Name: Zebrafish에서의 급성 알코올성 간 손상의 조직 학적 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 학습하세요 급성 알코올성 간 손상의 조직학적 분석 방법을 Danio rerio 유생을 이용하여. 2% 에탄올 처리로 지방변성과 혈관 부종을 유도하고 조직 완전성을 개선하는 이 기법은 알코올성 간 질환 연구에 활용됩니다.

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저자는 Zebrafish International Resource Center의 Dr. Katy Murray를 인정하고자합니다. 프로토콜에 대한 도움을 준 CCHMC의 Stacey Huppert 박사와 Kari Huppert 박사; 및 CCHMC 수의 진료 서비스를 제공합니다. 이 연구는 NIH 보조금 R00AA020514와 CCHMC의 소아과 유전체 센터 (CY) 연구 보조금에 의해 지원되었습니다. 그것은 또한 신시내티의 소화기 질환 연구 핵심 센터의 NIH 교부금 P30 DK078392 (통합 형태 골격)에 의해 부분적으로 지원되었다.

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저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

현재의 프로토콜은 제브라 피쉬 애벌레에서의 급성 에탄올 처리 및 H &amp; E 염색으로 인한 조직 병리학 적 분석을위한 상세한 절차를 기술한다. 급성 에탄올 치료는 제브라 피쉬 간이 알코올 대사 효소를 발현하기 시작하기 때문에 수정 후 96 시간 이내에 시행해야합니다 13 . 2 % 에탄올은 유충이 13 , 14 를 견딜 수있는 최대 투여 량입니다. 에탄올 처리 된 유충은 치료 8 시간까지 간 지방증을 보이기 시작하고 지방 증을 보이는 유충의 비율은 지속적인 치료 24 시간까지 계속 증가한다 14 . Zebrafish 애벌레는 120 hpf까지 노른자에서 독점적으로 양분을 흡수합니다. 따라서 120 hpf를 넘는 에탄올 치료는 권장하지 않습니다. 왜냐하면 금식은 지방증에도 기여할 수 있기 때문입니다. 다른 실험실에서 출판 된 프로토콜과...

