관류의 공간 측정, 고체 종양에 삽입 유체 압력과 리포좀 축적

본 실험의 전체적인 목표는 나노치료제의 종양 내 축적을 종양 미세혈관 순환 및 상승된 간질액압(IFP)을 포함한 종양 미세환경의 특성과 연관 짓는 것입니다. 이 방법은 나노의약품에 관한 중요한 질문들에 답할 수 있게 해줍니다. 예를 들어, 종양 내부에서 나노입자의 불균일한 흡수를 유발하는 요인은 무엇인가와 같은 질문입니다.

이 기술의 주요 장점은 종양 미세환경의 특성과 나노입자의 종양 내 분포를 동일 위치에서 공간적으로 매핑할 수 있다는 것입니다. 토펜지로 적절한 마취 수준을 확인한 후, 마우스의 눈에 연고를 바르고 얇은 플라스틱 판 위에 엎드린 자세로 동물의 사지를 테이프로 고정합니다. 다음으로, 20 cm 길이의 PE10 튜브와 연결된 맞춤형 27G 카테터를 꼬리 외측 정맥에 삽입하고 튜브를 여러 개의 테이프로 고정합니다.

이제 1 mL 주사기에 최소 200 µL의 컴퓨터 단층촬영(CT) 리포좀을 채우고, 다른 1 mL 주사기에는 free iohexol과 식염수를 부피비 9:1로 혼합한 용액을 최소 150 µL 채웁니다. CT 리포좀 주사기를 주입 펌프에 장착하고 주사기에 카테터를 연결한 후, 펌프 속도를 10 µL/sec에 해당하는 600 µL/min으로 설정합니다. 그런 다음 마우스를 micro CT 스캐너 베드에 올리고 레이저 포지셔닝 시스템을 사용하여 각 스캔 시 동일한 방향이 되도록 종양의 위치를 조정합니다.

관심 있는 각 영상 프로토콜에 대해 CT 스캐너 콘솔 소프트웨어를 사용하여 드롭다운 메뉴에서 bright dark를 선택하고 스캔 버튼을 클릭하여 보정을 시작하고 시스템을 초기화합니다. 조영제를 주입하기 전 종양의 체적 해부학적 micro CT를 얻으려면, 먼저 CT 스캐너 콘솔 소프트웨어 표시기를 확인하여 CT 스캐너 안전 인터록이 해제되었는지 확인하십시오. 그런 다음 x-ray 에너지는 80 kilovolts, 관전류는 70 milliamps를 사용하며 1, 000장의 영상 투영을 캡처하는 스캔을 선택하십시오.

그 다음, 스캔을 시작합니다. 스캔이 완료되면, 펌프가 약 150 µL의 리포좀 용액을 주입하도록 설정하고 시작 버튼을 눌러 55 mg I/mL 농도의 CT 리포좀 볼루스를 주입합니다. 리포좀 제제가 전량 주입되었는지와 카테터 내부가 비워졌는지 확인하기 위해 50 µL의 식염수로 카테터를 수동으로 플러싱합니다.

10분 후, 방금 시연한 것과 같이 종양의 두 번째 해부학적 스캔을 수행합니다. DCE-CT를 수행하려면, iohexol 용액이 담긴 주사기를 주사기 펌프에 장착하고 펌프가 동일한 주입 속도로 iohexol 100 µL를 주입하도록 설정하십시오. 이 주입량은 표준인 200 µL보다 높지만, 회복 과정 동안 동물을 모니터링하였으며 어떠한 이상 반응도 관찰되지 않았습니다.

그런 다음, 방금 시연한 바와 같이 CT 스캐너 콘솔에서 80 kilovolts의 x-ray 에너지와 90 milliamps의 관전류를 사용하여 5분 동적 스캔을 선택합니다. 이 스캔은 처음 30초 동안 1초마다 416개의 영상 투영을 캡처하고, 이후 10초마다 416개의 영상 투영을 캡처합니다. 5초 동안 DCE-CT 데이터를 캡처한 후 주입 펌프를 시작하십시오. 스캔이 끝나면 세 번째 체적 해부학적 마이크로 CT 스캔을 수행합니다.

