콜론-26 암 종양 베어링 암 악액질의 연구를위한 모델로 마우스를

이 프로토콜의 전반적인 목표는 재현 가능한 장원에서 Colon 26 In Vivo 모델을 실행하고 종양 성장과 관련하여 발생하는 진행성 근육 소모 및 약화를 적절하게 조사하는 것입니다. 이 모델은 종양으로 인한 근육 손실, 근육 약화, 근육 이화작용 증가 및 과염증성 사이토카인 수치에 대한 암 악액질 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 실험 모델의 주요 장점은 변화가 악액질 표현형과 일치하며, 낭비 심각도가 증가함에 따라 시간 종속 장원에서 쉽게 시작할 수 있다는 것입니다.

제 연구실의 기술자인 라파엘 바레토(Rafael Barreto)와 테레사 짐머(Teresa Zimmer) 그룹의 박사 과정 학생인 조셉 루퍼트(Joseph Rupert)가 이러한 절차를 시연할 것입니다. C 26 종양을 이식하려면 멸균 1 밀리미터 인슐린 주사기를 사용하여 26 게이지 바늘이 장착되어 개인, 성인, CD 2 F 1 마우스의 지방 패드에 피하 및 견갑 간 10을 신속하게 주입합니다. 종양 주사 후 동물을 우리로 되돌려 놓고 모니터링합니다.

생쥐를 확인하고 매일 체중을 기록합니다. 대조군 동물에 비해 종양 숙주의 체중 감소가 초기 체중에 비해 5, 10 또는 15%에 도달하면 심장 천자로 1-1점 5ml의 혈액을 뽑고 개별 혈액 샘플을 빈 18mg 칼륨 EDTA 튜브로 옮깁니다. 혈액이 모두 채취될 때까지 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

그런 다음 샘플을 원심분리하여 원심분리가 끝날 때 혈장과 혈청을 수집합니다. 추가 오염을 방지하려면 전신에 70% 에탄올을 분사하십시오. 그런 다음 동물을 누운 자세로 해부 침대에 눕히고 뒷다리 하나를 높은 뷰렛 클램프에 부착하여 팔다리를 수직으로 확장합니다.

뒤몽 집게를 사용하여 뒷다리의 표재성 피부를 잡고 구부러진 가위를 사용하여 피부와 근막을 부드럽게 제거하여 하지 밑에 있는 근육 배를 노출시킵니다. 후퇴골의 비복근(gastrocnemius muscle)은 대퇴골 후방(posterior femur)의 외측 및 내측 과두(lateral condyles)에서 시작하고, 종골 힘줄(calcaneal tendon)인 종골 바이알(tial the calcaneal tendon)에 삽입되어 있습니다. 겸자를 사용하여 비복근의 말단부를 잡고 근육 배를 원점 쪽으로 당깁니다.

그런 다음 가위를 사용하여 대퇴골에 최대한 가깝게 근육의 원점을 자르고 근육을 미리 계량된 접시에 옮깁니다. 접시의 무게를 즉시 측정하고 근육을 미리 라벨링된 극저온 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 경골의 전외측 표면에서 원점으로 된 경골 전방근과 원위 힘줄을 통해 내측 설형형에서 삽입되는 경골 전방근을 확인합니다.

그런 다음 검지와 엄지로 발을 손가락으로 잡고 경골의 표재성 원위 힘줄 바로 아래에 Dumont 겸자 끝을 삽입합니다. 뭉툭한 쪽을 사용하여 경골 근육 배를 밑에 있는 결합 조직에서 분리할 수 있도록 집게를 움직이고 가늘게 구부러진 가위를 사용하여 원위 힘줄을 자릅니다. 그런 다음 경골에 최대한 가깝게 원점 근육을 자릅니다.

모든 근육이 모이면 이소펜탄이 들어 있는 50ml 플라스틱 비커의 아래쪽 절반을 액체 질소에 담그십시오. 이소펜탄이 약간 점성이 생기고 비커 내부에 단단한 흰색 라미네이트 라이닝이 보이면 척에 매립 매체 몇 방울을 붓습니다. 그런 다음 힘줄로 근육을 잡고 신선한 근육의 끝을 임베딩 매체 위에 조심스럽게 놓습니다.

