흐름 NK 세포의 기능을 모니터링 분석을 기반 세포 계측법

이 절차의 전반적인 목표는 유세포 분석 기반 분석을 사용하여 NK 세포 기능을 모니터링하는 것입니다. 자연살해세포는 다양한 바이러스 감염 및 악성 질환의 결과에 결정적인 역할을 합니다. NK 세포 기능을 더 잘 모니터링하기 위해 우리 연구실은 과학 연구와 임상 평가 모두에 사용할 수 있는 유세포 분석 기반 분석을 추가로 개발했습니다.

우리는 소아과 및 면역 결핍 환자에 사용하는 데 필수적인 작은 NK 세포 샘플 크기를 분석할 수 있도록 프로토콜을 최적화했습니다. 이 기술의 또 다른 장점은 전체 NK 세포 집단 내에서뿐만 아니라 다른 NK 세포 하위 집합에서도 NK 세포 기능을 측정할 수 있다는 것입니다. NK 세포를 분리하려면 먼저 적절한 양의 NK 세포 분리 칵테일 용액을 여러 번의 역전을 통해 환자로부터 6-10ml의 EDTA 말초 전혈과 혼합합니다.

다음으로, 실온에서 5분 동안 튜브 회전기에서 샘플을 추가로 균질화합니다. 그런 다음 멸균 상태에서 15분 동안 튜브를 자기 분리기에 넣고 튜브 라벨이 자석 뒤쪽을 향하도록 주의하여 분리 라인의 가시성을 높입니다. 분리가 끝나면 상등액을 새 15ml 튜브로 조심스럽게 옮기고 완전한 매체로 최종 부피를 최대 15ml까지 가져옵니다.

원심분리로 세포를 세척하고 펠릿을 1밀리리터의 새로운 완전 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 계수하고 부피를 완전한 배지에서 100마이크로리터당 4번째 NK 세포에 대해 10의 2배 농도 이상으로 조정합니다. 분리된 NK 세포를 자극하려면 먼저 최소 5회 피펫팅을 통해 부드럽게 혼합하고 100마이크로리터의 세포를 96웰 V-바닥 플레이트의 적절한 웰에 분취합니다.

불을 끄고 NK 세포의 각 웰에 항-CD107a 항체를 추가합니다. 그런 다음 K562 종양 세포의 분취액을 100 μl 부피당 4번째 세포에 최소 5회 피펫팅하여 2배 10씩 조심스럽게 혼합하고 100 μl의 종양 세포를 자극을 위해 계획된 각 웰로 이동합니다. 정밀한 피펫팅과 일대일 효과기 목표 비율의 준비는 NK 세포 기능의 정확한 평가를 위해 매우 중요합니다.

다음으로, IL-2 및 IL-15를 자극 웰에 추가하고 최소 5회 피펫팅하여 모든 웰을 혼합합니다. 빛으로부터 보호된 플레이트를 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 3시간 동안 배양합니다. 조명을 끈 상태에서 첫 1시간이 지난 후 조심스럽게 혼합하여 새로 준비된 단백질 수송 억제제 용액을 각 웰에 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.

배양이 끝나면 공동 배양을 조심스럽게 혼합하고 해당 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 원심분리를 위해 각 튜브에 1ml의 세척 완충액을 추가하고 시료당 99마이크로리터의 PBS와 1마이크로리터의 고정성 데드 셀 마커에 펠릿을 재현탁합니다. 볼텍싱(vortexing)으로 세포를 혼합한 다음 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 1ml의 세척 완충액으로 세포를 세척하고 펠릿을 84마이크로리터의 세척 완충액과 16마이크로리터의 적절한 세포 표면 항체 칵테일에 재현탁합니다. 볼텍싱으로 샘플을 혼합하고 섭씨 4도의 어둠 속에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 1ml의 세척 완충액으로 세포를 세척하고 펠릿을 100마이크로리터의 냉 고정 용액에 재현탁합니다.

소용돌이로 섞은 다음 어둠 속에서 섭씨 4도에서 10분 동안 혼합합니다. 이제 1ml의 세척 완충액으로 세포를 세척하고 펠릿을 90마이크로리터의 투과화 완충액에 다시 현탁시킵니다. 10마이크로리터의 적절한 세포 내 항체로 염색하고 와류로 혼합합니다.

섭씨 4도의 어둠 속에서 30분 후, 1ml의 신선한 투과 완충액으로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 400마이크로리터의 신선한 투과 완충액에 샘플을 재현탁합니다. 볼텍싱(vortexing)으로 잘 혼합하고 유세포 분석으로 분석할 때까지 세포를 얼음 위에 놓습니다.

가능한 한 빨리 모든 튜브를 유세포 분석기로 옮기고 데이터 수집을 시작하십시오. 여기에서는 전체 NK 세포 집단의 탈과립화와 사이토카인 및 케모카인 생산을 분석하기 위한 게이팅 전략과 세 가지 다른 NK 세포 subset을 설명합니다. 건강한 기증자의 자극되지 않은 NK 세포는 인터페론 감마나 MIP-1 베타를 생성하지 않았으며 표면에서 CD107a를 발현하지 않았습니다.

대조적으로, 종양세포와 사이토카인으로 자극된 NK 세포는 상당한 양의 세포 내 인터페론 감마 및 MIP-1 베타를 생성했으며, CD107a 세포 표면 발현에서 알 수 있듯이 종양 세포 상호 작용에 따른 탈과립화를 보인 세포의 20% 이상이 나타났습니다. 이 기술을 숙달하면 8시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 NK 세포와 K562 종양 세포의 도금을 정밀하게 하는 것이 중요합니다.

선택한 이펙터 목표 비율을 유지하려면 카운팅이 가능한 한 정확해야 합니다. 이 유연한 절차는 쉽게 수정할 수 있습니다. 예를 들어, PBMC 집단 내의 NK 세포를 분석하거나 다른 항체를 사용하여 다른 관심 마커를 확인할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 유세포 분석 기반 분석을 사용하여 NK 세포의 기능을 모니터링하기 위해 NK 세포를 정제, 자극 및 라벨링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인간 및 표적 세포를 대상으로 작업하는 것은 잠재적으로 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 개인 보호 장비 착용과 같은 안전 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.