48-70시간 후, 방금 시연한 것과 동일한 체적 설정을 사용하여 리포좀의 해부학적 CT 영상을 촬영합니다. IFP를 측정하려면, 종양이 고정되고 CT IFP 로봇 시스템이 접근할 수 있도록 동물을 CT IFP 로봇 플랫폼에 테이프로 고정합니다. 방금 시연한 방식대로 해부학적 마이크로 CT 스캔을 수행합니다.

그런 다음 바늘 삽입 전 데이터를 CT IFP 로봇 정렬 소프트웨어에 로드하고, 윈도우 및 레벨을 조정하여 종양을 시각화합니다. 임의의 이미지에서 종양의 가장자리를 클릭한 다음, 종양의 인접한 측면에 있는 두 번째 가장자리 위치를 선택합니다. 소프트웨어는 두 지점 사이의 직선을 따라 일련의 위치를 계산합니다.

그 다음, 목록에서 5~8개의 등간격 지점에 대한 X, Y, Z 좌표를 선택합니다. 이어서 IFP 시스템 바늘을 생리식염수 헤파린 용액으로 세척하고, 미리 결정된 첫 번째 바늘 위치를 CT IFP 로봇 제어 소프트웨어의 X, Y, Z 좌표 창에 입력합니다. 이동 버튼을 눌러 로봇을 원하는 위치로 이동시킵니다.

그 다음, 각 바늘 위치 순서대로 바늘 삽입 버튼을 클릭하여 조직에 바늘을 삽입합니다. PE20 튜브를 집었다가 놓아 IFP 바늘과 조직 사이에 유체 소통이 원활한지 확인하고, IFP 획득 소프트웨어에서 IFP 측정값이 증가했다가 다시 핀칭 전 값으로 돌아오는지 관찰합니다. 마지막으로 바늘이 삽입된 상태에서 해부학적 CT 스캔을 수행하며, 스캔 종료 시 바늘 제거 버튼을 클릭하여 조직에서 바늘을 제거합니다.

종양 내에서 관심 영역(ROI)을 선택하면 시간/강도 곡선을 얻을 수 있으며, 이를 통해 종양 내 특정 혈역학적 파라미터의 정량적 추정치를 산출할 수 있습니다. 종양 부피를 동일한 크기의 여러 관심 영역으로 분할하면, 종양 부피 내에서 이러한 파라미터들의 공간적 분포를 정량화할 수 있습니다. 주사 후 48시간 시점에서의 CT 리포좀 생체 분포 또한 관찰할 수 있습니다.

보이는 바와 같이, 조영제는 여전히 혈관계에서 순환하고 있으며 비장과 간에서 상당한 섭취가 관찰됩니다. 이러한 CT 리포좀의 종양 내 축적은 불균일하며, 종양 조직의 중심부에 비해 주로 주변부에 축적되는 양상을 보입니다. 고해상도 마이크로 CT를 통해 바늘을 명확하게 식별할 수 있으며, 이를 통해 종양 부피 내 IFP 측정 위치를 공간적으로 국소화할 수 있습니다.

혈류량(profusion)과 혈장 부피 분율(plasma volume fraction)의 공간적 공동 국소 측정 결과는 피하 종양 내 CT 리포좀의 축적과 유의미한 상관관계가 있음을 보여줍니다. 또한, 간질액압(IFP)의 방사형 분포는 다른 혈역학적 측정값들과 상관관계를 보이는데, 이는 종양 미세혈관 순환, IFP 및 리포좀의 종양 내 축적 사이에 복잡한 공간적/시간적 관계가 있음을 시사합니다. 이 절차를 수행할 때는 동물을 스캐너 베드에 단단히 고정하여 IFP 측정 간에 종양의 움직임을 최소화하는 것이 중요합니다.

본 연구의 결과는 새로운 치료법 개발로 확장될 수 있습니다. 나노입자의 수송은 나노의학 기반의 효과적인 치료제를 구축하는 데 있어 핵심적인 첫 번째 단계입니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 종양 간질액 압력, 종양 미세순환 및 나노입자 분포를 공간적으로 매핑하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.