코르크를 기준으로 수직으로 잡습니다. 그런 다음 근육을 수직으로 유지하면서 조직이 완전히 얼 때까지 7-15초 동안 척과 부착된 근육을 이소펜탄 수조에 담그십시오. 잘 얼린 표본은 백악질 흰색으로 나타납니다.

그런 다음 근육을 표본 튜브에 넣어 섭씨 영하 80도에서 즉시 보관합니다. RNA와 효소 구조 및 경골 샘플을 보존하려면 추출 후 가능한 한 빨리 근육 조직을 동결해야 합니다. 얼어붙은 근육 조직을 절편하려면 먼저 저온 유지 장치 내부 챔버의 작동 온도를 섭씨 영하 23도로 설정하십시오.

섭씨 80도의 음의 표본이 몇 시간 동안 작동 온도에 적응하도록 합니다. 그런 다음 장착 축에 수직인 근육의 중간 배 부위에서 표본의 8미크론 두께의 여러 부분을 얻습니다. 실온 유리 슬라이드의 단면을 절단할 때 수집합니다.

모든 섹션이 수집될 때까지 샘플을 저온 유지 챔버 내부에 보관하십시오. 그런 다음 추가 분석이 있을 때까지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. C 26 종양 성장 동역학은 주입 후 처음 7-8일 동안 지연 단계를 보여주고, 그 후 4-5일 동안 기하급수적인 세포 성장을 보여줍니다.

종양 질량은 결국 동물 체중의 약 10%에 도달합니다. 종양이 있는 마우스는 낭비된 것처럼 보이며 실험 기간이 끝날 때 흐트러진 털을 나타냅니다. 골격근 무게의 20-30% 감소.

심장 근육의 무게도 크게 줄어듭니다. 다른 근육에 비해 그 정도는 덜하지만. 흥미롭게도, 간비대와 비장비대는 일반적으로 종양 숙주에서도 검출됩니다.

골격근 질량과 유사한 지방 질량은 심각하게 고갈됩니다. 골격근의 체중 감소는 또한 근섬유 크기의 감소와 일치하며 그에 비례합니다. 근육 섬유 단면적의 면역 형광 형태 측정 평가에 의해 관찰된 바와 같이.

특히, 빈도 분포 분석은 C 26 베어링 마우스에서 더 작은 크기의 섬유로의 이동을 보여줍니다. C 26 종양이 있는 경우 전체 근육이 위축된다는 것을 시사합니다. HNE 분석에서도 유사한 결과를 관찰할 수 있습니다.

비록 암 성장과 관련된 근육 단면적의 변화 정도는 약간 다르지만. C 26 모델을 적절하게 사용하면 종양 유래 악액질을 조사할 수 있습니다. 이 모델은 근육 섬유의 위축, 염증 및 과잉 이화작용뿐만 아니라 전반적인 질량 감소를 보여주는 인간 질병과 매우 유사합니다.

이 실험을 수행할 때, 6마리의 마우스의 변형률, 종양 세포의 출처 및 수, 이식 부위를 수정할 수 있습니다. 이러한 수정으로 인해 예상 결과가 달라질 수 있습니다. 비생리학적 성장 환경, IL six 작용에 대한 의존성, CD two F one 또는 Valve C 마우스의 필요한 사용과 같은 몇 가지 알려진 한계에도 불구하고 C 26 모델은 암 유발 악액질의 분자 메커니즘을 이해하는 데 크게 기여했습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 종양 발달과 동시에 일반적으로 발생하는 진행성 근육 소모 및 약화를 연구하기 위해 C 26 암 악액질 모델을 복제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. C 26 모델로 작업하려면 적절한 동물 취급 기술에 익숙해져야 합니다. 이 프로토콜을 가능한 한 인도적으로 실행하기 위해 항상 모범 사례를 사용해야 합니다.