다중 전극 배열에 나선 신경절 신경 이식편 문화 및 전기 생리학

우리는 뉴런 반응 프로파일을 연구하고 자극 매개변수를 최적화하기 위해 다중 전극 어레이에서 1차 쥐 나선 신경절 뉴런 외식재를 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 연구는 인공와우의 뉴런-전극 인터페이스를 개선하여 환자의 청력과 장치의 에너지 소비에 도움이

이 절차의 전반적인 목표는 다중 전극 어레이에서 청각 뉴런의 전기생리학적 활동을 배양하고 기록하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법은 청각 뉴런의 전기생리학적 특성과 전극 영역에 의한 자극을 특성화하는 것과 같은 청각 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 많은 청각 뉴런의 뉴런 활동을 세포 외 비침습적으로 동시에 기록할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 치료로 확장됩니다. 사실, 그들은 청각 장애 환자의 청력을 회복하기 위해 인공와우와 같은 보철물의 일렉트로뉴런 인터페이스를 구현하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 먼저 ECM 혼합물을 얼음에서 해동하여 ECM 코팅 용액을 준비합니다.

그런 다음 ECM 혼합물을 염기성 배양 배지에 1:10의 비율로 희석하여 얼음에 보관합니다. 층류 후드에 새로운 MEA를 넣으려면 70% 에탄올에 30초 동안 담그십시오. 그런 다음 증류수로 30초 동안 씻으십시오.

그런 다음 MEA를 30분 동안 건조시킵니다. MEA를 코팅하려면 차가운 200마이크로리터 피펫 팁으로 MEA 위에 50마이크로리터의 코팅 용액을 피펫팅합니다. 그런 다음 MEA를 실온에서 30분에서 1시간 동안 방치합니다.

그런 다음 코팅 용액을 제거하십시오. 10% FBS가 보충된 100마이크로리터의 배양 배지와 밀리리터 BDNF당 5나노그램을 추가하고 조직을 도금할 때까지 실온에 둡니다. 다음으로, 코팅된 MEA가 들어있는 페트리 접시를 큰 페트리 접시에 놓고 가습을 위해 PBS가 들어 있는 작은 페트리 접시를 추가합니다.

이 절차에서는 강아지의 머리를 70% 에탄올로 살균합니다. 그런 다음 시상선을 따라 피부와 두개골 사이의 연결을 끊습니다. 다음으로, 두개골을 시상식으로 자르고 뇌를 제거합니다.

그런 다음 두개골에서 측두골을 잘라 멸균된 얼음처럼 차가운 HBSS가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 해부 현미경으로 한 쌍의 미세한 집게를 사용하여 고막수포를 해부하고 내이를 분리합니다. 그런 다음 달팽이관의 뼈를 제거합니다.

다음으로, 나선신경절의 기저부와 SV를 겸자로 잡고 SV를 기저부에서 정점까지 천천히 풀어 나선인대와 SV를 함께 제거합니다. 나선형 신경절의 기저 부분과 코르티 기관을 겸자로 잡고 코르티 기관을 기저부에서 정점까지 천천히 풀어서 모디올러스의 나선형 신경절에서 코르티 기관을 분리합니다. 그런 다음 집게나 미세한 미세 해부 가위 또는 칼을 사용하여 나선형 신경절에서 측면 외곽을 자릅니다.

이제 나선형 신경절 외삽과 코르티 기관을 MEA로 옮깁니다. 그런 다음 전극 부위와 전극 부위에서 약 5mm 떨어진 코르티 기관 위에 SG 외식제를 놓습니다. 외식식물과 코르티 기관을 MEA에 배치하면서 조직 손상을 방지합니다.

그런 다음 MEA를 인큐베이터에 조심스럽게 넣고 섭씨 37도 및 5%CO2에서 배양합니다. 다음 날, 외식식물이 MEA에 부착되어 있는지 육안으로 검사합니다. 그런 다음 연속 5일 동안 매일 10% FBS 및 BDNF를 함유한 100마이크로리터의 배양 배지를 추가합니다.

6일째에 10%FBS를 함유한 배양 배지 2ml와 BDNF 밀리리터당 5나노그램을 추가하고 추가로 13일 동안 조직을 배양합니다. 18일간의 집단 배양 후, 실온에서 더 일찍 준비된 세포외 용액으로 MEA 배양을 세척합니다. 그런 다음 조직 조각으로 MEA 칩의 접점을 건조시키고 MEA 홀더에 MEA를 장착합니다.

마지막으로 녹음 설정에 MEA를 설치합니다. 그런 다음 300마이크로리터의 세포외 용액을 추가하고 기록하기 전에 시스템이 안정화될 때까지 10분 동안 기다립니다. 이제 모든 전극에서 2분 동안 자발적인 활동을 기록하고 활성 전극을 식별합니다.

그런 다음 자극에 반응하는 전극을 식별합니다. 자극 아티팩트를 배제하려면 동일한 전극에서 10회 자극합니다. 배양액이 10회 중 8회 이상 반응하면 전극 유도 자극에 대한 긍정적인 반응으로 간주할 수 있습니다.

배경 소음을 식별하려면 1마이크로몰 농도로 배양물에 TTX를 적용하여 전압 의존성 나트륨 채널을 차단한 다음 2분 동안 기록합니다. 다음은 자발적인 활동을 보여주는 63개의 전극 중 6개의 원본 기록 흔적이며, 이것은 스파이크 감지 후 6개의 전극에 대한 래스터 플롯입니다. 각 막대는 하나의 활동 전위를 나타냅니다.

이 래스터 플롯에는 모든 활성 전극이 포함됩니다. 활동은 2분 동안 63개의 전극에서 기록됩니다. 이 그림은 총 지속 시간이 80마이크로초이고 진폭이 80마이크로 암페어인 이위상 자극이 하나의 전극에서 배양 자극에 사용되었음을 보여줍니다.

원시 데이터 추적의 이 대표적인 예는 자극 후 반응이 없는 활동 전위를 보여줍니다. 그리고 다음은 전극 영역의 신경 범위를 시각화하기 위해 실험이 끝날 때 신경 세포 마커인 TUJ에 대해 면역 염색된 MEA의 나선형 신경절 배양입니다. 자극에 사용되는 전극은 녹색으로 표시되고 반응하는 전극은 빨간색으로 표시됩니다.

이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 50분 안에 완료할 수 있습니다. 이러한 방법은 나선신경절 뉴런 전기생리학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 뇌 또는 척수 배양과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 재료 과학 및 나노 기술 분야의 연구자들을 위한 길을 열고, 신경 세포 기록 및 자극 전극의 빠른 블롯 표면 수정

이 비디오를 시청한 후에는 다전극 어레이에 뉴런 이식을 배치하여 전기생리학적 활동을 배양하고 기록하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.