Name: 단핵구 단층 분석의 사용은 Fcγ 수용체 - 매개 식균 작용을 평가하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 배우세요 단핵구 단층 분석법을 활용한 Fcγ 수용체 매개 식균 작용 평가 방법을. 이 기술은 수혈의학 및 면역혈액학 연구에서 항체 상호작용을 분석하고 수혈 결과를 예측하는 데 활용됩니다.

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저자는 T.N.T.에 대학원 펠로우십 프로그램 상을 준 캐나다 혈액 서비스(Canadian Blood Services)에 감사를 표합니다. 이 연구는 캐나다 혈액 서비스(Canadian Blood Services)의 혁신 센터(Centre for Innovation)로부터 재정 지원을 받았으며, 이 센터는 연방 정부(Health Canada)와 주정부 및 준주 보건부의 자금 지원을 받았습니다. 여기에 있는 견해는 캐나다 연방, 주 또는 준주 정부의 견해를 반영하지 않습니다.

연구 윤리 보드 / 기관 검토위원회에 의해 인간의 샘플의 사용에 대한 승인을 받아야하고, 모든 사람의 기증자로부터 서명 동의를 구하십시오. MMA를 또한 사용 동물 윤리 승인에 따라 인간의 분석과 동일한 방법으로 마우스 PBMC를 사용하여 수행 될 수있다. MMA의 무균 조직 배양 기술을 활용한다. 주 : 그림 1을 참조하십시오. 참고 :이 방법은 단지 &quot;단기&quot;배양 방법이면, 무균 기술을 유지하기 위해 분석하는 동안 레벨이 biocontainment 캐비닛의 사용을 권장하지만, 세균 분석을 오염 정말로 시간이 충분하지 않다. 레벨 2 biocontainment 캐비닛 존재보다는이 분석을 위해 하나를 구입하지 않는 경우 따라서 분석은 오픈 벤치에하는 biocontainment 캐비닛의 외부에서 수행 될 수있다. 5 % CO 2, 37 ° C의 배양기를 사용하지만 옵션 아니며 사용되어야최적의 결과. 1. 말초 혈액 단핵 세포 분리 <ol><li> 건강한 기증자 또는 산 시트 레이트 - 덱스 트로 오스 (ACD) 항응고제 (노란색 탑 튜브)를 포함 vacutainers를 사용하여 정맥 천자를 통해 환자로부터 인간의 전체 혈액을 얻습니다. 주 : 전혈 다음 단계 (11)로 진행하기 전에 36 시간 동안 실온 (18 ~ 22 °의 C)에서 ACD에 저장 될 수있다. 일반적 전혈 1 ~ 10 ML의 vacutainer 튜브 분석에 충분하다. </li><li> 전혈 희석 1 : 1을 V / (10 % 소 태아 혈청, 20 mM의 HEPES, 0.01 ㎎ / ㎖ 젠타 마이신으로 보충 된 RPMI-1640) 따뜻한 완전 RPMI 배지에서 V. </li><li> 제조자가 권장하는 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 희석 된 전혈로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리 (재료의 목록 참조). 밀도 구배에 걸쳐 매우 천천히 희석 혈액 레이어 (실온, 18 ~ 22 ℃로 가온). 참고 믹시의 양을 최소화조심스럽게 적하 방식으로 혈액 혼합물을 적층하여 또는 피펫을 사용하여 혈액의 최적 분리를위한 인터페이스에 ng를. <ol><li> 혈액 혼합물이 천천히 밀도 구배에 가까운 피펫 팁을 배치함으로써, 매우 천천히 관의 측면을 실행하는 피 혼합물을 활성화하여 농도 구배의 맨 위에 레이어 할 수있다. </li><li> 50 mL의 실험 규모 층 혈액 (15 ㎖의 튜브에서) 밀도 구배의 3 ㎖의 위에 혼합물 또는 층 밀도 구배 (15 ㎖의 위에 피 액 35 mL를 10 ㎖에 따라 튜브). 통상적으로, 전체 혈액 10 ㎖의 일부 도너 투 도너 변화량 천만 한 PBMC를 산출한다. 주 : 밀도 구배와 혈액 혼합물의 믹싱이없는 것이 매우 중요합니다. 혈액 혼합물을 밀도 구배 위에 층 전체 혈액 농도 구배 위에있을 때까지 천천히 상승한다. </li><li> 브레이크없이 30 분 동안 700 XG에 적층 된 혼합물을 원심 분리기. CENTR혈장, 버피 코트 (PBMC를 함유), 밀도 구배 물질, 과립구, 및 적혈구 : ifuged 혼합물 (위에서 아래로) 5 층으로 분리한다. </li><li> 삭제 플라즈마의 대부분을 폐기하고 신중 파스퇴르 피펫 및 흡입 벌브를 사용하여 새 15-㎖의 튜브에 버피 코트 (PBMC)의 컨텐츠를 검색한다. 주 : 버피 코트 층의 제거를 효과적으로 층의 외측 주위에 원 운동을 수행하는 동안 상기 튜브에 대한 피펫의 팁의 파스퇴르 피펫에 흡입을 적용함으로써 수행된다. </li></ol></li><li> 세척 사이에서 (풀 브레이크) 10 분 동안 350 × g으로 원심 분리에 의해 단리 한 PBMC를 7.3 pH를 인산 완충 용액 (PBS)에 세 번 세척 하였다. 완전 RPMI 배지에서 PBMC 펠릿을 재구성한다. 펠렛의 크기에 따라, 매체의 3-7 mL로 충분하다. </li><li> 트리 판 블루와 혈구를 사용하여 PBMC를 계산합니다. 만 트리 판 블루로 염색되지 않은 그 세포를 계산합니다. Reconstitut전체 RPMI 배지에서 1,750,000 세포 / ㎖로 전자 PBMC를. </li><li> 8 챔버 슬라이드의 각 웰에 400 μL 시드 (700,000 세포). 37 ° C, 완전히 습윤 조직 배양 인큐베이터에서 인큐베이션 슬라이드 단핵구 / 대 식세포를 부착 할 수 있도록 한 시간 동안 (5 % CO 2로 보충). </li></ol> 첨착 단핵구 2. 전처리 참고 : 식균 작용을 억제하거나 강화하는 방법을 찾고 있다면이 단계는 필요하다. <ol><li> 사전 치료는 관심의 약물 (들) 또는 화합물 (들)와 단핵구를 부착. 완전한 RPMI 배지를 사용하여 원하는 농도로 약물 (들) 또는 다른 시험 물질을 재구성한다. 참고 : 예를 들어, 200 μg의 IVIG / ㎖ 전형적 인간 단핵 세포를 사용하는 경우의 탐식 95~100% 억제를 수득하기 위해 사용된다. </li><li> 대기음 (단계 160 후) 1 시간 배양 한 후 8 챔버 슬라이드에서 비 부착 세포를 함유하는 상등액을 버리고. (400)로 교체약물이나 다른 치료 μL, 37 ° C에서 1 시간 동안 품어. <ol><li> 흡입 및 8 챔버 슬라이드에 솔루션을 교체 할 때, 약하게 부착 된 세포가 이륙하지 않도록 유체의 흐름을 제어해야합니다. 