라이트 사이드에와 서: Vivo에서 당뇨병 털 Murine 모델에 만성 상처에서 녹 농 균 Biofilm 감염의 모니터링

이 새로운 모델의 전반적인 목표는 당뇨병성 마우스의 생물막 상처 감염 및 치유에 대한 실시간 생체 내 모니터링을 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 당뇨병을 앓고 있는 생물막과 숙주 사이의 근본적인 상호 작용이 무엇인지, 그리고 폐쇄에 미치는 영향과 같은 상처 치유 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 시간이 지남에 따라 또는 특정 시점에 동물을 연속적으로 안락사시키지 않고도 생체 내 생물막 진행과 상처 치유에 미치는 영향을 평가할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 만성 상처의 치료, 치료 또는 진단으로 확장되는데, 그 이유는 이 모델이 전신 약물 및 항균 드레싱과 같은 국소 치료를 포함한 다양한 치료법을 테스트하는 데 사용될 수 있기 때문입니다. 부식 연구소의 기술자인 스베틀라나 나비츠카야(Svetlana Navitskaya), 미시간 주립대학교(Michigan State University)의 석사 과정 학생인 캐시 라리비(Cassie Larrivee), MSU의 연구 조교수인 산드라 오라일리(Sandra O'Reilly)가 이 절차를 시연할 예정입니다. 당뇨병을 유발하기 위해, 생후 8주 된 수컷 SKH-1 마우스에게 구연산이 함유된 스트렙토조토신을 매일 5회 연속 복강내 주사합니다.

마지막 주사 후 14일 후에는 혈당계를 사용하여 혈당 모니터링을 통해 고혈당을 확인합니다. 0.5mm 두께의 실리콘 시트에 10mm 원의 윤곽을 그리고, 각 원의 중앙에 5mm 생검 펀치를 하나씩 놓고 펀치를 단단히 눌러 부목으로 사용할 도넛 모양의 디스크를 만듭니다. 가위를 사용하여 투명 폐색 드레싱을 1cm 단위로 자릅니다.

생물학적 안전 후드에서 0.2미크론 기공 크기의 폴리카보네이트 멤브레인 필터를 측면당 15분 동안 UV 살균합니다. 시술 이틀 전, 섭씨 37도, 200rpm에서 하룻밤 동안 트립틱 콩 육수에 생물 발광 P.aeruginosa-Xen41 배양을 접종합니다. 다음 날 아침, 박테리아 세포를 펠릿으로 만들고 세척당 1ml의 DPBS로 3회 세척을 수행합니다.

세 번째 세척 후 새 DPBS에서 박테리아 현탁액을 600나노미터에서 05의 흡광도로 희석합니다. UV 제균 필터를 트립틱 대두 한천 플레이트에 넣고 각 필터에 희석된 박테리아 10마이크로리터를 추가합니다. 멤브레인이 건조되면 플레이트를 섭씨 37도에 놓고 24시간마다 필터를 신선한 트립틱 소두 한천 플레이트로 옮깁니다.

다음 날, 당뇨병을 앓고 있는 SKH-1 동물의 발가락을 꼬집어도 반응이 없음을 확인하고 10% 포비돈 요오드와 이소프로판올 패드로 등을 닦아냅니다. 멸균 4mm 생검 펀치를 사용하여 영구 마커를 사용하여 어깨 높이에서 동물의 정중선 한쪽에 있는 상처의 원형 패턴을 윤곽을 그립니다. 다음으로, 톱니 모양의 집게를 사용하여 윤곽 중앙의 피부를 들어 올리고 홍채 가위를 사용하여 피하 조직을 통해 panniculus carnosus를 포함하여 전체 두께의 상처를 만듭니다.

원형 조직 조각을 절제하고 방수 의료용 피부 접착 접착제를 동물에게 바릅니다. 약한 압력을 사용하여 접착제에 실리콘 부목을 놓고 접착제가 마를 때까지 약 30초 동안 부목을 유지합니다. 그런 다음 투명 폐색 드레싱 중 하나로 상처를 덮고, 수술 후 통증 완화를 위해 피하 주사를 통해 하루에 한 번 이틀 동안 진통제를 투여합니다.

