모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

이 DNA 어셈블리 프로토콜의 전반적인 목표는 DNA 장치의 반복 가능하고 확장 가능한 자동화된 고처리량 생산을 가능하게 하는 것입니다. 이 작업은 높은 수준의 DNA 장치 설계를 기반으로 액체 처리기를 위한 피펫팅 지침을 생성할 수 있는 강력하고 사용자 친화적인 소프트웨어 워크플로우에 대한 필요성을 해결합니다. 이 기법의 주요 장점은 자동 반응 전처리가 반복 가능하고 확장 가능하며 수동 전처리에 비해 수작업 시간이 4%에 불과하다는 것입니다.

자동화 단계는 배우기 어려울 수 있고 실험적 방법과 계산 방법이 결합되어 있기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 이 연구를 위해 스크립트 생성을 자동화할 수 있는 소프트웨어 도구가 개발되었습니다. 웹 브라우저를 사용하여 MoCloAssembly로 이동합니다.

com을 작성하고 조합 DNA 장치 설계에 포함될 모든 DNA 부분에 대한 GenBank 파일을 업로드합니다. 모든 파일이 업로드되면 원하는 DNA 부분을 선택합니다. 파트 컬렉션과 개별 파트를 선택할 수 있습니다.

부품을 빈 캔버스로 드래그합니다. 각 부품에 대한 5개의 프라임 및 3개의 프라임 오버행이 일치하도록 DNA 파트를 정렬합니다. DNA 파트의 의도된 최종 순서로 파트 유형을 배치합니다.

페이지 오른쪽 하단의 assemble을 클릭합니다. 소프트웨어 도구는 BSA1 효소로 분해될 때 각 부품 측면에 있는 4개의 염기쌍 돌출부를 기반으로 하는 유효한 빌드 가능한 어셈블리만 생성합니다. 계획 탭으로 이동하여 도구에서 생성된 파일을 다운로드합니다.

이 파일에는 과학자들이 DNA 샘플과 반응에 필요한 시약을 준비할 수 있도록 사람이 읽을 수 있는 플레이트 맵, 액체 처리기를 위한 선택 목록 및 조립할 모든 DNA 장치를 위한 완전히 주석이 달린 GenBank 파일이 포함됩니다. modular DNA assembly를 시작하기 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 plasmid DNA를 준비합니다. 이 절차에서 가장 중요한 단일 단계는 도구에 의해 생성된 플레이트 맵을 사용하여 설정 플레이트와 시약 플레이트를 올바르게 모으는 것입니다.

조립 도구에 의해 생성된 PDF 파일의 플레이트 맵에 따라 희석된 각 DNA 부분의 표시된 부피를 풀 스커트 96웰 PCR 플레이트의 해당 웰에 놓습니다. 필요할 때까지 이 설정 플레이트를 얼음 위에 올려 놓습니다. 얼음 위에서 다음 성분이 포함된 반응 마스터 믹스를 준비합니다.

각 20 마이크로리터의 반응에 대해 2 마이크로리터의 0X T4 DNA 리가제 완충액, 0.5 마이크로리터의 T4 DNA 리가제 및 1 마이크로리터의 BSA1 효소를 추가합니다. 생성된 PDF의 시약 플레이트에 대한 플레이트 맵에 따라 효소 마스터 믹스를 새로운 full-skirted 96-well PCR 플레이트의 적절한 well에 분배합니다. 이 시약 플레이트를 얼음 위나 96웰 콜드 블록에 보관하십시오.

이 절차를 시작하려면 설정 플레이트와 시약 플레이트를 Liquid Handler의 데크에 놓습니다. 비어 있는 풀 스커트 96웰 PCR 플레이트를 포함합니다. 빈 플레이트는 반응이 조립되는 출력 플레이트가 됩니다.

준비된 각 샘플과 시약 플레이트의 인스턴스를 생성하여 액체 처리기 제어 소프트웨어를 준비하고, 라벨이 붙은 깨끗한 탈이온수 저수지를 포함하여 MoCloAssembly. com에서 생성된 플레이트 맵에 표시된 대로 정확하게 이름을 지정합니다. 제어 소프트웨어의 Worklist 명령을 사용하여 소프트웨어 도구에서 생성된 GWL 파일을 로드한 다음 첫 번째 명령에서 로드된 GWL 파일을 실행할 다른 Worklist 명령을 로드합니다.

컨트롤러 소프트웨어의 실행 명령을 사용하여 스크립트를 실행합니다. 로봇 액체 처리기가 스크립트 실행을 완료한 후 액체 처리기 데크에서 모든 플레이트를 제거합니다. 알루미늄 밀봉 필름으로 셋업 플레이트를 밀봉하고 영하 20도에서 보관하여 나머지 DNA를 저장합니다.

출력 플레이트를 접착 필름으로 밀봉하고 열 순환기 또는 열 블록에 넣고 다음 사이클 매개변수로 실행합니다.섭씨 37도에서 2시간, 섭씨 50도에서 5분, 섭씨 80도에서 10분, 섭씨 4도로 유지합니다. 멸균 상태를 유지하려면 이 절차를 화염 근처에서 수행해야 합니다.