또한, 한 번에 2 ~ 3 빈 우물 작업과 우물을 건조하지 마십시오. 참고 : 일반적으로, 각 치료 기술 삼중으로 수행된다. </li></ol></li></ol> R 3. 옵 소닌 2 R 2 붉은 혈액 세포 참고 : 여기에 사용 된 R 2 R 2는 혈액 수집 센터 (캐나다 혈액 서비스)에서 얻을 수 있습니다,하지만 그들은 또한 시판되고있다. 옵 소닌 R 2 R 2 적혈구는 FcγR 매개 식균 작용을위한 양성 대조군으로 사용된다. 순진 R 2 R이 1 달까지 4 ° C에서 Alsever의 솔루션 (연장하기 위해 수명)에 저장해야합니다. Alsever의 솔루션은 사내에서 만든 0.8로 구성되어있다% / V 트리 나트륨 시트 레이트 (수화물) 1.9 % w / v를 덱 스트로스, 0.42 % w / v를 염화나트륨 및 0.05 % w / v를 시트르산 (수화물) w R 2 R 경우이 세포는 R 1 R 2, R 1 R 1, R 1, R 또는 R 2 R, 사용할 수있는 다른 RH-phenotyped 세포는 사용할 수 없습니다. <ol><li> 워시 R 2 R 2 (CDE / CDE) PBS 적혈구 5 분마다 350 XG 원심 분리를 3 회 총. 주 : 필요한 적혈구의 양이 실험 규모에 따라 다시 계산 될 수있다. 적혈구 인해 용해 또는 상층 액을 제거하는 동안 각각의 세척 중에 손실되기 때문에 항상, 적혈구의 과량을 씻는다. 예를 들어, 기술 3 회 반복 실시 (5) 치료와 두 컨트롤 모두와 함께 실험에서, 21 우물의 총이있다. 400 μL / 웰의 1.25 % RBC 혼합물 21 우물은 포장 된 105 μL가, RBC이 필요 옵 소닌을 나타냅니다. (200) RBC의 μL 처음에 세척해야하며, 150 &amp; #181; L은 식균 작용 단계에 대한 적혈구 적당량가되도록하여 옵 소닌 화되어야한다. </li><li> 1 세척 R 2 R 2 펠렛 Opsonize : 사람 혈청에서 1 v / V를 클론 항 D 항체를 간헐적 혼합하여, 37 ℃에서 1 시간 동안 배양. 주 : 다 클론 항 D 항체를 사용할 수없는 경우는 시판되고있는 단일 클론 항 D 항체 또는 혈액 은행 또는 수혈에서 얻을 수 통상의 Rh 면역 예방에 사용되는 항 - D를 사용하는 것이 가능하다 서비스. 분석을 설정할 때, 그리고 비 - 역가 클론 항체의 많은 스위칭마다 또는 모노클로 날 항체로 전환 최적화 실험은 초기에 수행되어야한다. 이것은 글로불린 시험 3+ 사이 4+ 및 계산 (100) 단핵 세포 당 70 ~ 90 사이의 포식 적혈구의 식균 작용의 결과 (IAT) 결과에 필요한 최적의 농도 또는 항-D의 볼륨을 확인하는 것입니다. </li><li> opsonize을 씻으십시오D의 R이 R이 각각 5 분, 350 × g으로 원심 분리를 이용하여 PBS에서 3 회 전체. 주 : R이 R이 성공적으로 옵 소닌 간접 IAT를 수행하여 확인할 수있다. 간략하게, 이차 클론 항 - 인간 항체 RBC 표면 상 opsonizing 일차 항체에 결합하기 위해 추가되고, 증폭 된 신호는 혈구 응집의 형태로 관찰 할 수있다. 상세한 제조 업체 프로토콜은 보충 자료 파일에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 1.25 % v / V를 완료 RPMI 매체를 사용하여 세척 R 2 R 2 펠렛을 복원합니다. 주 : 옵 소닌 잉여 R이 R 2는 주까지 4 ℃에서 Alsever의 용액에 저장 될 수있다. </li></ol> 4. Fc 수용체 - 매개 탐식 <ol><li> 8 챔버 슬라이드에서 약물 또는 중간 뜨는을 기음과 1.25 %의 V / V의 R 2 R 2 혼합물의 400 μL를 추가합니다. 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션. </li><li> 선미어 배양 2 시간은 제조업체의 어댑터를 사용하여 챔버를 제거합니다. 종이 타월에 과잉 R 2 R 2를 DAB. 슬라이드가 건조하지 않도록해야합니다. </li><li> PBS와 100 mL의 비커를 입력합니다. 잠수함 천천히 해제 포식 R 2 R (2)의 대부분을 제거하기 전후 (30-40 선 주위)를 슬라이드 이동시킴으로써 슬라이드를 세척한다. </li><li> PBS를에서 슬라이드를 제거합니다. 종이 타월 또는 조직 및 사용 초과 PBS 오프 DAB 슬라이드를 공기 - 건조. </li><li> 45 초 동안 100 % 메탄올의 공기 건조 슬라이드를 수정합니다. 그런 다음, 고정 된 슬라이드를 공기 - 건조. 참고 : 슬라이드 같은 그룬 왈드 - 김사 염색 (21) 또는 라이트 - 김사 염색 (22)로, 하류 염색에 더 호환되는 다른 방법을 사용하여 고정 할 수 있습니다. </li><li> elvanol 설치 매체 (또는 다른 시판 설치 중) 집에서 만든-및 추가 된 커버를 사용하여 슬라이드를 탑재합니다. 참고 : Elvanol 설치 매체 / V 포 w는 15 %로 구성되어있다PBS에서 lyvinyl 알콜 수지 30 % v / V를 글리세린. 모든 수지가 용해 될 때까지 혼합물을 가열하고, 글리세린이 균일하게 혼합한다. 이것은 다른 시중에서 판매하는 설치 매체로 대체 될 수있다. </li><li> 마운트가 정량화하기 전에 밤새 건조하도록 허용합니다. </li></ol> 탐식의 5 정량화 <ol><li> 위상 현미경 및 40X 대물 렌즈를 이용하여 수동으로 적어도 200 단핵구 이들 단핵 포식 내의 R 2 R (2)의 수를 카운트하여 탐식 이벤트의 양을 정량화. 동시에 단핵 세포의 수와 포식 R 2 R 2의 수를 정량화하기 위해 각 손에 하나의 카운터가 있습니다. </li><li> 단핵 세포의 수에 의해 포식 R 2 R (2)의 분할 수 (100) 및 고속 평균 (SEM)의 ± 표준 오차의 평균으로서 데이터 (평균 식세포 인덱스)을 곱하여 평균 식세포 인덱스를 얻었다. </li&gt; </ol>

