Name: Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 학습하세요 형광 현미경과 스펙트럼 이미징을 활용한 hFTAA 염색법으로 조직 내 단백질 응집체를 검출하는 방법입니다. 이 기술은 프리온병과 알츠하이머병 연구에 탁월한 선택성과 민감도를 제공합니다.

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저자는 미카엘 린드그렌과 Chanan Sluzny 형광 현미경 검사 법, 그리고 아드리아누 Aguzzi, 요한 Bijzet, Bouke Hazenberg, 프랭크 Heppner, 마 티아 스 엄마가, 써 리 Klingstedt, 카린 Magnusson, 크리스티나 Sigurdson, 다니엘 Sjölander, 조언에 감사 하고자 크리스토프 Röcken, Gunilla Westermark, Westermark 당 그리고 커트 Zatloukal 기여 조직 단면도 또는 현미경이이 발행물에 표시 됩니다. 표시 데이터 계약의 컬렉션 스웨덴어 뇌 재단 (Hjärnfonden), 스웨덴 츠 협회 (Alzheimerfonden), 스웨덴 연구 위원회 (VR), 예란 Gustafsson 협회, 게오르그에서 기부금에 의해 융자 된 &#38; Astrid Olsson, EU FP7 건강 프로젝트 LUPAS, 고 링 셰 핑 대학.

참고: LCO 합성 10 년 이상에 대 한 우리의 실험실에서 수행 되었습니다. 위한 프로토콜 electrophilic 아로마 대체, 팔라듐 촉매 크로스 커플링, 아 미드 결합, 에스테 르가 수 분해를 기본적으로 적용 하 여 우리 종합적 프로브 다른 목적 5 ,에 대 한 사용자 지정 12. 합성, 특성, 그리고 정화, 후에 LCO는 동결 건조 된 제품과 실내 온도에 저장. 프로브 중 일부 (그들의 사이에서 hFTAA)은 지금 상업적으로 제공 (테이블의 자료 참조).
 1. LCO 얼룩이 솔루션 참고: hFTAA 상업적인 공급 업체 로부터 구입한 경우 공급 업체 따라 &#39; 섹션 1 대신 s 지시.
2mm 1 mg/mL의 재고 솔루션을 준비 하는 NaOH에에서 <ol><li>resuspend는 동결 건조 된 hFTAA. 4 ° c.에 유리 유리병에 재고를 유지 재고는 1 년 동안 저장 될 수 있다.</li>
	<li>얼룩이 지기의 날, 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 주식 1:10,000를 diluting 하 여 작업 솔루션 준비.</li>
</ol> 2. 조직 샘플의 준비 참고: 많은 조직 유형 녹말 체 표식으로 hFTAA를 사용 하 여 이미지 수 있습니다. 예 그림 1을 참조 하십시오. hFTAA는 집계 구조에 민감합니다. 얼룩이 지는 따라서 선호 수행 되어야 한다 epitope 노출 없이 undisrupted 집계에. 최적의 스펙트럼 품질 조직 고정 최소한으로 유지 하는 경우 얻을 수 있다. 따라서 신선한 냉동된 소재, 부드럽게 얼룩의 시간에서 에탄올에 고정이 좋습니다. 그러나, 예를 들면, 포 르 말린으로 고정 된 조직에 아 밀 로이드 예금도 검출 가능 하다. hFTAA는 일반적으로 잘 조직 침투. 이미징 기술 의도와 호환 되는 시료 두께 선택 합니다.
<li>포 르 말린 고정, parafinembedded 섹션을 사용 하는 밤 동안 크 실 렌에 deparafinize 경우 <ol>. 섹션 연속 온천에 99% 에탄올, 70% 에탄올, dH 2 O, 그리고 PBS의 각각에서 10 분을 찍어. 조직 섹션 주위 조건 하에서 건조 허용. 
	주의: 크 실 렌은 항상 화학 증기 두건에서 처리 됩니다. 크 실 렌 및 다른 유기 용 매에 유해 하다입니다.
