Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

이 방법의 전반적인 목표는 임상 및 과학 설정 모두에서 단백질 응집체 침전물을 검출하는 것입니다. 헵타 포르밀 티오펜, 아세트산 염색 및 프리온 질환 및 알츠하이머 병의 동물 모델로부터 조직 분석이 설명됩니다. 이 방법은 소량의 단백질 응집체의 존재 및 그 내재적 구조적 변화와 같은 아밀로이드 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 장점은 다른 기존 기술보다 더 선택적이고 민감하다는 것입니다. 이 기술의 의미는 원하는 시각화 기술을 위해 프로브를 조정할 수 있는 가능성 때문에 다양한 단백질 잘못 접힘 질병의 치료 또는 진단으로 확장됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 hFTAA가 낮은 염색 농도를 필요로 하기 때문에 어려움을 겪습니다.

HFTAA는 또한 기존 염료에 비해 더 긴 여기 및 방출 파장을 나타냅니다. 동결건조된 hFTAA를 2밀리몰 수산화나트륨에 재현탁하여 발광 복합 올리고티오펜 용액을 준비하여 1밀리리터당 1밀리그램의 원액을 준비합니다. 원액을 유리 바이알에 옮기고 섭씨 4도에서 보관합니다.

포르말린이 고정되고 파라핀이 함유된 절편을 사용하는 경우, 하룻밤 사이에 자일렌에서 파라핀을 제거합니다. 염색 당일에는 99% 에탄올, 70% 에탄올, dH2O 및 PBS의 연속 수조에 매번 10분 동안 섹션을 담그십시오. 그런 다음 주변 조건에서 조직 절편을 건조시킵니다.

조직이 말리는 동안, 10에 주식 1개를 묽게 해서 hFTAA의 작동 해결책을 준비하십시오, PBS에서 000. 조직이 건조되면 hFTAA 작업 용액의 방울을 각 조직 섹션에 추가하여 덮습니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다.

500마이크로리터의 PBS로 염색 용액을 헹구고 슬라이드를 PBS 수조에 10분 동안 담그십시오. 주변 조건에서 섹션을 건조시킨 후 형광 장착 매체를 사용하여 장착합니다. 장착 매체가 밤새 가라앉도록 합니다.

아밀로이드 검출은 장착 직후 또는 장착 없이도 수행할 수 있습니다. 그러나 실험의 목표가 고품질 스펙트럼 정보를 수집하는 것이라면 하룻밤 배양이 선호됩니다. 현미경 소프트웨어를 열고, 프로젝트 이름을 지정하고, 스펙트럼 이미지를 선택하고, 획득을 시작합니다.

436 나노미터 여기 필터를 사용하여 접안렌즈를 통해 관심 물체를 선택하고 광 경로를 카메라로 이동합니다. 사례 데이터 관리자에서 샘플 유형 스펙트럼을 선택하고 샘플에 레이블을 지정한 다음 acquire를 누릅니다. 획득 창이 열립니다.

스펙트럼 이미징에서 설정 메뉴를 열고 획득 속성을 선택한 다음 스펙트럼 범위를 460에서 700으로, 최대 속도의 속도 품질을, 측정 유형을 가스 레이저 협폭 필터로 설정합니다. 대화 상자를 닫습니다. 이미지 메뉴에서 live full을 선택합니다.

아이콘의 막대에서 fringes를 끕니다. 이미지화할 영역을 선택하고 최대 메모리 값이 800MB 미만인지 확인합니다. 노출 시간을 1, 000에서 3, 000 사이의 총 이미지 밝기를 제공하는 값으로 설정합니다.

아이콘 표시줄에서 색상이 지정된 카메라를 누릅니다. 인수가 시작됩니다. 이미지 획득이 완료되면 Acquire Spectral Image 대화 상자에서 Save를 누르고 Case Data Manager 대화 상자에서 새 셀을 누릅니다.

사례 데이터 관리자에서 분석 시작 버튼을 사용하여 수집된 이미지를 엽니다. 데이터 분석 창이 열립니다. 스펙트럼 디스플레이(spectral display) 대화 상자를 사용하여 ROI를 선택하여 이미지의 각 픽셀에서 스펙트럼 정보를 수집할 수 있습니다.