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MMA의 조직 문화와 현미경 모두에 대한 전문 지식을 필요로하는 힘든 기술이다. 성공을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계가 다음과 같습니다 단핵 세포 단층의 1) 생성; 적혈구의 2) 옵 소닌, 3) 매뉴얼 정량화. 단핵구 단층은 상기 챔버 슬라이드에 강력하게 부착되지 않기 때문에, 생리 학적 pH를 11 시험 법에 걸쳐 유지되어야하며, PBMC를 적절한 수는 배정되어야한다. 부착 된 세포를 방해 할 수 활발한 피펫은 피해야한다. 하나의 방법은 항상 제거 챔버의 동일한 코너의 솔루션을 추가하고, 움직임이 느리고 정상인지 확인한다. 마찬가지로, 여분의 적혈구를 제거하는 마지막 세척 단계 동안, 운동은 천천히 그리고 꾸준히해야한다. 아직도 않은 포식 적혈구의 대부분을 제거하는 동안이 단층에 최소한의 교란을 보장합니다. 불충분 한 세척 수동 ...로서하게 오염 적혈구의 높은 배경으로 이어질 것입니다ntification 어렵다. 둘째, R 2 R이 적혈구 충분히 식세포 제어 80-120 평균 식세포 인덱스를 얻기 위해 옵 소닌 화되어야한다. 이것은 원하는 식세포 범위 계산의 용이성 간의 균형을 통계 분석 식세포 적당량 유지 (예를 들어, 5 개 이상으로 단핵구는 적혈구 정확하게 정량화하기 어렵다 포식). 옵 소닌 화의 정도는 IAT에 의해 확인 될 수 있고, 4 이상 3+ 사이의 판독이 필요하다. 이 적혈구 거기 상등액 암적색 바뀌면 세정 동안 과도한 용해 때 또는 폐기되어야하는 R이 R 식세포의 상당한 감소로 인해 스토리지 세포의 노화 실험에서 관찰되는 경우. 실험실 직원 사이의 실험 사이의 수를 비교 특히 마지막으로, 현미경을 사용하여 수동 정량화는 까다로울 수있다. 각 웰에 동일한 필드를 검사함으로써, 또는 단순히 이상의 셀을 계산하여좀더 일관 카운트를 얻을 수있다. 숙련 된 기술자 및 교육 슬라이드 지정된 세트의 사용과 나란히 훈련하는 것이 좋습니다. MMA의 주요 비판 수동 정량화 단계의 주관적이다. 그러나, 적절한 교육과, 일관성은 서로 다른 카운터를 통해 얻을 수있다. 또 다른 한계는 인간 시료를 처리 데이터의 변화의 원인이고 R이 2 표면 항원을 발현 수준, 단핵 식세포 능력 및 R의 고유 도너 투 도너 차이이다. 다른 대안 기술은 FcγR 매개 식균 작용을 검사 할 수 있습니다. 상업용 키트 대부분은 식균 작용을 모니터링하는 형광 출력을 이용 (예 bioparticles, pH 민감성 형광 단백질, 또는 IgG에 표지 된 형광 라텍스 비즈). 형광 출력의 사용은보다 객관적인 정량화를 제공 않지만, 하나는 사기 필요형광 현미경 유세포뿐만 아니라, 시판 키트에 따라 계속되는 의존성의 사용과 관련된 사용 가능성, 비용 및 교육을 생각 해보자. 마지막으로, 상기 분석은 연구 문제에 따라 변경 될 수있다. 식세포 작용의 억제 약물을 시험 할 때 예를 들어, 단핵구는 사전 처리 될 수 있거나, 약물과 적혈구 옵 소닌 화 (즉, 경쟁 분석) 모두는 공동 - 배양 하였다. 다른 서브 타입, 키메라 항체 또는 재조합 항체의 구조의 다운 스트림 신호는 테스트 될 수있다. 보편적 인 항원 - 널 피 (24)의 개발에 최근 돌파구로, MMA는 식균 작용을 유발의 감소 효과가 실제로 존재 여부를 평가하기 위해 다양한 항체 이러한 항원 널 적혈구의 초기 화면에 이용 될 수있다.