알코올 과다 복용으로 인한 알코올 중독 (Alcoholic Liver Disease, ALD)은 알코올과 관련된 이환율 및 사망률의 주요 원인입니다. 미국에서는 간 질환으로 인한 사망의 거의 절반이 알코올 1 을 포함하고 있으며 ALD는 간 이식 3 건 중 거의 1 건을 담당하고 있습니다 2 . ALD는 광범위한 스펙트럼을 가지고 있습니다. 간세포는 과도한 지질 축적으로 특징 지어지며, 과도한 음주의 초기 단계에서 발생하며 알코올 사용을 중단하면 되돌릴 수 있습니다. 유전 적 및 환경 적 요인의 영향과 지속적인 알코올 섭취로 인해 간 지방증은 알콜 성 간염으로 진행될 수 있으며 결국에는 간경변 3이 될 수 있습니다. 설치류 ALD 모델을 이용한 연구는 질병에 대한 상당한 통찰력을 제공해 왔지만 제한이있다 (참고 문헌 3 에서 검토). 알코올 다이어트의 경구 섭취는 설치류에서 지방증을 일으 킵니다 4 ,/ sup&gt; 5 . 염증과 섬유화의 발달에는 침략적이고 기술적 인 도전 인 제 2 모욕 6 , 7 또는 만성 위 내 주입이 필요합니다 8 , 9 . 텔레스트로 제브라 피쉬는 또한 만성 및 급성 알코올 치료 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 에 대한 반응으로 간 손상을 일으 킵니다. 특히, 유생 제브라 피쉬는 급성 알코올성 간 손상 10 , 11 , 13 , 15 를 연구 할 수있는 매력적인 보완 모델 유기체를 대표합니다. 제브라 피쉬 간은 기능적이며 에탄올 대사에 중요한 효소를 4 일까지 생산합니다s post-fertilization (dpf) 13 , 16 , 17. 에탄올은 물에 직접 첨가 할 수 있으며 24 시간 동안 2 % 에탄올에 노출하면 제브라 피쉬 애벌레 13 , 15 에서 간 지방증과 섬유화 반응을 유도하기에 충분합니다. 24 시간 동안 2 % 에탄올로 처리하면 제브라 피쉬 애벌레에서 조직 에탄올 농도가 80 mM이되는 것으로보고되었습니다. 다른 사람들은 애벌레가이 농도를 용인하고 처리 된 동물에서 보이는 간 표현형이 에탄올 노출에 특유하다는 것을 보여주었습니다 11 , 13 , 15 , 18 . 그러나 80 mM은 사람에게 거의 치사되기 때문에 에탄올 처리 된 제브라 피쉬의 간 조직학을 평가하고인간과 생리적 인 연관성을 찾으십시오. 빠른 제브라 피쉬 애벌레의 외부 발달과 반투명은 실시간 및 고정 표본에서 간 내의 알코올 작용을 특성화하는 것을 가능하게합니다. 세포 유형 특이 적 형광 형질 전환 계통의 이용 가능성과 공 촛점 현미경 검사법의 최근 진보는 급성 에탄올 치료 11,15에 대한 반응으로 간세포 유형이 형태 및 행동을 어떻게 변화시키는 지에 대한 연구를 용이하게한다. 그러나 형광 형질 감염 제브라 피쉬의 공 촛점 이미징은 간 조직학을 연구 할 때 Hematoxylin과 Eosin (H &amp; E) 염색을 완전히 대체 할 수 없습니다. 트랜스 제닉 제브라 피쉬를 사용하여 모든 간 세포 유형을 동시에 표시하려면 개개의 트랜스 제닉 라인을 생성해야하며, 각 트랜스 제닉 라인은 고유 한 형광 단이있는 간 세포 유형을 표시합니다. 같은 물고기에 다른 형질 전환 배경을 도입하는 것은 breedin을 필요로한다.g 세대가 필요하며, 이는 많은 시간과 비용이 소요됩니다. 세포 외 기질 성분을 검출하기 위해서는 추가적인 면역 형광 염색이 필요합니다. 반면에 H &amp; E 염색법은 모든 간세포 유형과 세포 외 기질 성분을 동시에 표시하여 간의 개요를 제공합니다 20 . 또한 간세포 폐사, 지방증, 섬유증과 같은 간 질환의 여러 병리학 적 특징을 쉽게 알 수 있습니다. H &amp; E는 포유류의 간 조직학에서 일상적인 얼룩이지만, 제브라 피쉬 간 연구에 일반적으로 사용되지는 않으며 프로토콜이 잘 확립되지 않습니다. 이 연구는 제브라 피쉬 애벌레에서의 급성 에탄올 처리 및 H &amp; E 염색을 사용한 후속 조직 검사를위한 프로토콜을 설명합니다. H &amp; E 염색 프로토콜은 간 개발 및 기능에 대한 모든 연구에 사용될 수 있습니다. 또한, 파라핀 절편은 면역 조직 화학뿐만 아니라 다른 특수한 역에 사용될 수 있습니다trichrome stain, reticulin stain 등 간 병리학 적 특징.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 원심분리기 튜브</td><td>E & K Scientific</td><td>280150</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 코니컬 튜브</td><td>VWR International</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 코니컬 튜브</td><td>VWR International</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>95% 에탄올(EtOH)</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2801</td><td>가연성</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>신규 이민자 공급</td><td>10010A</td><td>자극성</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products International</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 항아리 랙 홀더</td><td>신규 공급</td><td>5300JRK</td><td></td></tr><tr><td>세균 페트리 접시 뚜껑</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>생검 패드</td><td>Simport</td><td>M476.1</td><td></td></tr><tr><td>충전 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-16</td><td></td></tr><tr><td>투명 마운팅 미디어</td><td>Fisher Scientific</td><td>8310-16</td><td>다른 투명 마운팅 미디어로 대체 가능</td></tr><tr><td>상업용 바다 소금</td><td>인스턴트 오션</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>일회용 마이크로톰 