	<li>실 온에서 해 동 cryosections <ol>입니다. 하룻밤 10% 포 르 말린에 조직 단면도 수정 하 고 연속 탕 99% 에탄올, 70% 에탄올, dH 2 O, 그리고 PBS의 각각에서 10 분에서에서 그들을 담거 서 rehydrate. 조직 섹션 주위 조건 하에서 건조 허용.</li>
	</ol></li> <li>커버 조직 섹션에 hFTAA 작업 솔루션 (약 200 µ L)의 방울을 추가. 작은 물방울은 표면 장력에 의해 장소에 체류 해야 합니다. 얼룩에 대 한 실 온에서 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>린스 500 µ L PBS를 피 펫을 사용 하 여 얼룩 솔루션 오프 하 고 다음 슬라이드 10 분 허용 주위 조건 하에서 건조 섹션에 대 한 PBS 욕조에 담가.</li>
	<li>형광 설치 매체를 사용 하 여 탑재 합니다. 밤새 정착 장착 매체 허용. 
	참고: hFTAA 얼룩 수행할 수 있습니다 조합에서 면역 형광 검사, 세포 또는 세포 기관이 특정 마커, 등 다른 착 방법. 공동 얼룩을 수행 하려면 선택의 완전 한 얼룩 프로토콜을 실행 하 고 hFTAA 단계 2.2에서에서 출발 끝에 얼룩을 추가 합니다. 예를 들어 그림 2를 참조 하십시오. 면역 형광 검사, 선호 선택 640에 흥분은 이차 항 체 nm 또는 더 높은. 이 파장 범위에서 hFTAA는 형광 하지 것입니다 및 따라서 흥분 수 없습니다 흡수 하지 않습니다. 그러면 그 피가 통해 볼 hFTAA 항 체 사이.</li>
</ol> 3. 현미경 참고: 긴 패스 필터 장착 형광 현미경을 사용 하 여. 모든 설정은 아래 그림 4에서 이미지를 생성 하기 위해 사용 되었다. 녹말 체 유형 및 조직 샘플에 따라 조정 해야 합니다. HFTAA 아 밀 로이드에 바인딩된 표백으로 안정적 이지만, 그것은 표본 검사 하거나 몇 군데 하지 광원을 해제 하는 것이 좋습니다.
<ol><li>HIS 참고: 실험 그의 (재료의 표 참조)에 대 한 긴 패스 방출 필터와 카메라 헤드 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 수행 되었다.
	<ol><li>사용 표준 형광 현미경 긴 패스 필터 및 hyperspectral 카메라 장비. 스펙트럼 카메라 보정 됩니다 있는지 확인 하십시오.</li>
		<li>소프트웨어에서 프로젝트 이름을, 선택 &#34; 스펙트럼 이미지 &#34; 수집을 시작 하 고.</li>
		<li>436 nm 여기 필터를 사용 하 여 눈을 통해 관심의 개체를 선택 하 고 카메라에 빛을 이동.</li>
		<li>에의 경우 데이터 관리자 (CDM), 샘플 유형 스펙트럼, 라벨 샘플을 선택 하 고 언론 취득. 수집 창이 열립니다.</li>
		<li>수집 창에서 &#34; 스펙트럼 영상 &#34;, 설정 메뉴를 열고, 수집 속성을 선택한 설정 스펙트럼 범위 460-700, 최대 속도, 속도 품질 및 측정 가스/레이저/좁은 필터에 입력. 대화 상자를 닫습니다.</li>
		<li>이미지 메뉴에서 선택 전체 라이브. 아이콘 바에서 해제 변두리. 선택 하거나 이미지를 800 MB 미만의 최대 메모리 값을 영역 크기. 1000과 3000 사이 총 이미지의 밝기를 제공 하는 값을 노출 시간을 설정 합니다. 아이콘 표시줄에 컬러 카메라를 누릅니다. 수집 시작 합니다. 이미지 수집 완료 되 면 저장을 눌러는 &#34; 취득 스펙트럼 이미지 &#34; 대화 상자 및 &#34; 새로운 셀 &#34; 사례 데이터 관리자 대화 상자에서.</li>
		<li>CDM에서 분석 시작 단추를 사용 하 여 수집 된 이미지를 엽니다. 데이터 분석 창이 열립니다.</li>