동물을 자체 회복 케이지에 넣습니다.수술 후 48시간이 지나면 멸균 주걱을 사용하여 필터에서 주사기로 여러 바이오필름을 옮깁니다. 그런 다음 주사기를 사용하여 생물막을 개별 마이크로 원심분리기 튜브에 분배합니다.

간단한 혼합으로 DPBS에서 1-2 비율로 생물막을 희석하고 트라소닉 클리너에서 40 킬로헤르츠에서 2 분 초음파 처리로 삽입 된 2 개의 1 분 와류로 생물막 접종물을 추가로 분해합니다. 분해 된 접종물을 도금을 위해 음의 8 농도로 1 곱하기 10까지 연속적으로 희석하고 접종물을 트립 성 콩 한천 플레이트에 플레이트합니다. 섭씨 37도에서 24시간 후 박테리아를 세어 생물막 집락 형성 단위를 계산합니다.

박테리아 수 대비 생물 발광 비율을 평가하려면 DPBS에서 1/2에서 124 연속 생물막 희석을 만들고 시각적으로 균일한 박테리아 현탁액이 생성될 때까지 희석액을 와류로 만듭니다. 200마이크로리터의 희석된 용액을 검은색 96웰 플레이트의 개별 웰로 전송하고 in vivo 이미징 시스템을 사용하여 각 웰을 이미지화합니다. 그런 다음 희석액을 새 TSA 플레이트에 플레이트하여 섭씨 37도에서 24회 배양하고 다음 날 집락 형성 단위를 계수하여 분광 계수에 대한 생물 발광의 표준 곡선을 만듭니다.

그런 다음 상처에서 드레싱 커버와 실리콘 부목을 제거하고 카메라가 부착된 현미경을 사용하여 상처의 마이크로 그래프를 얻습니다. 끝이 절단된 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 10마이크로리터의 바이오필름 접종물을 각 상처에 피펫으로 바르고 새 드레싱으로 상처를 덮습니다. 그런 다음 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 HEPA 필터가 장착된 격리 챔버에서 매일 상처를 이미지화하여 발광 값이 배경 수준 이하로 떨어질 때까지 상처의 생물 발광을 평가합니다.

상처가 치유될 때까지 상처 봉합 진행 상황에 대한 일일 이미지와 측정값을 얻습니다. 이 당뇨병성 상처 치유 모델에 SKH-1 마우스를 사용하는 몇 가지 장점은 마우스가 당뇨병 유도 후 상당한 체중 감소를 보이지 않고, 당뇨병성 SKH-1 동물 코호트에서 사망이 더 적으며, SKH-1 동물은 C 57 black six 동물에 비해 단기적인 피부 손상이나 모발 재생 방해를 보이지 않는다는 것입니다. 상처가 포함된 생물막의 일일 생체 내 이미징을 통해 상처 감염 발생과 생물막의 진화를 모니터링할 수 있습니다.

그런 다음 표준 곡선을 생성하여 총 플럭스로 기록된 생물 발광을 상처 내 박테리아 밀도와 비교할 수 있습니다. 8일째에 부목을 제거하고 드레싱을 하면 상처 치유를 시각화하고 상처 봉합 진행 상황을 매일 측정할 수 있습니다. 일단 숙달되면 이 기술을 적절하게 수행하면 짧은 시간 내에 수행할 수 있으므로 동물이 마취되는 시간을 줄일

이 절차에 따라, 다른 미생물의 사용 또는 그들의 조합 뿐 아니라 처리의 신청은 다종 생물막이 어떻게 불리한 상처 치유에 충격을 미치는지 또는 부상이 비신약에 얼마나 잘 반응하는지와 같은 추가 질문에 응답하기 위하여 실행될 수 있습니다. 그것의 발달 후에, 이 기술은 실험 당 필요한 동물의 수를 줄이면서 직접 및 지속적인 발광 측정을 통해 세균 성장을 감시해서 상처 치유에 있는 생물막의 충격을 탐구하는 것을 분야의 연구원이 탐구하는 것을 허용하는 길을 닦았습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 상처 수술을 수행하는 방법과 생물막 준비, 접종 및 감염 프로토콜을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.