블레이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>4280L</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica Mz 95</td><td></td></tr><tr><td>밀폐형 조직 처리기</td><td>Leica Biosystems</td><td>ASP300 S</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Phloxine stain set</td><td>Newcomer Supply</td><td>1082A</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>가연성</td></tr><tr><td>포름알데히드 용액, ACS 시약, 37 WT. H20의 %, 안정제로 10 - 15% 메탄올 함유(중합 방지용)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>발암 의심 물질; 자극성</td></tr><tr><td>포르말린, 완충형, 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>발암 의심 물질; 자극성</td></tr><tr><td>눈금 미디어 병</td><td>VWR International</td><td>16159-520</td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxylin</td><td>Poly Scientific R& D 주식회사</td><td>s212</td><td>자극성</td></tr><tr><td>조직학 금형</td><td>Sakura Finetek USA Inc</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>핫 플레이트/교반기</td><td>VWR International</td><td>47751-148</td><td></td></tr><tr><td>염산(HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144</td><td>자극성</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>VWR International</td><td>97058-220</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>BD Medical</td><td>BD-309301</td><td></td></tr><tr><td>반전 복합 현미경</td><td>Carl Zeiss 현미경</td><td>491912-9850-000</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>신규 공급</td><td>12094E</td><td>가연성</td></tr><tr><td>메틸렌 블루</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>자극성</td></tr><tr><td>마이크로톰</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica Jung BioCut 2035&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>너트 믹서</td><td>VWR International</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드 (PFA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td>의심되는 발암 물질; 자극성</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>VWR International</td><td>53283-916</td><td></td></tr><tr><td>피펫 펌프 (10 mL)</td><td>VWR International</td><td>53502-233</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨, 일염기성(KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Grainger</td><td>4A807</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 염색 키트</td><td>신규 공급</td><td>5300KIT</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨(NaOH)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>S318-500</td><td>매우 위험한</td></tr><tr><td>인산나트륨, 이염기성(Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스강 스트레이너(직경 5인치)</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>L0906045in</td><td></td></tr><tr><td>조직 카세트</td><td>Simport</td><td>M505.12</td><td></td></tr><tr><td>조직 포매 센터</td><td>Sakura Finetek USA Inc</td><td>#5100</td><td></td></tr><tr><td>조직 와이퍼, 1-플라이</td><td>Fisher Scientific</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>트랜스퍼 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>137117M</td><td></td></tr><tr><td>트리카인 분말/에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>자극성</td></tr><tr><td>트리스 염기, 기본 표준 및 버퍼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>세척 병, 저밀도 폴리에틸렌, 넓은 입</td><td>Nalge Nunc International</td><td>2402-0750</td><td></td></tr><tr><td>크실렌</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>X3S-4</td><td>자극제</td></tr></tbody></table>