		<li>스펙트럼 정보 ROIs 스펙트럼 표시 대화 상자를 사용 하 여 선택 하 여 이미지의 각 픽셀에서 수집할 수 있습니다. 선택 &#34; 정의 &#34; 이미지의 관련 분야에서 ROIs 선택.</li>
		<li>는 Lib 단추를 사용 하 여 텍스트 파일로 스펙트럼 데이터를 저장 합니다. 선택의 어떤 분석 소프트웨어에 저장 된.txt 파일을 가져올 수 있습니다. .Slb 파일은 데이터 분석 소프트웨어 내에서 분석에 사용할 수 있습니다. 있으 나 전체 이미지에서 hyperspectral 큐브 데이터로 raw 파일로 내보낼 수 있습니다 &#34; 레이어 tif로 &#34;, 또는으로 &#34; 텍스트 형식의 레이어 &#34; 외부 소프트웨어를 사용 하 여 데이터와 이미지 분석 어플리케이션에 대 한.</li>
	</ol></li> <li>Confocal 현미경 검사 법 참고: confocal 현미경 여기 소스로 가변 레이저 장비 된다. 모든 형광 방출 실험, 0.2% (3 µW의 평균 전력에 해당), 레이저 강도 설정 1 공기 단위에 pinhole, 프레임 크기 1024 픽셀 x 1,024 픽셀, 7과 이상의 16 검사, 및 8 비트로 비트 깊이 평균으로 스캔 속도 (참조 < s 합니다 > 자료 표). 이러한 설정은 각 개별 공초점 레이저 시스템, 레이저 소스 및 샘플 형식에 대 한 조정 될 필요가 있다.
	<ol><li>방출 스펙트럼에 대 한 수집 람다 모드와 아르곤을 사용 하 여 여기를 사용 하 여 레이저 세트 488 nm. 22 채널을 사용 하 여 32 채널 모금 검출기에서 503와 687 nm 사이 방출을 수집 합니다. 755로 이득을 설정.</li>
		<li>단일 채널 이미지를 달성 하기 위해 옵션을 설정 하는 스마트를 사용 합니다. FITC (녹색 필터), 750 이득을 설정 하 고 알 렉 사 535 (빨간 필터) 845에 이득을 설정.</li>
		<li>가변 레이저 여기 스펙트럼을 수집 하는 551 및 586 nm 사이 방출 수집 하는 동안 490 및 545 nm 사이 1 nm 단계 여기를 사용 합니다. 2% (30 µW의 평균 전력에 해당) 및 774의 이득을 레이저 강도 설정.</li>
		<li>스펙트럼 모드에서 Z-스택 수집 0.96 µ m의 단계에 섹션의 깊이 통해 검색 합니다. 동일한 여기 및 방출 설정 단계 3.2.1로 사용 될 수 있지만 730에 이득을 설정.</li>
	</ol></li> <li>FLIM 참고: confocal 현미경 FLIM 단위 장비 된다 (재료의 표 참조).
	<ol><li>Confocal 현미경에 대 한 다음 매개 변수를 설정: Pinhole, 20; 여기 파장, 490 nm; 레이저 강도, 0.5% (해당 하는 평균 전력 7.5 µW의). 펄스 레이저를 사용 하 여 40 mhz.</li>
		<li>FLIM에 소프트웨어, 포 톤 이상 550 계산 설정 nm. 표시 매개 변수 창에 따라 최대 수는 약 4000 광자 카운트까지 세 광자.</li>
		<li>SPC 이미지로 내보내고 파일을 저장 합니다.</li>
		<li>는 FLIM 소프트웨어 데이터 2-구성 요소 지 수 감퇴를 맞는. Χ 2를 제공 하는 맞춤 &#60; 2는 좋은. Y 축에 값이 지정 된 수명에 대 한 카운트 수.</li>
		<li>포함, 예를 들어, 100 카운트에 대 한 임계값을 선택 합니다. 컬러 코드 T1에 의해 고 수명 범위를 선택 합니다. 감퇴는 hFTAA 바인딩되어 녹말 체 구조에 따라 달라 집니다. 300 그리고 1000 ps 사이 형광 일생 관찰 되었습니다. 파일을 저장 합니다.</li>
		<li>내보내기 옵션을 사용 하 여 원시 데이터를 내보내고 새 폴더에 원하는 데이터를 저장.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

PH PN MB SN는 브랜드 이름 Amytracker545 hFTAA가 Ebba 생명 공학에 작은 주주.

