perfusion-interstitial-fluid-pressure-liposomes

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

침입형 유체의 흐름은 고체 종양에서 상승되며 종양 세포 침공을 조절하실 수 있습니다. 여기에서 우리는 매트릭스에 포함된 세포에 침입형 유체 흐름을 적용한 다음 세포 침입에 미치는 영향을 측정할 수있는 기법을 설명합니다. 이 기술은 쉽게 다른 시스템을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

종양 세포 침략에 중간 유체 흐름의 효과를 측정하는 세 가지 차원 세포 배양 모델

본 연구에서보고 된 소설 프로토콜 결합에 의한 마우스의 단일 셀 해상도로 폐 metastases의 선택적 검출 할 수...

복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화<em&gt;에서 시츄</em폐 조직 및 X-걸의 착색의&gt; 재관류<em&gt; lacZ</em&gt; 태그 종양 세포

이 비디오는 이미지 유도 로봇 시스템을 사용하여 관류 이미징을 통해 종양 내 간질액 압력을 측정하는 기술에 대해 설명합니다. 측정은 고형 종양 내에서 리포좀의 종양 내 축적과 비교됩니다.

종양 간질유체 압력의 공간 측정: 간질유체 압력을 측정하는 방법

이 논문에서는 동적 조영 증강 형광 videomicroscopy를 사용하여 생체 내에서 종양의 미세 혈관을 분석하는 방법을 제시한다. 두 정량적 파라미터를 획득 하였다 : 기능성 종양 혈관을 반영 모세관 밀도 및 내피 벽 leakiness 반사 인덱스 누설.

형광 공 초점 Videomicroscopy를 사용하여 종양 혈관의 생체 내 이미징

폐쇄 흉부 폐폐 생체 내 현미경을 사용하여 자동화된 방식으로 쥐의 흉막 표면 전이에서 미세순환 혈류 속도를 측정하는 방법을 제시합니다. 이 모델은 설치류의 폐 전이에 대한 생리학적 연구를 수행하기 위한 광범위한 도구로 사용될 가능성이 있습니다.

쥐의 폐 전이의 미세 혈류 속도의 자동 측정

생체 내 이미징을 위한 형광단의 사용은 옵소니화, 빠른 제거, 낮은 검출 감도 및 숙주에 대한 세포 독성 효과로 인해 크게 제한될 수 있습니다. 필름 수화 및 압출에 의한 리포솜 내 형광단의 캡슐화는 형광 소멸 및 보호로 이어져 높은 검출 감도로 in vivo 이미징을 가능하게 합니다.

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질 생체 광학 이미징

이 프로토콜 셀 전용 형광 마커를 표현 하는 유전자 변형 생쥐의 intravital 영상을 설명 합니다. Intravital 이미징 생체 삽입형 윈도 통해 프로세스의 미세한 시각화는 가능한를 사용 하 여 고해상도 관측에 대 한 비-침략 적 방법을 제공 한다. 이 방법은 경도 과정 공부에 특히 유용 합니다.

Intravital 현미경 종양 관련 맥 관 구조를 사용 하 여 고급 등 유전자 변형 형광 생쥐 피부 집계 창 실

우리는 쥐에 있는 고분자량 (155 kDa) dextran의 정맥 주입을 사용하여 전이 (TMEM) 출입구 기능 및 암 세포 intravasation의 종양 미세 환경과 관련되었던 과도 혈관 투과성을 평가하기 위한 2개의 방법을 기술합니다. 방법은 살아있는 동물에 있는 활력 화상 진찰 및 면역 형광을 사용하여 고정된 조직 분석을 포함합니다.

세포 내 이미징 및 고정 조직 분석을 사용하여 암 세포 보급과 관련된 전이 의 종양 미세 환경 평가

이 프로토콜의 목표는 형광 표지된 리포솜을 합성하고 유세포 분석을 사용하여 세포 수준에서 리포솜의 생체 내 국소화를 식별하는 것입니다.

형광 염료 표지 리포솜의 In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake의 준비, 투여 및 평가

이 프로토콜은 생리학적으로 관련된 종양온어칩(tumor-on-a-chip) 모델을 제시하여 고처리량 기초 및 중개 인간 암 연구를 수행하고, 약물 스크리닝, 질병 모델링 및 로딩, 유지 관리 및 평가 절차에 대한 설명과 함께 맞춤형 의학 접근법을 발전시킵니다.

암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립

Intravital microscopy 결과의 번역은 조직에 대한 얕은 깊이 침투로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 여기에서는 직접적인 공간 상관 관계를 위해 생체 내 현미경 검사와 임상적으로 적용 가능한 이미징 양식(예: CT, MRI)을 함께 정합할 수 있는 등쪽 창 챔버 마우스 모델에 대해 설명하며, 이를 통해 생체 내 현미경 검사 결과의 임상 번역을 간소화할 수 있습니다.

중개 암 연구에서 생체 내 현미경 및 자기 공명 영상의 결합을 위한 Dorsal Skinfold Window Chamber 종양 마우스 모델

배우세요 고체 종양에서 관류, 간질액 압력, 리포좀 축적의 공간적 매핑 방법을. 이 기술은 종양 미세환경 특성과 나노입자 분포를 공동 지역화하여 나노의학 연구에 활용됩니다.

관류의 공간 측정, 고체 종양에 삽입 유체 압력과 리포좀 축적

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