zebrafish에서의 급성 알코올성 간 손상의 조직 학적 분석

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

알콜 성 간 질환 (ALD)은 급성 또는 만성 알코올 남용으로 인한 간 손상을 의미합니다. 그것은 알코올 관련 이환 및 사망의 주요 원인 중 하나이며 미국에서 2 백만 명이 넘는 사람들에게 영향을 미칩니다. 알콜로 유발 된 간 손상의 근본적인 세포 및 분자 메커니즘에 대한 더 나은 이해는 ALD에 효과적인 치료법을 개발하는 데 중요합니다. Zebrafish의 유충은 2 % 에탄올에 24 시간 방치 한 후 간 지방증과 섬유화를 나타내어 급성 알코올 중독 손상 연구에 유용합니다. 이 연구는 제브라 피쉬 애벌레에서 급성 에탄올 처리를위한 절차를 설명하고 그것이 간 혈관의 지방증과 붓기를 유발한다는 것을 보여줍니다. 제브라 피쉬 애벌레 간 조직 학적 분석을 위해 최적화 된 Hematoxylin 및 Eosin (H &amp; E) 염색에 대한 자세한 프로토콜도 설명합니다. H &amp; E 얼룩에는 면역 형광보다 몇 가지 독특한 이점이 있습니다.er 세포 및 세포 외 성분을 동시에 검출 할 수 있고 지방증 및 섬유증과 같은 간 손상을 용이하게 검출 할 수있다. 유전 독성 및 바이러스 유발 간 손상 및 유전성 간 질환에 대한 제브라 피쉬 사용의 증가를 감안할 때이 프로토콜은 이러한 모든 연구에서 수행 된 조직 학적 분석을위한 참고 자료로 사용됩니다.