아 밀 로이드로 aberrantly 접힌된 단백질의 증 착은 많은 질병 프로세스의 키 이벤트입니다. Extracellular 녹말 체 패 Aβ 펩 티 드의 구성 및 세포내 neurofibrillary tangles hyperphosphorylated 타우에 의해 형성 된 알 츠 하이 머 병 환자의 뇌에서 찾을 수 있습니다. 다른 단백질, 예를 들면, transthyretin (TTR), 혈 청 아 밀 로이드 A 구성 요소 (SAA), IgG 빛 체인 misfold 및 CNS 외부 조직에 아 밀 로이드 예금으로 매니페스트는 다양 합니다. 아 밀 로이드 예금 알려져 되 고 한 세기 이상, 우리는 여전히에 대 한 공부 방법을 녹말 체의 상세한 지식이 부족 하지만 증 착 분자 수준 및이 프로세스를 방지 하기 위해 할 수 있는 무엇에서 시작 됩니다. Alzheimer의 질병에 대 한 그것은 어떻게 amyloidosis의 과정이 neurodegeneration 연관 확증 해야 합니다. Amyloidosis를 치료 하는 임무에 하나의 주요 모험은 소설 개발 하 끈 녹말 체 개시, 진행 및 회귀; 모니터링을 위한 도구 따라서 타겟된 녹말 체 감지 키입니다. 긴 안목으로 보면, 임상 진단 민감도 선택도 녹말 체 착 방법7,15의 증가에서 도움이 됩니다. 이 점에서 현재도 전에 엄청난 고 매우 활동적인 연구 분야. 임상 개발 및 실험에 대 한 하나의 주요 문제는 예 후 진단. 이러한 질병 가능성이 시작 전에 증상이 나타나지만 시작 거기 치료 해야 질병의 식별. 여기, 감도 소설 방법론에 대 한 핵심 측면 이다. 또한,이 문제는 일부 단백질 집계는 독성, 일부는 보호, 그리고 일부는 중립 때문에 훨씬 더 복잡 한입니다. 따라서 특정 집계 morphotypes를 모니터 하는 능력 때문에 고유한 집계 된 종의 존재 신경 단백질 집계 질병의 다양성에 대 한 보고 유형이 다른 표현 형을 설명 하기 위해 제안 되었습니다 필수적 이다. 예를 들어, 프리온 단백질은 아미노산의 동일한 기본 시퀀스 특정 프리온 긴장을 별개 집계 morphotypes에 misfold 수 있는 어떻게의 고전적인 예입니다. 유사한 다형성 Aβ 펩 티 드, α-synuclein, 및 타우 또한 보고 되었습니다. 이와 관련, LCOs 별개 집계 morphotypes의 광학 지정을 위한 뛰어난 도구를 되도록 표시 되었습니다. 프리온 변형 관련 단백질 집계, 단백질 예금 조직의 amyloidosis, 다형 Aβ의 여러 종류에서 발견 하 고 타우 집계는 LCOs에서 관찰 하는 conformationally 유도 광학 현상으로 인해 구별 되어 있다.