얼음에 필요한 유능한 대장균 세포 분취량의 필요한 수를 해동합니다. 세포가 해동하는 동안 적절한 항생제가 함유된 LB 한천 플레이트를 준비합니다. IPTG와 X-GAL을 포함하는 마스터 믹스를 만듭니다.

마스터 믹스 100 마이크로 리터를 각 플레이트의 표면에 피펫으로 넣고 유리 구슬을 사용하여 플레이트를 균일하게 코팅합니다. 박테리아를 도금하기 전에 섭씨 37도에서 최소 15분 동안 플레이트를 배양합니다. 각 반응에 대해 10마이크로리터의 유능 세포를 얼음 위의 새로운 96웰 PCR 플레이트로 분주하여 형질전환 플레이트를 준비합니다.

output plate의 각 반응을 1-3 마이크로 리터의 형질 플레이트의 해당 well에 추가하고 5 분 동안 얼음에서 배양합니다. 접착 필름으로 형질전환판을 밀봉하고 열충격을 감쇄하여 섭씨 42도의 온도에서 30초 동안 가열합니다. 즉시 접시를 얼음 위에 2분 동안 놓습니다.

형질전환 플레이트의 동일한 웰에 150마이크로리터의 SOC 매체를 추가하고 접착 씰로 밀봉한 다음 섭씨 37도에서 900RPM으로 1시간 동안 진탕하면서 배양합니다. 1 시간 후, 이전에 준비된 LB 한천 플레이트에 변형 플레이트의 각 웰의 전체 내용물을 플레이트에 플레이트합니다. 유리 구슬을 사용하여 플레이트 표면을 고르게 코팅합니다.

밤새 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다. 변형 다음 날, 웰당 1.5ml의 LB 육수가 있는 하나 또는 여러 개의 96웰 딥 웰 배양 블록을 준비합니다. 멸균 이쑤시개를 사용하여 화염 근처에서 작업하여 변형된 반응의 각 LB 한천 플레이트에서 단일 흰색 콜로니를 선택하고 딥 웰 배양 블록을 접종합니다.

배양 블록을 가스 투과성 밀봉으로 밀봉하고 섭씨 37도에서 900RPM으로 밤새 진탕하면서 배양합니다. 그런 다음 시판되는 키트를 사용하여 박테리아 배양에서 혈장 DNA를 분리하고 클론을 검증하기 위해 Sanger 염기서열분석을 제출합니다. 반응 조립 시간은 세 가지 방식 모두에서 비교되었습니다.

수동 조립에는 2시간 10분이 걸렸으며, 모두 직접 조립하는 데 시간이 걸렸습니다. Liquid Handler는 피펫팅 명령을 실행하는 데 비슷한 시간이 걸렸지만 그 시간 중 5분만 직접 진행했습니다. 음향 디스펜서는 액체 이송을 실행하는 데 걸리는 시간이 현저히 짧았으며 수작업 시간도 최소화되었습니다.

이 그래프는 각 조립 방법에 대한 반응당 비용을 보여줍니다. 이 비용에는 사용된 효소 및 피펫 팁의 가격이 포함됩니다. 96개의 수동 및 액체 처리기 세트 중 95%에 대해 올바른 시퀀스를 얻었습니다.

전체 96개 어셈블리 중 12개만 음향 디스펜서가 준비한 샘플에서 변형되었으며 83%가 정확했습니다. 두 번의 반응에서 흰색 콜로니가 생성되지 않았는데, 이는 output plate에서 DNA와 enzyme master mix 방울의 불충분한 혼합으로 인한 것으로 보입니다. 총 콜로니 수에 대한 흰색 콜로니의 비율로 측정된 클로닝 반응 효율의 비교는 수동 조립 및 액체 핸들러 조립 반응에 대해 유사한 백분율을 보여줍니다.

연구자들은 이 도구를 사용하여 액체 처리 로봇을 활용하여 조합 DNA 라이브러리를 구성할 수 있습니다. 이 방법은 반복 가능하고 확장 가능하며 귀중한 연구자 시간을 절약하고 인간이 반복적이고 복잡한 피펫팅 작업을 수행할 때 발생하는 피펫팅 오류 가능성을 줄입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 당사의 온라인 도구를 사용하여 모듈식 클로닝 반응을 위한 조합 어셈블리를 생성하는 방법과 액체 취급 로봇에서 생성된 두 개의 피펫팅 스크립트를 실행하는 방법을 알게 될 것입니다.

우리는 액체 처리 로봇을 사용한 자동화된 DNA 조립을 미래의 합성생물학 실험실의 한 단계일 뿐이라고 생각합니다. 설계 복잡성이 증가함에 따라 이와 같은 접근 방식이 점점 더 보편화될 것으로 예상되며 이 프로세스의 첫 번째 단계를 대표하게 되어 기쁩니다.