성인 쥐에서 본래 등쪽 뿌리 신경절에 패치 클램프 녹음

이 실험의 전반적인 목표는 온전한 등쪽 뿌리 신경절을 준비하는 방법을 소개하고 이 준비를 사용하여 패치 클램프 기록을 수행하는 것입니다. 이 방법은 진입하는 척추 신경 또는 배출되는 등쪽 뿌리를 자극하면서 손상되지 않은 등쪽 뿌리 신경절에서 단일 세포를 기록할 수 있습니다. 이 접근법은 통증에 대한 일차 감각 뉴런의 기여도를 연구할 때 특히 유용합니다.

이 기술의 주요 장점은 뉴런과 인접한 위성 신경교세포를 모두 유지한다는 것입니다. 따라서, 이 제제는 생체 내 상황에 더 가깝다. 이 절차에서는 쥐를 마취한 후 요추 부위를 면도합니다.

그런 다음 정중선을 따라 피부와 피하 조직을 절개합니다. 그 후, 미세한 골막 엘리베이터를 사용하여 L1에서 S2 수준의 척추 돌기에서 척추 주위 근육을 분리합니다. 다음으로, 가시돌기를 L1에서 S2로 자릅니다. 그 후, 약 L1 및 S1에서 노출된 척추를 두 번 가로 절단하고 척추 기둥의 이 부분을 일괄적으로 제거합니다.

그런 다음 차가운 aCSF에 2-3분 동안 빠르게 담급니다. 그 후, 제거 된 척추에서 혈액을 씻어 내고 척추를 차가운 aCSF와 함께 페트리 접시에 옮긴 다음 미세한 롱거를 사용하여 얇은 층을 제거합니다. 척수를 노출시키기 위해 마이크로 가위로 정중선을 따라 경막을 자릅니다.

다음으로, DRG가 있는 나머지 척추뼈를 차가운 aCSF로 채워진 두 번째 페트리 접시에 옮깁니다. 횡돌기 및 좌골 신경에 대한 상대적 위치를 기반으로 L4 및 L5 DRG를 식별합니다. 그런 다음 주변 결합 조직에서 DRG를 제거하고 신경근과 척추 신경을 DRG에 부착된 상태로 유지합니다.

그런 다음 추가 해부를 위해 DRG를 세 번째 페트리 접시로 옮깁니다. 등쪽 뿌리와 배쪽 뿌리가 DRG와 합류하는 구멍을 자르고 복부 뿌리를 분리합니다. 그런 다음 끝이 뭉툭한 집게를 사용하여 상부를 잡고 다른 가는 집게를 사용하여 상부에서 DRG를 굴립니다.

DRG에 부착된 상피신경을 최대한 많이 계속 제거합니다. 이제 DRG를 기록 챔버로 전송합니다. 신경근이 시작되는 DRG의 측면이 아래를 향하도록 합니다.

그런 다음 앵커로 DRG를 안정화합니다. 그런 다음 연동 펌프에 연결된 플라스틱 튜브를 통해 산소가 공급된 aCSF로 DRG를 관류하고 세포가 30분 동안 회복되도록 합니다. 30분 후 CCD 카메라를 통해 40배 배율로 IR-DIC 광학 장치에서 DRG 품질을 평가합니다.

두 개의 작은 직경의 고무 튜브를 통해 두 개의 1밀리리터 주사기를 피펫 홀더에 개별적으로 연결했습니다. 그런 다음 콜라겐 분해 효소로 채워진 유리 피펫 하나를 피펫 홀더 중 하나에 넣고 빈 유리 피펫을 다른 피펫 홀더 중 하나에 넣습니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 DRG 바로 위에 피펫을 배치합니다.

두 피펫의 끝을 서로 부드럽게 충돌시켜 피펫 팁의 구멍을 넓힙니다. 그런 다음 콜라겐 분해 효소로 채워진 피펫을 DRG 표면 가까이로 이동합니다. 플런저를 약 0.5 밀리리터 정도 변위시켜 홀더와 주사기를 연결하는 튜브를 통해 콜라겐 분해 효소가 들어있는 피펫에 잠시 양압을 가합니다.

10-15분 후 남아 있는 상피신경의 파편이 관찰되면 빈 피펫에 부드러운 음압을 가하여 파편을 빨아들입니다. 이러한 방식으로 뉴런과 주변 위성 신경교세포가 명확하게 노출되고 패치 기록이 준비됩니다. 이 절차에서는 열화를 방지하기 위해 전극 용액을 얼음 위에 놓습니다.