아 밀 로이드 증 착 분자 정밀도의 생화학 또는 생물 방법으로 침투 하기 어려운 조직에서 수행 되는 이벤트입니다. 이벤트 전 비보 vivo에서, 그리고 생체 외에서 동일한 LCO 분자를 사용 하 여 검색을 vivo에서 에서 비보 전 또는 에 적용 하는 기술을 사용 하 여 발생 하는 분열 이벤트 무대 세트 체 외 11,17를 샘플링. 최근 보고 된 고해상도 구조 모델 쇼는 LCO pentameric FTAA (pFTAA) 바인딩합니다 6 레지스터에 병렬 베타 가닥18, 스패닝 fibril 축과 평행 하 게 정렬 된 사이드 체인에 의해 형성 된 구멍에 다는 것을 보여주는 원자 해상도 LCO 대상의 항목에 대 한 지식을 얻기 위해 가능 합니다. 본질적으로 pFTAA의 바인딩 구멍 및 바인딩 모드가 비슷합니다 콩고 레드19, 반복적인 긍정적인 충전된 리스 사이드-체인 늘어서 groove에 의해 규정. LCOs의 선호도 콩고 레드 체인 유연성과 소수 성 구멍으로 thiophene 링의 황 원자의 강한 반 데르 발스 상호작용으로 인해에 비해 더 나은 것으로 나타납니다. (전에 ThT 응답) prefibrillar 종5,20 의 탐지 반복적인 β 시트, 레지스터에 병렬-베타-가닥, 두 thiophene 단위 pFTAA 이상 되 고 hFTAA에 대 한 어느 것이의 구성에 따라 표시 최대 8 베타 가닥의 교차점을 스팬.
얼룩 프로토콜 문제가 다음 단계에서 촬영에 주의 기울이고 필요 합니다: (i) 고정: 조직 샘플의 광범위 한 고정 녹말 체 구조 수 고에 의해 유도 된 형광 스펙트럼에서 변화를 감지 하는 가능성을 제한 hFTAA 분자의 구조적 왜곡입니다. 신선한 냉동 재료에서 cryosections의 가벼운 고정 최적의 스펙트럼 분해능을 달성 하기 위해 선호 된다. 그러나, hFTAA 얼룩 하 고 아 밀 로이드 고정된 조직에서 그러나 감소 효능으로 갈수록 스펙트럼 변화를 형광. (ii) Epitope 노출: epitope 노출 항 체 바인딩 때때로 때문에 바인딩할 hFTAA에 대 한 능력을 줄일 수 있습니다에 대 한 달성 하기 위해 조직의 사전 치료 중단 녹말 체 구조. 이 문제가 있다면 epitope 노출 얼룩 프로토콜, 항 체 및 hFTAA에 대 한 연속 섹션을 사용 하 여 항 체에 있는 중요 한 단계 이다, 각각 수 간주 됩니다. (iii) overstaining: hFTAA은 매우 민감 하다. 작업 솔루션 nM의 낮은 농도에서 유지 되어야 한다. 배경 얼룩 문제가 경우 hFTAA의 농도 줄입니다. HFTAA 바인딩 요소는 조직에 스파스, hFTAA의 초과 집계 하 고 설치 매체에 누적 될 수 있습니다. 이것은 조직 자체의 초점 평면에 있지 않은 형광으로 인식 됩니다. 이 나타나면, 담가 PBS에 탑재 된 슬라이드 때까지 커버 슬립 섹션의 미끄러져 질 수 있다, PBS, 세척 신선한 설치 매체와 새로운 커버 슬립 다시 탑재. (iv) 필터 기반 이미징: 긴 패스 필터 또는 여러 탐지 채널을 사용 하 여 주로 괴기 하 게 해결된 형광 이미징이이 종이 설명 합니다. hFTAA 또한 짧은 패스 필터를 사용 하 여 모니터링할 수 있습니다. 이 대비 감소 되며 여러 색상 검출 하는 가능성을 폐지 유의 하시기 바랍니다.
