무선 표지 된 GTP 결합을 통한 G- 단백질 결합 수용체 신호 측정

이 절차의 전반적인 목표는 G-단백질 결합 수용체 또는 GPCR을 포함하는 세포막을 분리하고 기능적 GTP 결합 에세이를 사용하여 GPCR 약리학을 연구하는 것입니다. 이 방법은 확립되거나 분리된 G-단백질 결합 수용체의 약리학적 특성에 관한 생화학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 주요 장점은 간단하고 빠르며 G-단백질 결합 수용체 신호 전달에서 가장 근접한 이벤트를 측정한다는 것입니다.

먼저, 인간 배아 신장 세포를 10cm 조직 배양 플레이트에 10ml의 완전한 DMEM으로 플레이트합니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소에서 70%에서 80%의 포화도에 도달할 때까지 세포를 배양합니다. 배양 후, 제조업체의 지침에 따라 적절한 transfection 시약을 사용하여 HAMOR1로 세포를 transfection합니다.

그런 다음 앞서 설명한 대로 36-48시간 동안 세포를 배양합니다. 인큐베이터에서 형질주입된 세포를 제거한 후, 배지를 흡인하고 5ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 헹굽니다. 그런 다음 플레이트에서 PBS와 여분의 액체를 흡입합니다.

다음으로, 600마이크로리터의 버퍼 1을 셀에 추가합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트 표면에서 세포를 제거하고 세포 현탁액을 1.6ml 마이크로 원심분리 튜브에 피펫팅합니다. 즉시 마이크로 원심분리기 튜브를 액체 질소로 스냅 동결합니다.

샘플이 얼면 얼음에서 용해물을 해동합니다. 용해물이 해동되면 단일 펄스 마이크로튜브 균질기를 사용하여 세포를 분리합니다. 균질화기를 10초 동안 3-5회 펄싱합니다.

펄스 사이에 30초 동안 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 그 후, 1, 000 번 g 및 섭씨 4도에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리하십시오. 그런 다음 상층액을 얼음 위의 새로운 1.6ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

100마이크로리터의 완충액 1에 입천장을 다시 현탁시킵니다. 샘플을 다시 균질화하고 균질기를 5초 동안 3-5회 펄스하고 펄스 사이에 30초 동안 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 표본을 두번째로 원심 분리하기 후에, 11의, 000배 g 및 4 섭씨 온도에 20 분 동안 상등액 그리고 분리기를 결합하십시오.

상층액을 새로운 1.6ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 200마이크로리터의 버퍼 2에 다시 현탁합니다. 그런 다음 입천장을 3-5회 분쇄하여 입천장을 균질화합니다.

샘플을 원심분리하고 상층액을 흡인시킨 후, 조막파를 포함하는 구개를 50마이크로리터의 버퍼 2에 다시 현탁시킵니다. 묽은 스톡 S35GTP 감마 S를 50 나노 몰 및 10 밀리 몰 추적 HCl 및 10 밀리 몰 DTT로 희석합니다. 결합 실험을 위해 250마이크로리터 시간 쿼트를 만들고 원하는 경우 보관을 위해 급속 동결합니다.

다음으로, 1 밀리 몰 DTT, 0.1 % BSA, 10 마이크로 몰 GTP 및 0.1 나노 몰 S35GTP 감마 S의 최종 농도를 포함하도록 불완전 결합 완충액을 보충하여 완전 결합 완충액 또는 CBB를 준비합니다. 얼음에서 막 분획을 해동 한 후 밀리리터 당 100 마이크로 그램의 농도로 희석하고 불완전한 결합 완충액. MOR1을 통한 GTP 결합에 대한 펩타이드 DAMGO의 효과를 에세이로 작성하려면 일련의 DAMGO 희석액과 CBB를 최종 부피 100마이크로리터로 준비합니다. 바질 GTP 결합을 평가하려면 100마이크로리터의 CBB가 있는 1.6ml 마이크로 원심분리기 튜브를 준비합니다.

비특이적 결합을 평가하기 위해, 1.6 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브와 99 마이크로 리터의 CBB를 준비하고, 1 마이크로 리터의 2 밀리 몰 비 방사형 표지 GTP 감마 S.Now를 보충하고, 100 마이크로 리터의 희석 멤브레인 용액을 각 샘플에 첨가하십시오. 섭씨 25도에서 300rpm의 온도 혼합기에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 유리 섬유 필터를 증류수에 10분 동안 미리 담가둡니다.

써모 믹서에서 샘플을 제거한 후 5초 동안 간단히 펄스 스핀하여 튜브 바닥에 있는 각 샘플을 수집합니다. 그런 다음 진공 여과 장치의 뚜껑을 제거하고 미리 담근 필터를 장치의 진공 포트에 놓습니다. 장치 덮개를 다시 고정하여 진공 밀봉을 형성하고 진공 청소기를 켭니다.

각 시료 195마이크로리터를 필터에 피펫팅합니다. 1ml의 얼음 찬 세척 버퍼로 필터를 세 번 세척합니다. 5ml의 섬광 계수 바이알을 계수 랙에 놓습니다.

각 바이알에 5ml의 섬광 유체를 추가합니다. 그런 다음 진공 청소기를 끄고 진공 여과 장치의 뚜껑을 제거합니다. 핀셋을 사용하여 여과 장치의 진공 포트에서 필터를 집어 올리고 각 필터를 섬광 바이알에 떨어뜨립니다.

각 바이알의 뚜껑을 단단히 씌운 후 섭씨 25도의 궤도 셰이커에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 섬광 카운터를 켜고 표준 관련 섬광 프로그램을 사용하여 샘플당 5분 동안 황 35 동위원소 방출을 측정하도록 카운터를 프로그래밍한 다음 시작을 눌러 고려합니다. 자가 분획법은 핵 단백질 히스톤 h2b 및 세포질 단백질 글리세롤에서 막 단백질을 깨끗하게 분리하여 3 개의 인산염 탈수소 효소를 숨 깁니다.

단백질은 각각의 세포 내 분획(sub-cellular fractions)에서 풍부합니다. Ponceau 염색의 대표자는 각 분획에서 동일한 단백질 로딩을 보여줍니다. EC50 및 hill coefficient와 같은 GTP 결합 실험을 통해 GPCR 리간드 상호 작용을 특성화하기 위해 여러 약리학적 매개변수를 구동할 수 있습니다.

DAMGO 처리 후 MOR1에 대한 반응성 GTP 결합이 여기에 입증되어 있습니다. 이 플롯은 MOR1 G-단백질 신호전달에 대한 날록손의 길항작용에서 DAMGO의 작용제 활성을 보여줍니다. 이 기술은 일단 숙달되면 실험 조건의 수에 따라 2시간에서 4시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 GPCR 리간드 농도를 예상 EC50보다 최소 5배 이상 높거나 낮게 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 관심 리간드와 구조적으로 유사한 분자를 평가하면 수용체의 리간드 프로파일을 정의하는 리간드의 중요한 구조적 부분을 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 약물 발견에 도움이 되었으며 연구자들이 편향된 작용작용과 같은 GPCR 신호의 자세한 측면을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 무선 표지 GTP를 사용하여 세포막을 분리하고 GPCR의 약리학적 특성을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 방사선으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 적절한 방사선 실험복을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

이 절차를 수행하기 전에 방사능 작업에 대한 기관 지침을 검토해야 합니다.