단핵구 단층 분석법(MMA)은 원래 적혈구에 대한 자가항체 또는 동종항체(RBC)가 있는 환자의 수혈 결과를 더 잘 예측하기 위해 개발된 체외 분석법입니다1-5. 이를 in vitro assay를 이용하여 Fcγ receptor (FcγR) 매개 식세포작용에 대한 항적혈구 항체의 효과를 평가함으로써 in vivo 임상적 결과를 예측할 수 있습니다. 실제로, MMA는 혈청학적으로 호환되지 않는 혈액의 수혈에도 불구하고 항체 결합 적혈구의 면역 파괴를 피하기 위해 성공적으로 사용되어 왔습니다5. 교차매칭(crossmatching)이라고도 하는 적합성 검사를 위한 일반적인 수혈 전 절차에는 환자의 혈액에서 ABO 및 Rh 항원을 입력하고 환자의 내 항적혈구 항체 유무를 선별하는 등의 혈청학적 방법이 포함됩니다6. ABO/Rh에 대해 일치하는 혈액을 선택하고, 항체가 존재하는 경우 이러한 항체를 피하기 위해 수혈할 혈액을 추가로 선택할 수 있도록 항체를 식별하려는 시도를 합니다. 이상적인 교차 일치 결과는 모든 헌혈자의 혈액이 환자의 혈액과 혈청학적으로 양립할 때 발생하며, 이는 수혈 후 용혈의 위험을 감소시킨다7. 그러나 이 체계는 반복적인 수혈이나 임신으로 인해 동종면역이 된 소수의 환자 그룹에는 부족합니다. 이 환자들은 특정 적혈구 항원에 대한 동종항체를 생성합니다. 일부는 일반 인구 집단에서 매우 높은 빈도의 항원에 대한 항체를 생성하므로 점차 교차 일치가 어려워집니다8,9. 복잡성을 더하는 것은 모든 동종항체가 임상적으로 유의미한 것은 아니라는 것입니다. 즉, 혈청학 검사에 의해 검출된 적혈구에 대한 동종항체의 결합이 항원 양성, 부적합한 혈액을 수혈할 때 반드시 용혈을 초래하는 것은 아닙니다. MMA는 원래 수혈 환경에서 혈청학적으로 호환되지 않는 혈액의 잠재적인 임상적 중요성을 평가하기 위해 개발되었습니다1-5.
항체 결합 적혈구의 혈관외 용혈은 단핵 식세포 시스템에 의해 매개되는 것으로 알려져 있기 때문에 1차 단핵구/대식세포가 진단 분석 개발에 활용됩니다. 단핵구, 적혈구 및 항체의 상호작용을 연구하기 위한 최초의 분석법이 1975년에 발표되었으나, 차선의 조건으로 인해 로제트 형성(적혈구가 단핵구의 말연부에 결합)만 발생했을 뿐, 식세포작용은 관찰되지 않았습니다10. 여러 그룹에서 분석에 대한 상당한 수정을 가하여 동종항체 결합 적혈구의 식세포작용 수준이 용혈1-5의 임상 결과와 상관관계가 있을 수 있는 분석으로 이어졌습니다. 최근에는 자가 환자 검체를 이용한 임상 MMA 교차 일치의 유용성을 높이기 위해 임상 검체의 최적 보관 조건과 분석 조건의 추가 최적화를 조사했습니다11.
수혈 결과를 예측하기 위해 MMA 외에도 51Cr 방출 검사, 장미 검사 및 화학발광 검사(CLT)의 세 가지 다른 진단 기술이 사용되었습니다. 51Cr 방출 검사에서 환자는 51Cr 표지 된 공여 적혈구를 주입하고 표지 된 적혈구의 반감기를 모니터링하고 수혈 후 생존 또는 청소를 예측합니다12,13. 이 방법은 방사성 물질을 사용하기 때문에 더 이상 거의 수행되지 않습니다. 로제트 검사는 단핵구를 적혈구와 혼합 및 배양하고 로제트 형성 수준(식세포작용 없음)을 정량화하는 것을 포함합니다14. 생체 내 항체의 임상적 중요성은 비장 및/또는 간에서 발견되는 대식세포에 의한 활성 식세포작용과 관련이 있습니다. 따라서 이 방법은 식세포작용에 대한 적절한 판독값을 제공하지 않습니다. CLT는 루미놀을 사용하여 적혈구의 단핵구 식세포작용 중 산화 파열을 모니터링하는데, 이는 루미놀이 식체에서 산화될 때 청색 형광을 발하기 때문입니다15. 이 방법은 좋지만 호중구에 의한 오염은 판독에 혼란을 줄 수 있습니다. 사용 가능한 4가지 방법의 민감도, 실용성 및 재현성을 평가하기 위해 병렬 비교가 이루어졌으며 CLT와 MMA 모두우수한 16위를 차지했습니다. 그러나 CLT는 주로 태아 및 신생아의 용혈성 질환(HDFN)을 평가하는 데 활용되어 왔으며, 분석의 최적 pH인 8.0은 식세포작용11 수준을 저하시킬 수 있습니다.
진단 및 임상 유용성 외에도 MMA는 다른 연구 목적으로 수정되었습니다. 실제로, MMA는 혈청학과 생물학 간의 불일치를 해결하기 위한 기능적 분석법으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 정맥 면역글로불린(IVIG) 요법 후 용혈의 원인을 후향적으로 조사하는 데에도 사용되었습니다17. 또한 FcγR 매개 식세포작용18-20의 화학적 억제제의 구조-기능을 조사하고 FcγR 매개 식세포작용21의 다운스트림 신호전달을 연구하는 데 사용되었습니다. 우리 실험실에서는 인간 MMA를 사용하는 것 외에도 1차 마우스 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 자가 적혈구를 사용하여 쥐 MMA를 개발하고 있습니다. 그 이유는 생체 내 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA) 마우스 모델(미발표 데이터)을 개발하기 위한 중간체로 FcγR 매개 식균작용을 유도할 수 있는 항체를 스크리닝하는 것입니다. 다양한 변형은 식세포작용을 유도하는 IgG 항체와 FcγR 상호 작용의 다양한 측면에 초점을 맞춥니다.

