수술 절제 분석 플라나리아에 아이 재생을 유학을위한

이 절차의 전반적인 목표는 뇌나 주변 조직을 방해하지 않고 플라나리아 광학 컵을 안정적으로 제거하여 모든 교육 수준의 연구자와 학생들이 이 기술을 구현할 수 있도록 하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법은 생체 내에서 내인성 안구 줄기세포 유지 및 분화를 조절하는 메커니즘을 결정하는 것과 같은 재생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 연구자가 다른 조직의 방해를 최소화하면서 눈 조직만 제거할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인이 정확한 양의 조직을 안정적으로 제거하여 주변 조직의 절제를 피하면서 눈 전체를 절제하기 전에 연습이 필요합니다. 시작하려면 최소 일주일 동안 먹이를 먹지 않았고 길이가 5-7mm 이상인 벌레를 선택하십시오. 15-30 개의 지렁이를 100mm 페트리 접시에 옮기고 지렁이 물을 2/3 정도 채우고 즉시 덮개를 교체하십시오.

흰 머리나 꼬리와 같이 기생충이 없거나 색소가 없는 조직이 있는지 관찰하여 손상되지 않았는지, 최근에 재생되지 않았는지 확인합니다. 먼저 작업 공간과 해부 현미경 베이스를 70% 에탄올 용액으로 닦고 완전히 건조시킵니다. 선택한 벌레가 있는 접시를 현미경의 왼쪽에 놓습니다.

그런 다음 현미경의 오른쪽에 한 쌍의 숫자 5 집게, 1밀리리터 주사기가 있는 31게이지 5/16인치 인슐린 바늘, 깨끗한 전사 피펫 및 절제된 벌레를 수집하기 위한 라벨이 붙은 12웰 플레이트를 놓습니다. 보푸라기가 없는 티슈 물티슈 한 상자, 신선한 지렁이 물로 채워진 플라스틱 세척 병, 추가 전사 피펫을 놓아 수술 중에 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 해부 현미경 베이스의 중앙에 펠티에 플레이트를 배치하고 DC 전원의 출력을 설정하여 펠티에 플레이트의 표면이 웜을 고정할 수 있을 만큼 충분히 냉각되도록 합니다.

또는 펠티에 플레이트 대신 얼음을 채운 페트리 접시를 사용할 수 있습니다. 수술 표면을 준비하려면 먼저 5cm x 10cm 크기의 플라스틱 파라핀 필름을 절단하여 펠티에 플레이트 중앙에 놓습니다. 다음으로, 보푸라기가 없는 티슈 와이프를 약 2cm의 정사각형으로 접고 필름 위에 놓습니다.

그런 다음 접힌 물티슈를 제자리에 잡고 지렁이 물을 적신 다음 전사 피펫으로 물티슈를 평평하게 굴립니다. 마지막으로 1.5-2cm 제곱의 흰색 여과지 조각을 자르고 닦음 위에 놓습니다. 수술을 시작하려면 전사 피펫을 사용하여 한쪽 벌레 등쪽을 위로 향하게 하여 여과지 위에 놓습니다.

조명을 켜고 웜에 빔을 집중시킵니다. 벌레의 눈이 명확하게 보이도록 해부 현미경의 초점과 배율을 조정합니다. 파라핀 필름을 회전하여 웜의 머리가 연구원을 향하고 오른쪽으로 30-40도 각도가 되도록 웜의 위치를 조정합니다.

벌레가 복부 쪽이 위를 향하도록 배치되고 인두 입구가 보이는 경우 집게의 둔한 면을 사용하여 눈이 보이는 등 쪽이 위로 향하도록 벌레의 위치를 부드럽게 변경합니다. 눈에 명확하게 초점이 맞도록 현미경 설정을 다시 조정합니다. 또한 눈과 주변 머리 조직이 모두 보이는지 확인하십시오.

깨끗한 주사기를 오른손으로 엄지와 검지 사이에 놓습니다. 펠티에 플레이트에 고정하여 왼쪽 엄지 손가락으로 주사기의 바닥 부분을 받칩니다. 현미경을 통해 바늘의 경사가 보이는지 확인하십시오.

왼쪽 검지 손가락을 수술 표면에 대고 왼쪽 엄지 손가락과 40도 각도를 이루도록 하여 수술 중에 표면이 안정적으로 유지되도록 합니다. 바늘의 경사가 위를 향하도록 바늘을 눈에 90도 각도로 놓습니다. 바늘 끝으로 눈의 시신경컵 위에 있는 얇은 조직층을 부드럽게 침투시켜 흰색의 색소가 없는 영역으로 보입니다.

오른쪽에서 왼쪽으로 퍼서 광학 컵 안에 있는 검은색 색소 조직과 모든 흰색 조직을 매우 부드럽게 제거합니다. 쌍안 절제술을 시행하는 경우 지금 두 번째 눈을 절제하십시오. 수술 완료 후 피펫에 소량의 지렁이 물을 다시 넣고 물을 지렁이에 방출하여 여과지에서 들어 올립니다.

즉시 웜을 전사 피펫에 넣습니다. 지렁이를 신선한 지렁이 물로 가득 찬 라벨이 붙은 12웰 플레이트로 옮깁니다. 모든 지렁이가 옮겨지면 우물의 물을 신선한 지렁이 물로 교체하여 씻으십시오.

빛으로부터 보호되는 벌레를 섭씨 20도의 인큐베이터에서 배양하고 재생 과정을 모니터링합니다. 살아있는 지렁이를 희생하려면 접시에서 지렁이 물을 제거하고 70% 에탄올로 교체하십시오. 3-5분 동안 벌레를 배양하고 벌레가 용해되어 회색으로 변하는지 관찰합니다.

여기에 제시된 사진은 쌍안 절제술과 한쪽 눈 절제를 받은 편형동물의 사진으로, 수술 전, 4일 후, 2주 후에 촬영한 것입니다. 이미지는 시간 경과에 따른 재생 진행 상황을 보여줍니다. 절제된 기생충의 안구 재생은 또한 어레스틴과 새로 개발된 광수용체 뉴런의 면역조직화학적 염색에 의해 확인되었습니다.

이중 눈 절제 후 편형동물의 시각 체계 회복은 빛에 대한 야생형 광공포증 반응을 기반으로 한 기능 분석에서도 연구되었습니다.절제 후 24시간이 지나면 눈이 없는 기생충은 빛을 피하지 않고 밝은 반점을 통해 이동합니다. 광선 공포증은 시술 후 7일이 지나면 회복되며, 이는 재생된 시각 시스템이 기능하고 있음을 나타냅니다.

일단 숙달되면 한 마리의 기생충에 대한 이중 눈 절제 절차는 약 3분 동안 완료할 수 있습니다. 배설할 때는 눈의 색소 조직과 색소 침착되지 않은 조직을 모두 절제하는 동시에 눈 사이의 조직을 손상시키거나 나중에 눈으로 조직을 찢어버리지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 특정 유전자의 역할과 재생 과정을 조사하기 위해 면역조직화학(immunohistochemistry) 및 RNA 간섭(RNA interference)과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

또한 재생 후 눈 기능을 테스트하기 위해 행동 분석을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 주변 조직을 방해하지 않고 플라나리아의 눈을 절제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 주삿바늘로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 장갑을 끼고 주삿바늘이 몸에서 멀어지도록 하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.