지난 년 동안 그것은 분명로 연구 도구, 형광 LCOs와 특히 hFTAA 매우 유망한 속성 표시 되고있다. 결과 다양 한 단백질 및 질병 상태, 혈 청 아 밀 로이드 A, transthyretin, 면역 글로불린 경 쇄의 전신 아 밀 로이드 (타우, 포함 신체 근육), 셀 안에 hFTAA 감지에서 배열에 대 한 증명 되었습니다 (카파과 람다) seminogelin 1, 프리온 단백질 (를 포함 하 여 임상 샘플)21, 작은 섬 녹말 체 폴 리 펩 티, 그리고 인슐린7,15. 진단 도구로 hFTAA의 구현에 대 한 제한 요소는 그 형광 현미경 일상적인 녹말 체 병 리 실험실에서 광범위 하 게 사용 되지 않습니다. 또한, 그의 제공 되지 않습니다 쉽게 병원에. 그러나, hFTAA 녹말 체 얼룩 및 형광 현미경 필터 기반된 형광 현미경에서 임상 실험실에서 사용 되 고 한다무료 진단 방법으로 간주 됩니다. 이 최근 근 생 검에 transthyretin amyloidosis 자동된 패션22에 형광에 대 한 기본 설정을 사용 하 여 함께 시연 했다.
또한, 뿐만 아니라 다양 한 단백질, hFTAA 형광 fibril 형식과 미리 원 녹말 체 집계, 예를 들어다양 한 인식, 경로 원 종 감지 되 고 특징. 이 책에서 우리 3 현미경 검사 법 기술을 사용 하 여 다양 한 샘플 형식에 대 한 LCO를 증명 하고있다. 제어 합성의 사용 또한 바이오 대상의 다양 한 검색 예를 들어, 표면 플라스몬 공명 (SPR)23 에 의해 상호 작용의 기록 및 양전자 방출 radiolabeling LCOs의 개발에 대 한 수 있다 컴퓨터 단층 촬영 (PET)24.
날짜 하려면,과 25 다른 LCOs 출판 되었습니다. 어떻게 이러한 질병 관련 집계 조립, 분해, 및 기관과 개인 존재 하는 방해의 이해와 지식을 녹말 체 예금의 이미징 LCOs의 증가 사용을 증가할 것 이다.

조직에 아 밀 로이드의 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 전신 amyloidosis, 프리온 질병 등 숫자 질병에 pathologic 특징 이다. 사실 날짜 40 다른 단백질에 가까운 인간의1녹말 체 선구자로 분류 된 및 아 밀 로이드 관련 된 질병의 퍼짐에도 불구 하 고 약간 녹말 체 증 착 및 질병 표현 형 사이 관계에 대 한 알려져 있다. 인간 환자에서 샘플의 조직학 되었습니다 모두 진단 및 과학적 목적을 위해 사용. 동물 모델의 많은 녹말 체 부담 및 행동, 수명, 및 다른 phenotypic 읽기의 숫자 간의 상관 관계를 조사 하기 위해 설립 되어 질병 진행2,3의 사. 큰 노력은 또한 약물 발견 및 몇몇은의 우리의 가장 두려워 광범위 한 질병을 전투에 디자인에서 만들어지고 있습니다. 그러나, 유전자, 표현 형, 녹말 체 패 부하 및 약국 사이 연결의 평가 아니다 똑 바른 앞으로. 얼룩 및 조직에 아 밀 로이드의 이미징 도구 자주 무딘 고 녹말 체 형성 및 구조에 낮은 해상도 정보를 제공 한다.
콩고 빨강 복굴절, ThT, 그리고 ThS 형광 탐지 하 고 환자의 생 검 및 게시물 부검 샘플, 및 질병4의 동물 모델에서 조직 샘플에서 녹말 체 부담 분석에 대 한 고전적인 방법의 예입니다. 이 기술은 (1920 년대부터 콩고 레드와 ThT와 1960 년대 이후 파생 상품), 수 십년 동안 사용 되 고 계측 되어 상세한 분석에 대 한 수 있지만 착 절차 및 분석 여전히 수행 되 고 에 거의 세기 전에 같은 방식.