정의를 선택하고 이미지의 관련 영역에서 ROI를 선택합니다. 스펙트럼 데이터를 Lib 버튼을 사용하여 텍스트 파일로 저장합니다. 저장된 txt 파일은 선택한 분석 소프트웨어로 가져올 수 있습니다.

현미경 소프트웨어를 열고 컨포칼 현미경을 설정하여 시작합니다. 레이저 강도를 0.2%로, 핀홀을 Airy 단위 1개로, 프레임 크기를 1, 024 x 1, 024 픽셀로, 스캔 속도를 16회 스캔 시 평균 7로, 비트 깊이를 8비트로 설정합니다. 방출 스펙트럼을 수집하려면 람다 모드를 선택하고 아르곤 레이저를 488나노미터로 설정합니다.

32채널 헐떡임 검출기에서 22개 채널을 사용하여 499 및 691 나노미터 사이의 방출을 수집합니다. 게인을 755로 설정합니다. 라이브 버튼을 클릭하고 팔레트를 범위 표시기로 변경하고 게인을 조정하여 오버로드되지 않은 픽셀을 빨간색으로 허용합니다.

중지 버튼을 클릭한 다음 스냅 버튼으로 이미지를 캡처합니다. 단일 채널 이미지를 얻으려면 스마트 설정 옵션을 선택합니다. FITC 및 Alexa 532를 선택합니다.

선형 혼합 해제를 선택하고 적용합니다. 오버로드되지 않은 픽셀을 허용하도록 게인을 조정합니다. FITC의 경우 게인을 693으로 설정하고 Alexa 532의 경우 라이브 모드 중에 게인을 433으로 설정합니다.

중지 버튼을 클릭한 다음 스냅 버튼으로 이미지를 캡처합니다. 현미경을 FLIM 모드로 전환합니다. 핀홀을 20으로, 여기 파장을 490나노미터로, 레이저 강도를 0.5%로 설정합니다.40메가헤르츠에서 펄스 레이저를 사용합니다.

FLIM 소프트웨어에서 550나노미터 이상의 광자 카운팅을 설정합니다. 디스플레이 매개변수 창에서 최대 카운트가 약 4, 000 포톤 카운트가 될 때까지 포톤 카운팅을 따릅니다. 파일을 저장하고 SPC 이미지로 내보냅니다.

이 이미지는 DAPI로 대조염색된 간 간세포의 케라틴 응집체로 구성된 Mallory-Denk 시체를 보여줍니다. 여기서, P62 양성 내포물은 산발적 포입체 근염 골격근 조직에서 나타납니다. 이 이미지는 인간의 췌장에 아밀로이드 섬 폴리펩타이드가 포함된 것을 보여줍니다.

인간의 장에서 면역글로불린 경쇄의 아밀로이드 침착이 여기에 나와 있습니다. 이 이미지는 쥐의 뇌에 있는 양 스크래피의 프리온 단백질 응집체의 침전물을 보여줍니다. 만성 소모성 질환에 감염된 쥐 뇌의 프리온 단백질 응집체가 여기에 나와 있습니다.

이 이미지는 APP23 마우스 뇌의 A-베타-아밀로이드 플라크를 보여줍니다. 그리고 이 이미지는 APP-PS1 쥐 뇌의 A-베타 병리학을 보여줍니다. 인간 환자의 트랜스티레틴 아밀로이드 진단 샘플에서 채취한 이러한 지방 생검 도말은 표준 콩고 레드 점수에 따라 1에서 4까지 등급이 매겨졌습니다.

노란색 영역은 hFTAA 염색된 트랜스티레틴 아밀로이드 침전물을 나타내고 파란색은 지방 조직의 자가형광을 나타냅니다. 이 절차를 시도하는 동안 적절하게 낮은 농도로 염색해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 최대 대비를 얻고 자가형광 및 배경 염색 형광을 피하기 위해 장역 통과 필터를 사용하는 것을 잊지 마십시오.

이 절차에 따라 응집된 단백질을 식별하고 공동 응집된 단백질을 식별하기 위해 면역형광과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 아밀로이드증 분야의 연구자들이 단백질 응집체 구조를 탐구하고 유기 화학에서 이러한 표적에 대한 새로운 프로브를 설계할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 서로 다른 기술로 LCO 염색을 수행하여 각각 이미징하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.