단핵구 단층 분석의 사용은 Fcγ 수용체 - 매개 식균 작용을 평가하기

이 in vitro 기능 분석의 전반적인 목표는 FC 매개 식세포작용의 다양한 측면을 평가하는 것입니다. 이 방법은 적혈구에 대한 자가항체 및 동종항체의 임상적 중요성과 같은 면역혈액학 및 수혈 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 적혈구에 대해 미리 형성된 항체를 가진 환자에서 수혈 결과를 예측하기 위해 시험관내에서 수행할 수 있는 기능적 생물학적 분석을 제공합니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Cindy Tong입니다. 이제 사람의 혈액으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 보호 가운과 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 정맥 천자에 의해 산성 시트르산염 포도당이 포함된 액포 튜브에 담긴 건강한 기증자로부터 1-2개의 10밀리리터 전혈 샘플을 채취한 후, 튜브를 클래스 II 생물 안전 캐비닛에 넣고 혈액을 따뜻하고 완전한 배지에서 1:1 비율로 희석합니다.

다음으로, 원심분리기 튜브의 측면을 따라 혈액 세포를 실온 밀도 구배에 따라 천천히 피펫으로 피펫하고 층이 섞이지 않도록 주의합니다. 원심분리로 세포를 분리합니다. 그런 다음 상단 플라즈마 층을 버리고 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 버피 코트가 포함된 PBMC를 새 15ml 튜브로 옮깁니다.

분리된 PBMC를 PBS에서 3회 세척하고 3차 원심분리 후 3-7ml의 배지에 세포를 재현탁시킵니다. 계수 후, 완전한 배지에서 1.75 곱하기 10에서 밀리리터 농도 당 6 번째 세포로 세포를 희석하고 400 마이크로 리터의 세포를 8 챔버 슬라이드의 각 웰에 파종하여 섭씨 37도 및 전체 습도에서 5 % CO2에서 1 시간 배양합니다. R2R2 적혈구를 옵소니화하려면 먼저 PBS에서 적혈구를 세 번 씻습니다.

세 번째 원심분리 후 R2R2 펠릿을 인간 혈청의 다클론 항-D 항체와 1:1 비율로 희석하여 간헐적 혼합으로 섭씨 37도에서 1시간 배양합니다. 옵소니제이션이 끝나면 인큐베이터에서 세포를 제거한 다음 방금 시연한 것처럼 PBS에서 세 번 더 세척합니다. 펠릿을 완전한 RPMI 배지에서 1.25% 부피 대 부피로 재현탁합니다.

다음으로, 8 챔버 슬라이드의 각 웰의 상등액을 섭씨 37도에서 2 시간 동안 400 마이크로 리터의 옵소니 화 된 R2R2 셀로 교체합니다. 배양이 끝나면 슬라이드 어댑터를 사용하여 챔버를 제거하고 여분의 R2R2를 종이 타월로 두드립니다. 이제 100ml 비커에 PBS를 채우고 각 슬라이드를 소금 용액에 30-40회 천천히 담그어 비식세포작용된 R2R2의 대부분을 제거합니다.

건조 후 슬라이드를 100% 메탄올에 45초 동안 고정하고 커버슬립으로 샘플을 장착하기 전에 셀을 건조시킵니다. 다음 날, 각 슬라이드를 40X 대물렌즈가 장착된 위상차 현미경에 로드하고 각 손에 있는 하나의 카운터를 사용하여 최소 200개의 단핵구와 각 단핵구 내의 식세포작용된 R2R2 수를 수동으로 계수하여 단핵구의 수와 샘플당 식세포작용된 R2R2 세포의 수를 동시에 정량화합니다. 정맥 면역글로불린은 용량에 따라 식세포작용을 억제하는 FC 수용체에 결합하고 차단하며, 밀리리터당 200마이크로그램 농도의 정맥 면역글로불린에서 시작하여 거의 100% 억제가 관찰되고 억제제의 0.5마이크로그램 미만의 농도에서는 거의 억제가 관찰되지 않습니다.

식세포 지수가 R2R2 양성 대조군으로 0% 억제로 정규화되면 밀리리터당 3마이크로그램의 IC 50을 갖는 억제 곡선을 결정할 수 있습니다. 경험을 바탕으로 위상차 현미경 검사를 사용하여 단핵구를 오염시키는 적혈구와 액포를 식세포작용한 적혈구와 구별할 수 있습니다. R2R2 적혈구의 과잉 옵소니제이션(opsonization)뿐만 아니라 정량화 과정에서 조밀한 세포 클러스터와 파편을 피해야 하며, 이는 단핵구 내부를 과도하게 채우고 정확한 식세포 분석을 방해하는 높은 식세포작용(phagocytosis)을 유발할 수 있습니다.

이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행한다면 6-8시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 컨포칼 현미경을 사용한 면역세포화학 또는 면역형광과 같은 다른 방법을 수행하여 식세포 단백질 발현, 적혈구 상호 작용 및 구획화에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 초기 개발 및 추가 최적화를 통해 이 기술은 수혈 의학 및 세포 생물학 분야의 연구자들이 옵소니제이션 시스템을 탐구하는 방식에 정보를 제공할 것입니다.

이 동영상을 시청한 후에는 식세포작용을 유발하는 항체 상호 작용 유형을 평가하기 위해 단핵구 단층 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.