<table><tbody><tr><td>산성 시트레이트 덱스트로오스 (ACD) 진공 청소기</td><td>BD</td><td>REF364606</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>시그마</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>멀티셀&nbsp;</td><td>080150</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-64</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-03</td><td>https://www.gelifesciences.com/</td></tr> <tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>8-챔버 슬라이드</td><td>Lab-Tek-ll</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>R2R2 (cDE/cDE) 적혈구</td><td>Canadian Blood Services</td><td></td><td>상업적으로 이용 가능(예: , http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)</td></tr><tr><td>인간 혈청의 다클론 항-D</td><td>감마 생물학</td><td>DIN 02247724</td><td>상업적으로 이용 가능한 단클론 항-D 또는 Rh 면역 글로불린으로 대체 가능</td></tr><tr><td>100% 메탄올</td><td>Caledon</td><td>6700-1-42</td><td></td></tr><tr><td>폴리비닐 알코올 수지</td><td>Sigma</td><td>P8136</td> : <td>시판되는</td></tr><tr><td>마운트 UltraPure 글리세린</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr>로 대체 가능 <tr><td>: 커버 슬립</td><td>VWR</td><td>48366 067</td><td></td></tr><tr><td>Novaclone anti-IgG</td><td>Immucorgamma</td><td>5461023</td><td>IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf) 옵션</td></tr></tbody></table>

단핵구 단층 분석의 사용은 fcγ 수용체 - 매개 식균 작용을 평가하기

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

원래는 혈청학적으로 호환되지 않는 혈액의 수혈 결과를 예측하기 위해 개발되었지만, 단핵구 단층 분석법(MMA)은 연구 및 임상 환경 모두에서 항체 및 Fcγ 수용체(FcγR) 매개 식세포작용의 다양한 측면을 검사하기 위해 수정할 수 있는 매우 다재다능한 체외 분석법입니다. 이 분석은 포유류 전혈에서 분리된 말초 혈액 단핵 세포의 부착 단핵구를 사용합니다. MMA는 인간 및 쥐 조사에 모두 사용되는 것으로 설명되었습니다. 이 단핵구는 면역 반응에 관여하는 FcγR(예: FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIIA)을 발현합니다. MMA는 FcγR 매개 상호작용, 특히 항체 감작 적혈구(RBC)가 FcγR에 부착 및/또는 활성화한 후 단핵구에 의해 식세포화되는 식세포작용의 메커니즘을 이용합니다. 생체 내에서는 주로 비장과 간에서 발견되는 조직 대식세포가 항체 옵소니화된 적혈구의 FcγR 매개 식세포작용을 수행하여 혈관외 용혈을 일으킵니다. MMA를 사용하여 식세포작용 수준을 평가함으로써 in vivo FcγR 매개 과정의 다양한 측면을 조사할 수 있습니다. MMA의 일부 응용 분야에는 수혈 환경에서 동종 또는 자가항체의 임상적 관련성 예측, 식세포작용을 촉진하거나 억제하는 후보 약물 평가, FcγR 결합 약물 또는 항체의 다운스트림 신호 전달 효과를 조사하기 위해 형광 현미경 검사 또는 전통적인 서양 면역 블로팅과 분석을 결합하는 것이 포함됩니다. 몇 가지 제한 사항으로는 처음부터 끝까지 하루 종일 걸리는 이 기술의 고된 노력과 포유류의 혈액을 다루기 위한 연구 윤리 승인의 요구 사항 등이 있습니다. 그러나 근면과 적절한 훈련을 통해 MMA 결과는 24시간 이내에 얻을 수 있습니다.

