Vivo에서 스펙트럼-도메인 광학 일관성 단층 촬영 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy와 Cx3cr1^gfp/gfp 기자 쥐의 이미징

이 프로토콜 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 등 어떻게 고해상도 이미징 기술을 설명 하 고 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy에 정보를 얻기 위해 안과 이미징 플랫폼 시스템을 사용 하 여 작은 설치류에 이용 될 수 있다 망막 두께 microglial 각각 유통, 셀.

이 절차의 전반적인 목표는 스펙트럼 영역 광 간섭 단층 촬영과 스캐닝 레이저 검안경을 사용하여 각각 망막 두께와 미세아교세포 분포에 대한 정보를 얻는 것입니다. 이 방법은 망막 이상과 미세아교세포 축적 사이의 상관관계에 대한 실험 안과 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이 정보를 비침습적 방식으로 실시간으로 얻을 수 있다는 것입니다.

각막 면봉에 대한 반응 부족을 확인한 후 마우스를 플랫폼 왼쪽의 엎드린 위치에 놓고 오른쪽 궤도가 렌즈를 향하도록 합니다. 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 한 방울을 플러스 4 디옵터, 경질, 가스 투과성 콘택트 렌즈에 넣고 오른쪽 눈에 바르고 획득 모듈을 시작합니다. B 스캔의 경우, 적외선과 광간섭 단층촬영(Infrared plus Optical Coherence Tomography) 옵션을 선택합니다.Application and Structure(응용 프로그램 및 구조)에서 Retina를 선택하고 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 렌즈를 마우스 눈 쪽으로 이동합니다.

망막에 초점을 맞추기 전에 Oculus Dexter Indicator가 선택되어 있는지 확인한 다음 모니터 화면 왼쪽의 안저 이미지에 큰 혈관이 명확하게 보일 때까지 초점 노브를 사용하여 망막을 확대합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 필요에 따라 카메라의 위치를 조정하고 감도 노브를 돌려 안저 이미지의 밝기를 적절하게 줄이거나 높입니다. 패턴 메뉴에서 라인 스캔을 선택하고 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 스펙트럼 도메인 광 간섭 단층 촬영 또는 SD-OCT 스캔 창의 상단과 하단 모서리 사이에서 B 스캔을 이동합니다.

높은 이미지 품질을 얻으려면 Automatic Real Time(자동 실시간) 값을 9 이상으로 설정하고 Acquire(획득)를 클릭합니다. 모든 이미지를 얻었을 때, 눈에서 콘택트렌즈를 신선하고 균형 잡힌 소금 용액으로 옮기고 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스를 새로 한 방울 떨어뜨려 각막에 수분을 공급합니다. 왼쪽 눈을 이미지화한 후 표준 30도 광학 장치를 시계 반대 방향으로 돌려 제거하고 두 번째 이미징을 위해 55도 렌즈를 장착합니다.

자동 형광을 평가하려면 마우스를 움직이지 않고 제어판에서 적외선을 선택하고 큰 망막 혈관에 초점을 맞춥니다. 자동 형광 이미징을 선택하고 감도 노브를 사용하여 필요에 따라 이미지 밝기를 조정합니다. 감도 노브를 한 번 누르고 자동 실시간 값을 67 이상으로 설정합니다.

자동 실시간 값에 도달하면 이미지를 획득하고 감도 노브를 두 번 눌러 평균화를 중지합니다. 실험적으로 적절하게 다른 망막 층을 시각화하도록 초점을 조정합니다. 모든 이미지가 얻어지면 광학 장치에 광시야 102도 렌즈를 연결하고 방금 설명한 것처럼 각 눈의 자동 형광을 이미지

각 이미지에서 수동 망막 두께를 측정하려면 첫 번째 실험 동물의 이름을 두 번 클릭하여 OCT 스캔을 엽니다.30도 또는 55도 렌즈로 얻은 B 스캔을 열고 두께 프로파일을 선택합니다. Edit Layer Segmentations 아이콘을 클릭합니다.

이 소프트웨어는 내부 제한 멤브레인과 기본 멤브레인을 자동으로 식별합니다. 멤브레인의 위치를 수동으로 수정하려면 수정할 레이어와 빨간색 원 옵션을 선택합니다. 마우스 버튼을 누른 상태에서 해당 레이어가 올바르게 배치될 때까지 원을 이동하여 선을 수정하고 저장 및 닫기를 클릭하여 창을 종료합니다.

레이어 옵션에서 Retina를 선택하고 다이어그램에서 다른 위치를 클릭하여 선택한 위치의 망막 두께를 확인합니다. 그런 다음 망막 두께와 시신경두에서 원하는 거리를 측정하고 값을 스프레드시트로 내보냅니다. Cx3cr1 프로모터 하에서 gfp의 발현을 위해 동형접합체(homozygous)의 생쥐에서 추출한 이러한 대표적인 SD-OCT 단일 스캔에서, 망막 구조는 30도 및 55도 렌즈 이미지 모두에서 명확하게 시각화됩니다.

그러나 맥락막의 높은 반사율은 30도 렌즈로 얻은 스캔에서 관찰됩니다. SD-OCT에 따라 스캐닝 레이저 검안경을 사용하면 102도 렌즈로 얻은 더 큰 안저 면적 범위와 함께 55도 또는 102도 렌즈를 사용하여 망막의 개별 gfp 양성 미세아교세포를 시각화할 수 있습니다. SD-OCT 스캔에서 내부 제한 및 기저 멤브레인 망막 경계를 수동으로 보정한 후 시신경 머리에서 동일한 거리를 측정할 때 일반적으로 30도 및 55도 렌즈 간에 망막 두께 측정의 양호한 상관 관계가 관찰됩니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 50분 이내에 완료할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 실험 안과 분야의 연구자들이 생체 내에서 작은 설치류의 망막 병리학을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.