다음으로, 유리 패치 피펫에 여과된 세포 내 용액을 채웁니다. 그런 다음 피펫을 헤드 스테이지 피펫 홀더에 놓습니다. 피펫을 수조 용액에 넣기 전에 플런저를 약 1ml 정도 옮겨 5ml 주사기를 통해 피펫에 부드러운 양압을 가합니다.

그런 다음 증폭기에서 V-Clamp 모드를 선택하고 소프트웨어에서 멤브레인 테스트 인터페이스를 엽니다. 현미경 아래에서 피펫을 표적 뉴런 가까이로 이동합니다. 다음으로, 뉴런과 위성 신경교세포의 주변 층 사이의 공간이 갑자기 확대될 때까지 피펫에서 양압을 가하여 위성 신경교세포층을 횡단합니다.

그런 다음 뉴런에서 보조개가 관찰될 때까지 피펫을 뉴런 쪽으로 계속 움직입니다. 우리의 준비에서, 뉴런은 위성 신경교세포(glial cell)로 둘러싸여 있습니다. 따라서 신경교세포층을 관통하고 개별 뉴런에 도달하기 위해 기록 피펫은 높은 양압으로 유지됩니다.

그 후, 양압을 줄이십시오. 부드러운 흡입력으로 기가옴 밀봉을 달성하십시오. 전체 세포 기록 구성을 얻으려면 짧지만 강한 흡입을 통해 뉴런 세포막을 관통합니다.

또는 흡입이 적용되는 동안 증폭기에서 zap 기능을 사용하십시오. 전체 셀 모드가 설정되면 증폭기의 커패시턴스 및 저항 보상 노브를 돌려 전체 셀 커패시턴스와 직렬 저항을 보상합니다. 그런 다음 멤브레인 테스트 창을 닫습니다.

I-Clamp 모드 노브를 돌려 일반 모드 amp리퍼. 그런 다음 소프트웨어에서 프로토콜 열기를 클릭합니다. 유변베이스 측정을 위한 프로토콜을 선택 및 로드하고 기록을 클릭하여 기록을 시작합니다.

뉴런 흥분성을 검사하려면 100피코암프 단위로 등급이 매겨진 일련의 탈분극 전류를 주입하여 입력 저항과 유변염기를 측정합니다. 그런 다음 Open Protocol을 다시 클릭하고 멤브레인 임계값을 측정하기 위한 프로토콜을 선택합니다. 그런 다음 500밀리초의 탈분극 램프 전류를 뉴런에 주입합니다.

리간드 유도 전류를 기록하려면 피펫에 특정 작용제를 채웁니다. 피펫 내부에 기포가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 약물 분주 시스템에 연결된 피펫 홀더에 피펫을 놓습니다.

매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 뉴런의 15마이크로미터 이내로 이동합니다. 약물 투여 시스템 압력을 1PSI로 설정하고 지속 시간을 1초로 설정합니다. 그런 다음 녹음 모드를 전압 클램프로 전환하십시오.

약물 분주 시스템을 통해 간단히 압력을 가하여 약물 유도 전류를 기록합니다. 이 그림에서 유변염기는 DRG 뉴런에 일련의 전류를 주입하여 측정되었습니다. 활동 전위를 유도할 수 있는 가장 낮은 전류 강도는 화살표로 표시된 대로 유변성으로 정의됩니다.

이 뉴런의 유변 염기는 300 피코 암페어입니다. 멤브레인 임계값은 램프 전류를 주입하여 측정되었습니다. 전위는 활동 전위가 유발될 때의 막 임계값으로 정의됩니다.

이 뉴런의 막 임계값은 11.9밀리볼트입니다. 이 그림에서 전류는 글루타메이트 또는 AITC를 1초 동안 퍼프 도포에 의해 유도되었습니다. 두 작용제 모두 내부 전류를 유도하여 작은 DRG 뉴런에 글루타메이트 수용체와 TRPA-1 수용체가 존재함을 시사했습니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 상피신경을 제거하고 기록 피펫에 대한 높은 압력을 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 위성 신경교세포의 수용체 및 채널과 같은 추가 질문에 답하기 위해 위성 신경교세포에 대한 패치 클램프 기록을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 통증 분야의 연구자들이 통각(유해성)에 대한 배측근신경절의 기여를 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 전체 등쪽 뿌리 신경절을 준비하는 방법과 이 전체 등쪽 뿌리 신경절의 단일 세포에서 클램프를 패치하는 방법에 대해 잘 이해하게 될 것입니다.