망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

여기에서, 우리는 단클론 성 전 사체의 단리 및 후속 특성 규명을 위해 연결 세포 유형을 분류하기위한 조합 접근법을 제시한다. 이 프로토콜은 성공적인 RNA 시퀀싱 (RNA-Seq)을위한 샘플 준비를 최적화하고 세포 다양성의 강화 된 이해를 위해 특별히 고안된 방법을 설명합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 전체 마운트 망막에서 형광 표지된 단일 세포를 분리하는 것입니다. 이 방법은 신경 과학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 특정 뉴런 클래스의 하위 유형이 얼마나 많은지, 각 하위 유형에 대한 유전적 마커는 무엇입니까?

이 기술의 주요 장점은 망막 조직 해리의 필요성을 없애 세포가 격리 전에 더 건강한 환경에서 생존할 수 있도록 한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 형광 표지된 모든 세포 집단으로 확장되므로 다른 시스템에 적용하여 건강 및 질병에서 세포 다양성과 기능을 이해할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 이 기술이 세포의 생존력을 손상시키지 않고 세포를 패치 클램핑하는 연구자의 능력에 의존하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

RNA 분리 단계는 배우기 어려울 수 있으므로 이 방법의 향후 시연은 매우 중요한데, 그 이유는 소량의 RNA를 적절하고 신속하게 처리하지 않으면 쉽게 분해될 수 있기 때문입니다. 이 절차를 시작하려면 바늘로 각막을 찔러 각막과 공막의 경계에서 잘라냅니다. 그런 다음 집게를 사용하여 렌즈를 제거합니다.

공막을 부드럽게 찢고 망막과 공막이 만나는 시신경을 절단합니다. 망막에서 공막을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로 투명한 유리체를 제거합니다.

망막을 반으로 잘라 산소가 공급된 세포외 용액에 넣어 실온에서 사용할 때까지 보관합니다. 기록 챔버에 조직을 장착할 준비가 되면 페트리 접시에 500마이크로리터의 산소가 공급된 세포외 용액으로 희석한 효소 용액에 망막 조각을 옮기고 셰이커의 실온에서 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 산소가 공급된 세포외 용액에서 망막을 세척하고 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 유리 바닥 기록 챔버로 옮깁니다.

그런 다음 집게를 사용하여 광수용체층이 아래를 향하도록 조직을 조심스럽게 평평하게 만듭니다. 피펫을 사용하여 과도한 액체를 제거하고 나일론 메쉬가 있는 백금 링을 사용하여 조직을 고정합니다. 그런 다음 산소가 공급된 세포외 용액으로 챔버를 채우고 현미경 스테이지에 장착합니다.

산소가 공급된 세포외 용액을 분당 2-4밀리리터로 조직을 관류합니다. 이 절차를 준비하려면 마이크로피펫 풀러를 사용하여 전기생리학적 기록을 위해 일부 유리 마이크로피펫에 펄스를 가합니다. IR-DIC 광학 장치를 사용하여 신경절 세포층을 관찰합니다.

그런 다음, 약 480 나노미터에서 에피형광을 사용하여 GFP와 신경절 세포를 확인합니다. 다음으로, DIC에서 세포 내 용액으로 채워진 피펫을 찾습니다. 약간의 양압을 가하고 볼륨을 0으로 만듭니다.tage 오프셋 amp리퍼.

그런 다음 GFP 양극 셀에서 유리 마이크로피펫을 내리고 테스트 전압 명령 단계를 적용하여 밀봉 저항을 모니터링합니다. 음압은 피펫과 세포막 사이에 기가옴 밀봉을 형성해야 합니다. 안정적인 밀봉을 형성한 후 전체 세포에 접근할 수 있도록 짧은 음압 펄스를 가하여 멤브레인을 파열합니다.

세포의 수상돌기가 형광 추적기로 채워질 때까지 1-2분 정도 기다립니다. 이 단계에서는 10ml 주사기로 음압을 가하여 세포 세포질 함량을 피펫으로 조심스럽게 추출합니다. 그 동안, 세포체의 크기가 감소하는 것을 시각화하여 DIC의 추출을 모니터링합니다.

세포질 내용물을 추출한 후 조직에서 피펫을 조심스럽게 들어 올리고 용액에서 피펫을 빠르게 제거합니다. 다음으로, 헤드스테이지 홀더에서 피펫을 빠르게 제거하고 피펫 팁을 DEPC 처리된 H2O로 짧게 헹굽니다. 그런 다음 꼭 맞는 튜브를 통해 피펫을 1ml 주사기에 연결합니다.

즉시 세포를 10 마이크로 리터의 용해 완충액으로 배출하고 하나는 0.2 밀리리터 PCR 튜브에 넣습니다. 탁상용 미니 원심분리기의 튜브를 2000회 g에서 10초 동안 짧게 원심분리합니다. 그런 다음 즉시 샘플을 드라이 아이스에서 5 분 동안 급속 동결합니다.