그림 1 위에 설명 된 절차의 중요한 단계를 수행함으로써, MMA는 재현성을 수행 할 수 있습니다. IVIG는도 2의 식균 작용을 억제하기위한 예로서 사용 하였다. IVIG 따라서 식세포의 하류 결과를 억제 결합 및 Fc 수용체를 차단하는 것으로 알려져있다. 사용 IVIG의 양을 적정에 의해 용량 의존적 억제하는 / ml의 전체 (도 2A)에서 억제하지 않았다 / ㎖ 0.5 μg의 아래에 100 % 억제 가까이 농도 결과 200 μg의 이상의 농도가 관찰된다. 탐식 지수 변환 및 0 % 억제 / ㎖가 결정될 수 3 μg의의 IC (50) (도 2b)를 억제 곡선으로서 R이 R이 양성 대조군으로 정규화하는 경우. 지속적으로 분석을 수행하는 것 외에도 quantifica분석의 능은 때때로 어려울 수있다. 도 3은 여러 MMA 슬라이드 위상차 현미경 이미지의 집합이다. 현미경의 경험을 바탕으로, 하나는 오염 RBC (그림 3D), 또는 포식 RBC (그림 3B)에서 공포에서 단핵 세포를 구분할 수 있습니다. 세포 및 / 또는 파편의 고밀도 클러스터는 정량 (도 3E 및 F) 동안 피해야한다. 또한, 하나는 피해야 오버 opsonizing 단핵구 인테리어 overcrowds하고 정확한 정량 (그림 3C)을 방해 높게 식균 작용으로 이어질 것 R 2 R 2 RBC를. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig1.jpg" /> 병무청의 도식도를 그림. 병무청에서 중요한 단계의 단계별 묘사 : 전체 혈액에서 PBMC를 분리, 부착 monocyt 공급옵 소닌 R 2 R 2 챔버 슬라이드를 세정하고 에스. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig2.jpg" /> 도 2 정맥의 IgG (IVIG)는 MMA를 사용하여 시험 관내 식세포 작용을 억제한다. IVIG는 식균 작용을 억제하는 것으로 알려져 있으며, 인간의 MMA 억제 제어부로서 사용된다. 미처리 R 2 R이 제어에 비해 IVIG의 (A)의 적정 식세포 용량 의존적 억제 결과. 결과의 평균, N = 3의 실험 (SEM)의 ± 표준 오차의 평균을 나타낸다. 통계 분석은 학생 t의 -test를 사용 하였다 : ** P≤0.01 및 *** P≤0.001. (B)는 IC (50) 오와 IVIG의 억제 곡선F 3 μg의 / ㎖ (점선). 결과는 치료 R 2 R 2 (0 % 억제)에 정규화 데이터를 표시; N = 3 실험 ± SEM을 의미한다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig3.jpg" /> 40X 배율에서 샘플 슬라이드 그림 3. 위상차 현미경 이미지. (A)을 단핵구가 배경 (흰색 화살표)에 거의 오염, 취소 포식 R 2 R 2, 평균 (특유의 후광 빛이 함께 검은 색 화살표)에 1-2 R 2 R 2를 포식하는 완벽한 슬라이드. 포식 R 2 R이 오인 될 수있는이 슬라이드 (b)에 나타낸 바와 같이, 단핵구는 때때로 확대 한 액포 (흰색 화살표). (C &lt;/ strong&gt;을) 이상 4-5 R 2 단핵구 당 R 2 (검은 색 화살표를 포식, 옵 소닌을 통해-R 2 R 2가되었을 때)가 R 2 R 2는 단핵구와 별개의 셀 내에서 혼잡하기 때문에 정확하고 어려운 계산 렌더링 경계는 구별 할 수 없습니다. (D) 슬라이드의 불충분 한 세척이 부착 된 적혈구 오인 될 수있는 풍부한 R 2 R 2 오염 (흰색 화살표)로 연결됩니다. (E) 때때로, 단핵구 및 오염 적혈구가 클러스터를 형성 할 수있다. 클러스터는 피해야한다 세균 오염을 나타냅니다. (F) 단핵구 정량 중에 피해야 큰 응집체를 형성 할 수있다. 볼 필드 무작위 선택을 사용하여, 패널 A는 MMA 제대로 수행되었는지 보통 관찰되는 것이다. 스케일 바는 20 μm의입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig3large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하세요</a>이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

단핵구 단층 분석법(MMA)은 포유류 말초 전혈에서 얻은 분리된 1차 단핵구를 사용하여 Fcγ 수용체(FcγR) 매개 식세포작용을 평가하는 체외 분석법입니다.