10 % 완충 포르말린과 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)는 조직학 관행에 사용되는 가장 보편적 인 고정물의 두 가지입니다. 그러나, 그들은 제브라 피쉬 간 조직에 대한 최적의 고정 결과를 제공하지 않습니다 ( 그림 1 및 표 1 ). 10 % 포르말린 또는 4 % PFA로 고정하면 수축이 생겨 간과 주변 조직 사이에 큰 틈이 생깁니다 ( 그림 1A , B , 그림 1B 는 조직 수축의 한 예입니다). 간 조직의 일부가 또한 섹션에서 빠져 나올 수 있습니다. 간세포의 세포질은 흔히 소실됩니다 ( 그림 1A , 1B ). 두 fixatives 모두는 수축 또는 팽윤되...

이 프로토콜은 24 시간 동안 2 % 에탄올로 치료 zebrafish의 유충에서 간 조직 분석을 설명합니다. 이러한 급성 에탄올 처리는 간 지방증 및 간 혈관계의 팽창을 초래한다.

Zebrafish에서의 급성 알코올성 간 손상의 조직 학적 분석

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

이 실험의 전반적인 목표는 급성 에탄올 자극으로 인해 발생하는 제브라피시 치어 간의 병리 조직학적 특성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 급성 알코올성 간 손상의 조직학적 특징과 제브라피시 간의 급성 알코올 손상 반응이 인간의 반응과 어느 정도 유사한지와 같은 알코올성 간 질환 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 본 실험의 에탄올 처리 방식이 기존에 발표된 다른 방법들보다 더 강력한 반응을 유도한다는 점입니다.또한, 본 조직학 프로토콜은 절편의 조직 무결성을 향상시킵니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 부레가 팽창된 수정 후 96시간 된 치어를 최대 40마리까지 선택하는 것으로 시작하십시오. 선택한 치어를 두 개의 새 페트리 접시에 균등하게 나누어 담으십시오.잔류 난수를 가능한 한 많이 제거한 다음, 한쪽 디쉬에는 2% ethanol이 포함된 난수를 밀리리터당 유충 1마리의 밀도로 추가합니다. 대조군으로 사용할 다른 쪽 디쉬에는 ethanol이 포함되지 않은 난수를 동일한 양으로 추가합니다. 대조군과 ethanol 처리된 유충을 어실에 24시간 동안 보관합니다.24시간이 경과한 후, 튜브당 20마리 이하의 유충을 1.5-milliliter 원심분리 튜브에 수집합니다. 화학 흄후드 내에서 유충으로부터 가능한 한 많은 액체를 제거한 다음, 최소 1 milliliter의 Dietrich 고정액을 첨가합니다. 실온의 너테이터(nutator)에서 유충을 최소 24시간 동안 고정합니다.조직 카세트와 카세트당 2개의 청색 생검 패드를 준비합니다. 각 카세트 바닥에 생검 패드 하나를 넣습니다. 각 카세트에 샘플을 명확히 식별할 수 있도록 연필로 라벨을 작성합니다.흄 후드 내에서 작업하면서 튜브에서 고정액을 제거하고, 1 mL의 PBS로 유충을 5분씩 3회 세척합니다. 세척하는 동안 튜브를 상온의 nutator에 둡니다. 세척 과정 중에 전자레인지를 사용하여 물에 넣은 3% agarose를 가열해 고체를 녹입니다.한 번에 30초 동안 가열하며, 끓어오름을 최소화하기 위해 주의 깊게 관찰하십시오. 완전히 용해되면, 액체 아가로스를 90 °C로 설정된 핫플레이트에 놓고 부드럽게 저어줍니다. 전송 피펫을 사용하여 최대 8마리의 유충을 플라스틱 조직학적 몰드에 옮기고, PBS를 최대한 제거하십시오.팁을 잘라낸 트랜스퍼 피펫을 사용하여 몰드에 3% agarose를 완전히 채운 다음, 인슐린 주사기를 사용하여 유충들을 몰드의 중앙으로 모으고 바닥 쪽으로 밀어 넣습니다. 시상단면(sagittal sections)을 얻으려면 유충의 머리가 몰드 상단을 향하도록 일렬로 배치합니다. 간의 방향을 일정하게 유지하기 위해, 유충의 몸 왼쪽 면이 아래를 향하여 몰드 바닥에 평평하게 닿도록 돌려줍니다.아가로스가 4~5분 동안 굳은 후, 몰드에서 아가로스 블록을 꺼내고 면도날을 사용하여 유충 주변의 아가로스를 다듬습니다. 블록을 세운 상태에서 두께를 절반으로 잘라 최종 블록의 두께가 약 2~3 mm가 되도록 합니다. 작은 아가로스 블록을 준비된 조직 카세트에 옮기고, 블록 위에 두 번째 생검 패드를 올립니다.카세트를 닫고, 완전히 조립된 카세트를 이중 증류수로 신선하게 준비한 70% ethanol이 담긴 밀폐 용기에 넣습니다. 조직을 파라핀 임베딩한 후, 마이크로톰을 사용하여 조직이 파라핀 블록 표면에 노출될 때까지 한 번에 5 µm씩 절편을 만들어 조직을 덮고 있는 과잉 파라핀을 제거한 다음, 절단된 모든 절편은 중단하고 폐기합니다. 블록의 절단면이 아래로 향하게 하여 PBS에 담그고, 4 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다.다음 날, PBS에서 블록을 하나씩 꺼내어 마이크로톰(microtome)을 사용하여 5 µm 두께로 절편을 제작합니다. 