냉동 후에는 최상의 결과를 위해 최대 2주 동안 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 이 절차를 준비하려면 거꾸로 된 P20 또는 P200 팁 홀더의 상단 부분을 96웰 마그네틱 스탠드에 테이프로 붙여서 자기 분리기 장치를 설정합니다. 그런 다음 샘플당 약 1밀리리터의 신선한 70% 에탄올을 준비합니다.

4°C 저장소에서 RNA 마그네틱 비드를 제거하고 실온에서 해동합니다. RNA 비드가 실온에 도착하면 용액이 잘 혼합되도록 30초 동안 와류로 가열합니다. 그런 다음 실온에서 1분 동안 세포를 해동합니다.

그런 다음 각 샘플에 5마이크로리터의 Rnase-free H2O를 추가하고 위아래로 피펫팅합니다. 그런 다음 각 튜브에 22마이크로리터의 RNA 비드를 넣고 완전히 섞습니다. RNA가 마그네틱 비드와 상호 작용하고 결합할 수 있도록 실온에서 샘플을 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 튜브를 자기 분리기 장치에 8분 동안 놓습니다. 계속하기 전에 상등액이 투명한지 확인하십시오. 한 팔레트에서 비드를 관찰하고 피펫팅 중에 튜브 측면에서 비드를 분리하지 마십시오.

샘플에서 상등액을 제거하고 150 마이크로 리터의 70 % 에탄올을 첨가하십시오. 그런 다음 에탄올을 제거하고 세척을 두 번 더 반복합니다. 샘플을 6분 동안 자연 건조시킵니다.

튜브 바닥에 더 많은 에탄올이 수집되었는지 간헐적으로 확인하고 그에 따라 제거하십시오. 구슬을 적절하게 건조시키는 것이 중요하다는 것을 기억하십시오. 비드가 충분히 건조되지 않으면 에탄올이 용리액과 함께 운반되어 총 수율을 감소시킬 수 있으며, 과도하게 건조된 비드는 RNA를 소실할 수 있습니다.

샘플이 건조되는 동안 19마이크로리터의 용해 버퍼 2와 1마이크로리터의 Rnase 억제제를 결합하여 10x 반응 버퍼를 준비합니다. 잠시 스핀다운하고 얼음 위에 두십시오. 샘플이 건조되고 비드 펠릿이 더 이상 광택이 나지 않으면 자기 분리기에서 튜브를 제거하고 9.5마이크로리터의 Rnase-free H2O를 추가하여 샘플을 재수화합니다.

그런 다음 샘플을 얼음 위에 놓고 각 샘플에 1마이크로리터의 10x 반응 버퍼를 추가합니다. 이 이미지는 망막의 신경절 세포층을 보여주며, 전체 산 망막 준비에서 IR-DIC를 사용하여 시각화되었습니다. GFP 양성 신경절 세포를 확인하기 위해 약 480나노미터에서 상형광으로 동일한 제제를 시각화했습니다.

이 이미지는 패치 클램프 기록을 위해 표적이 되고 형광 추적자로 채워진 GFP 양성 세포를 보여줍니다. 내부 망상층의 온/오프 아층에서 이미징된 ipRGC 수상돌기의 컨포칼 이미지를 통해 이러한 세포 유형을 분류할 수 있습니다. 이 bioanalyzer 출력은 역전사, 증폭 및 정제를 거친 라이브러리의 예를 보여줍니다. 1-3열은 이상적인 DNA 도말 검사를 나타내고, 4열은 제대로 처리되지 않은 샘플을 나타냅니다.

control lane에는 35bp 및 10380bp의 마커 크기에서 두 개의 깨끗한 피크가 포함되어야 합니다. 다음은 약 2kb의 고강도로 성공적으로 준비된 라이브러리의 자세한 추적입니다. 이 추적은 또한 성공적인 준비를 보여주지만 도말은 약 500bp에 집중되어 있습니다.

이 이미지는 샘플의 태깅, 증폭 및 정제 후 bioanalyzer 출력을 보여줍니다. 성공적으로 태깅된 샘플의 자세한 추적은 레인 1의 샘플에 해당하는 여기에서 볼 수 있습니다. 불완전한 태깅은 여기에서 볼 수 있는 것과 같은 흔적을 생성하며, 새로운 희석으로 재태깅을 보증합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 손상되지 않은 망막에서 형광 표지된 세포 유형에서 RNA를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 RNA는 분해에 매우 민감하며 건강한 망막 세포를 갖는 것이 핵심이라는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라 qPCR, NC2 혼성화 또는 면역조직화학과 같은 다른 방법을 수행하여 식별된 유전자가 주어진 세포 아형에 특이적인지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 신경 과학 분야의 연구자들이 다양한 뇌 영역에서 뉴런의 이질성을 이해하려고 노력하는 길을 열었습니다. 이러한 이질성을 이해하면 분자적으로 확인된 집단의 세포 기능 및 연결성에 대한 향후 연구를 수행할 수 있습니다.