단핵구 단층 분석의 사용은 Fcγ 수용체 - 매개 식균 작용을 평가하기

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

이 in vitro 기능 분석의 전반적인 목표는 FC 매개 식세포작용의 다양한 측면을 평가하는 것입니다. 이 방법은 적혈구에 대한 자가항체 및 동종항체의 임상적 중요성과 같은 면역혈액학 및 수혈 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 적혈구에 대해 미리 형성된 항체를 가진 환자에서 수혈 결과를 예측하기 위해 시험관내에서 수행할 수 있는 기능적 생물학적 분석을 제공합니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Cindy Tong입니다. 이제 사람의 혈액으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 보호 가운과 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 정맥 천자에 의해 산성 시트르산염 포도당이 포함된 액포 튜브에 담긴 건강한 기증자로부터 1-2개의 10밀리리터 전혈 샘플을 채취한 후, 튜브를 클래스 II 생물 안전 캐비닛에 넣고 혈액을 따뜻하고 완전한 배지에서 1:1 비율로 희석합니다.다음으로, 원심분리기 튜브의 측면을 따라 혈액 세포를 실온 밀도 구배에 따라 천천히 피펫으로 피펫하고 층이 섞이지 않도록 주의합니다. 원심분리로 세포를 분리합니다. 그런 다음 상단 플라즈마 층을 버리고 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 버피 코트가 포함된 PBMC를 새 15ml 튜브로 옮깁니다.분리된 PBMC를 PBS에서 3회 세척하고 3차 원심분리 후 3-7ml의 배지에 세포를 재현탁시킵니다. 계수 후, 완전한 배지에서 1.75 곱하기 10에서 밀리리터 농도 당 6 번째 세포로 세포를 희석하고 400 마이크로 리터의 세포를 8 챔버 슬라이드의 각 웰에 파종하여 섭씨 37도 및 전체 습도에서 5 % CO2에서 1 시간 배양합니다. R2R2 적혈구를 옵소니화하려면 먼저 PBS에서 적혈구를 세 번 씻습니다.세 번째 원심분리 후 R2R2 펠릿을 인간 혈청의 다클론 항-D 항체와 1:1 비율로 희석하여 간헐적 혼합으로 섭씨 37도에서 1시간 배양합니다. 옵소니제이션이 끝나면 인큐베이터에서 세포를 제거한 다음 방금 시연한 것처럼 PBS에서 세 번 더 세척합니다. 펠릿을 완전한 RPMI 배지에서 1.25% 부피 대 부피로 재현탁합니다.다음으로, 8 챔버 슬라이드의 각 웰의 상등액을 섭씨 37도에서 2 시간 동안 400 마이크로 리터의 옵소니 화 된 R2R2 셀로 교체합니다. 배양이 끝나면 슬라이드 어댑터를 사용하여 챔버를 제거하고 여분의 R2R2를 종이 타월로 두드립니다. 이제 100ml 비커에 PBS를 채우고 각 슬라이드를 소금 용액에 30-40회 천천히 담그어 비식세포작용된 R2R2의 대부분을 제거합니다.건조 후 슬라이드를 100% 메탄올에 45초 동안 고정하고 커버슬립으로 샘플을 장착하기 전에 셀을 건조시킵니다. 다음 날, 각 슬라이드를 40X 대물렌즈가 장착된 위상차 현미경에 로드하고 각 손에 있는 하나의 카운터를 사용하여 최소 200개의 단핵구와 각 단핵구 내의 식세포작용된 R2R2 수를 수동으로 계수하여 단핵구의 수와 샘플당 식세포작용된 R2R2 세포의 수를 동시에 정량화합니다. 정맥 면역글로불린은 용량에 따라 식세포작용을 억제하는 FC 수용체에 결합하고 차단하며, 밀리리터당 200마이크로그램 농도의 정맥 면역글로불린에서 시작하여 거의 100% 억제가 관찰되고 억제제의 0.5마이크로그램 미만의 농도에서는 거의 억제가 관찰되지 않습니다.식세포 지수가 R2R2 양성 대조군으로 0% 억제로 정규화되면 밀리리터당 3마이크로그램의 IC 50을 갖는 억제 곡선을 결정할 수 있습니다. 경험을 바탕으로 위상차 현미경 검사를 사용하여 단핵구를 오염시키는 적혈구와 액포를 식세포작용한 적혈구와 구별할 수 있습니다. R2R2 적혈구의 과잉 옵소니제이션(opsonization)뿐만 아니라 정량화 과정에서 조밀한 세포 클러스터와 파편을 피해야 하며, 이는 단핵구 내부를 과도하게 채우고 정확한 식세포 분석을 방해하는 높은 식세포작용(phagocytosis)을 유발할 수 있습니다.이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행한다면 6-8시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 컨포칼 현미경을 사용한 면역세포화학 또는 면역형광과 같은 다른 방법을 수행하여 식세포 단백질 발현, 적혈구 상호 작용 및 구획화에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 초기 개발 및 추가 최적화를 통해 이 기술은 수혈 의학 및 세포 생물학 분야의 연구자들이 옵소니제이션 시스템을 탐구하는 방식에 정보를 제공할 것입니다.이 동영상을 시청한 후에는 식세포작용을 유발하는 항체 상호 작용 유형을 평가하기 위해 단핵구 단층 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

use-monocyte-monolayer-assay-to-evaluate-fc-receptor-mediated

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 - 수용체 제공 여러 FC의 표현 형광 항원 코팅 구슬과 monocytic 세포 라인을 활용하여 표준의 수용체 사용량과 phagocytic 활동 결정하고, 임상 샘플에서 항원에 특정한 항체의 phagocytic 활동을 결정하기 위해 높은 처리량 흐름 cytometric 분석을 제시 관심의 항원에 대한 재현할 패션.