핀셋이나 브러시를 이용해 마지막 절편을 날로부터 조심스럽게 밀어내어 절편 리본을 날에서 분리합니다. 핀셋으로 리본의 마지막 절편 부분을 잡아 42 °C의 워터배스(water bath)로 옮깁니다.리본이 수면 위에 최소 5분 동안 떠 있게 둡니다. 핀셋을 사용하여 슬라이드에 올릴 수 있도록 섹션들을 작은 그룹으로 나누어 줍니다. 전하를 띤 슬라이드를 45도 각도로 물에 넣고, 수집하려는 섹션 그룹 아래에 조심스럽게 위치시킵니다.슬라이드를 물에서 조심스럽게 들어 올려 절편이 슬라이드에 부착되도록 합니다. 보풀 없는 티슈를 사용하여 절편의 과잉 수분을 닦아냅니다. 슬라이드를 슬라이드 홀더 또는 보관함에 넣습니다.원하는 조직이 수집될 때까지 블록 섹셔닝을 계속합니다. 완료 후, 파라핀을 녹이기 위해 슬라이드를 55 °C 인큐베이터 또는 오븐에서 3~16시간 동안 베이킹합니다. 지정된 시간이 지난 후 파라핀이 녹았는지 확인하고, 염색 전에 슬라이드를 식힙니다.슬라이드를 100% xylene에 15분씩 두 번 담가 탈파라핀화한 후, 에탄올 농도 기울기를 통해 슬라이드를 재수화합니다. 각 용액당 액체가 슬라이드에서 깨끗하게 흘러내릴 때까지 2초씩 8~10회 담급니다. 슬라이드를 100% 여과된 Harris Hematoxylin에 4분 동안 둡니다.4분 후, 섹션들을 신속하게 탈이온수 용기로 다시 옮깁니다. 섹션들로부터 가장 멀리 떨어진 용기 뒷구석에 탈이온수를 흘려보냅니다. 물이 더 이상 보라색을 띠지 않을 때까지 주기적으로 용기를 비워줍니다.구즈넥 라이트가 장착된 실체 현미경을 사용하여 헤마톡실린(Hematoxylin) 염색 강도를 빠르게 확인합니다. 추가 염색이 필요한 경우 슬라이드를 100% Hematoxylin 용액에 1분 동안 다시 넣습니다. 원하는 Hematoxylin 염색 결과가 얻어지면, 슬라이드를 0.05% 염산(hydrochloric acid)에 두 번 담근 후 즉시 깨끗한 탈이온수가 담긴 용기로 옮깁니다.용기의 내용물을 비우고 물로 두 번 채워 헹굽니다. 슬라이드를 95% ethanol이 담긴 두 개의 용기에 각각 30초 동안 옮겨 둡니다. 슬라이드를 Eosin Y-Phloxine B 용액에 2분 동안 담급니다.2분이 지나면 슬라이드를 이전의 95% ethanol 용기에 다시 옮긴 후, 해부 현미경으로 색의 강도를 확인합니다. 염색이 충분하지 않은 경우, Eosin 용액에 30초 동안 다시 넣습니다. 필요에 따라 이 과정을 반복하십시오.원하는 강도로 염색이 되면, 슬라이드를 100% isopropanol에 15초 동안 옮깁니다. 신선한 100% isopropanol로 교체한 후, 슬라이드를 다시 isopropanol에 15초 동안 둡니다. 이 과정을 총 6회의 isopropanol 세척이 될 때까지 반복합니다.100% xylene에 3분 동안 담근 후, 슬라이드 하나를 꺼냅니다. 절편이 충분히 덮이도록 마운팅 용액을 추가한 다음, 슬라이드를 100% xylene에 담급니다. 슬라이드에 커버슬립을 덮고, 얇은 선만 보일 때까지 종이 타월로 과잉의 마운팅 용액을 닦아냅니다. 그 다음 조직을 xylene에 적셔 슬라이드 뒷면에 묻은 용액을 닦아내어 제거합니다.슬라이드를 판지처럼 튼튼하면서도 이동이 가능한 표면에 평평하게 놓은 뒤, 후드 내에서 10분 동안 자일렌을 증발시킵니다. 이미징 전 마운팅 매질이 굳을 수 있도록 슬라이드를 실온에서 하룻밤 동안 둡니다. 이 수정 후 120시간 된 제브라피쉬 치어의 간은 실온에서 24시간 동안 Dietrich's 고정액에 담가두었습니다.Dietrich 고정액은 이 조직의 최적의 고정을 제공합니다. 10% formalin 고정을 사용하면 간세포의 세포질이 소실되는 경우가 많습니다. 또한, 조직이 Eosin으로 적절하게 염색되지 않으며 보라색으로 나타납니다.4% PFA로 고정한 후, 간세포 사이에 틈이 관찰됩니다. 4% PFA는 간 조직을 수축시켜 간과 주변 조직 사이에 큰 간격이 있는 것처럼 보이게 합니다. 점선은 주변 조직의 경계를 표시합니다.이 고배율 이미지는 에탄올 처리 연구의 일부인 야생형 미처리 대조군 유충 간의 H&E 염색 결과를 보여줍니다. 이 동물 또한 수정 후 120시간에 Dietrich 고정액으로 고정되었습니다. 이 이미지는 수정 후 96시간부터 120시간까지 2% ethanol을 처리했을 때 간에 나타나는 영향을 보여줍니다.이러한 급성 에탄올 처리는 간 지방증과 혈관 부종을 유발합니다. 화살표는 둥근 액적의 과도한 침착이 있는 간세포를 가리키며, 별표는 부어오른 간 혈관을 표시합니다. 이 절차를 수행할 때는 명암 주기가 설정된 어류 사육 시설에서 에탄올 처리를 수행해야 함을 유의하는 것이 중요합니다.H&E 염색의 경우, 최적의 조직 보존을 위해 Dietrich 고정액을 사용하십시오. 또한 과염색 또는 미염색을 방지하기 위해 색상의 강도를 수시로 확인하시기 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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