임상 항체 샘플 Phagocytic 활동 결정

출처: Nagre, N. 외 마우스의 폐포 대식세포 섭취와 박테리아 제거. J. Vis. Exp. (2019).이 영상은 IgM과 보보체로 옵소니시된 양 적혈구를 이용한 보체 수용체 매개 식구 평가를 시연하며, 이후 쥐 대식세포에 의한 흡수를 보여줍니다. 식의 정도는 헤모글로빈 촉매에 의해 산화된 디아미노플루렌의 청색색 생성 산물을 측정하여 정량화됩니다.

옵소니즈드 적혈구를 이용한 보체 매개 식세포작용 모델 in vitro

이 동영상은 단핵구에 의해 표지되고 옵소니화된 Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구를 포함하는 유세포 분석 기반 식세포작용 분석을 보여줍니다. 유세포 분석은 단핵구에서 형광을 식별하여 식세포작용을 통해 옵소니화된 적혈구의 성공적인 식별을 확인합니다.

기생충에 감염된 적혈구의 항체 매개 식세포작용(Antibody-Mediated Phagocytosis of Parasite-Infected Erythrocytes)을 정량화하기 위한 분석

이 비디오는 말초 혈액의 1차 단핵구를 활용하여 poly D 항체 옵소니화 R2R2 적혈구를 이용한 Fcγ 수용체 매개 식세포작용을 평가하는 단핵구 단층 분석을 보여줍니다.

단핵구 단층에서 Fcγ 수용체 주도 식세포작용 연구를 위한 분석

이 비디오는 중간엽 줄기세포(MSC)가 effector T 세포 증식에 미치는 면역조절 영향을 조사하기 위한 시험관 내 분석을 보여줍니다. 이 분석에는 MSC와 PBMC를 공동 배양하여 단핵구 집단이 면역조절 표현형을 획득하도록 유도하여 인터루킨-10(IL-10)의 분비를 유도하는 것이 포함됩니다. 활성화된 CD4+ T 세포를 배양한 후, 유도된 단핵구는 T 세포 증식을 효과적으로 억제합니다.

백혈구 증식에 대한 단핵구의 면역조절 효과를 평가하기 위한 체외 분석

이 비디오는 모유 식세포에 의한 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP)을 측정하는 분석을 보여줍니다. 항원-항체 복합체에 접합된 형광 표지된 미세구는 모유에서 분리된 세포 현탁액과 결합되어 식세포 백혈구에 의한 항체 의존성 세포 식세포작용을 유도합니다. 세포를 일반 백혈구 항원(CD45)에 대한 항체로 라벨링할 때, 유세포 분석법을 사용하여 미세구 양성 생존 가능한 식세포 백혈구의 형광 강도를 측정하여 ADCP 활성 수준을 나타냅니다.

식세포에 의한 항체 의존성 세포 식세포작용을 측정하기 위한 시험관 분석

여기에서는 형광 측정 방법을 사용하여 부착 대식세포 세포주에 의한 형광 입자의 식세포작용을 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 입자 내부화의 고처리량 정량화와 그에 따른 액틴 중합화를 용이하게 합니다.

대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

이 원고의 목적은 인간 혈액 샘플에서 단핵구 및 과립구 식세포작용과 산화 폭발 활성을 측정하는 방법을 제시하는 것입니다.

인간의 혈액에서 측정 과립구와 단핵구 식균 작용 및 산화 버스트 활동

여기는 마우스 주민 복 막 대 식 세포에 의해 회전 디스크 confocal 현미경 이미지 단일 phagocytic 이벤트를 사용 하 여 방법에 설명 합니다. 프로토콜은 다른 phagocytic 세포를 확장할 수 있습니다.

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

이 프로토콜은 다양한 신호 전달 경로의 기능을 포괄하는 스크리닝 방법으로 사용되는 호중구 기능 분석 세트를 특징으로 합니다. 이 프로토콜에는 세포 생존율, 순도, 활성 산소 종 생산, 실시간 이동, 식세포작용 및 호중구 세포외 트랩에 대한 예비 제안에 대한 초기 및 간단한 평가가 포함됩니다.

호중구 기능에 대한 간략한 개요를 위한 일련의 스크리닝 기법

당사는 기존 단핵구-단층 분석법(MMA)에 대한 개선 사항을 개발하고 방법을 업데이트했으며, 이 분석에서는 대식세포를 사용하여 수혈 의학 및 면역학에서 적혈구 동종 항체의 임상적 관련성을 더 잘 예측하는 데 도움을 줍니다. 이 분석법은 단핵구-대식세포 분석법(M-MA)이라고 합니다.

Monocyte-Macrophage Assay를 이용한 적혈구 항체 유의성 예측(Prediction of Red Blood Cell Antibody Significance Using the Monocyte-Macrophage Assay)

배우세요 단핵구 단층 분석법을 활용한 Fcγ 수용체 매개 식균 작용 평가 방법을. 이 기술은 수혈의학 및 면역혈액학 연구에서 항체 상호작용을 분석하고 수혈 결과를 예측하는 데 활용됩니다.

단핵구 단층 분석의 사용은 Fcγ 수용체 - 매개 식균 작용을 평가하기

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