이 문서에서 우리는 매우 민감한 소설 녹말 체 염료, hFTAA5, 성숙 아 밀 로이드의 탐지 뿐만 아니라 높은 정확도로 작은 미 숙 단백질 예금의 수의 활용을 설명 합니다. 기존의 염료에 비해, hFTAA 입증 되었다 단백질 집계5,,67관련 질병의 넓은 범위를 검색 하려면. 또한, hFTAA 또한 고유 집계 morphotypes8의 광학 할당에 적용할 수 있습니다. 여기, 우리 hFTAA 얼룩이 지 고 분석 조직 프리온 질병 및 아 밀 로이드 β 선구자 단백질 (APP) 유전자 변형 쥐 알 츠 하이 머 병9,10 패 개발을 모방 하도록 설립된 동물 모델에서의 설명 . 우리 또한 조직의 amyloidosis 고통 받아 환자에서 진단의 분석 및 게시물 부검 샘플 표시. LCOs는 한 패; 내 구조적 차이 대 한 보고서를 수 있도록 기본 속성 그리고 바인딩 및 형광에 대 한 다른 특성을 가진 두 LCOs를 결합 하 여 차이 훨씬 더 발음11. 긴 패스 필터 장착 epifluorescence 현미경 그리고 hyperspectral 카메라 머리 스펙트럼 속성의 객관적인 분류 및 스펙트럼 분석에 대 한 현미경의 녹음 수 있도록 사용 됩니다. 여기 소스로 가변 레이저 공초점 형광 현미경 검사 법 더 자세히 녹말 체 패의 3 차원 속성을 평가 하는 데 사용 됩니다. 가변 레이저의 여기 스펙트럼 컬렉션 수 고 현미경에 덜 방출 파장의 선택 단계 LCO 형광 및 대상 단백질과 아 밀 로이드의 공동 지역화를 결정 하기 위해 면역 형광의 공동 영상. FLIM 구조적 차이 LCOs에 부과에 전례 없이 높은 감도 제공 하 고 형광 방출 스펙트럼에 감지 되지 않을 수 있습니다 차이 보여준다.
설명된 착 방법으로 주요 목표는 작은 녹말 체 예금의 민감한 탐지를 촉진 하 고 아 밀 로이드 예금 내의 구조적 다형성의 특성. 이 지식을 단백질 집계 질병의 기본적인 이해를 위해 중요 하다.

<table><tbody><tr><td>hFTAA/Amytracker545</td><td>Ebba Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dako 형광 장착 매체</td><td>Agilent Technologies</td><td>GM304</td><td></td></tr><tr><td>LeicaDM6000</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumen 200</td><td>Prior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectraview 시스템</td><td>ASI 스펙트럼 이미징</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectraview 소프트웨어</td><td>ASI 스펙트럼 이미징</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM780</td><td>자이스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>젠 2010b v6.0 소프트웨어</td><td>자이스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLIM 시스템</td><td>Becker & Hickl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ar/ML 458/488/514</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>조정 가능한 레이저 Zeiss</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 hyperspectral에 의해 발광 활용된 oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

단백질 전신 조직에 아 밀 로이드로 입금 하는 원인이 나 질병의 큰 숫자의 결과 될 수 있습니다. 이 중 우리가 찾을 주로 중앙 신경 조직, 그리고 조직의 amyloidosis afflicting 알츠하이머병과 파 킨 슨 병 같은 신경 퇴행 성 질환 혈 청 아 밀 로이드 A, transthyretin 그리고 IgG 경 쇄는 간, 손목에 아 밀 로이드로 입금 갱도, 비장, 신장, 심장, 그리고 다른 주변 조직. 아 밀 로이드 알려진 이었고 종종 콩고 빨강 및 Thioflavin T (ThT) 또는 Thioflavin (ThS) 같은 녹말 체 특정 염료를 사용 하 여 보다 더 한 세기에 대 한 공부. 이 문서에서 우리는 최근 개발된 보완 발광 활용된 oligothiophenes (LCOs) 라는이 염료에의 한 예로 heptamer formyl thiophene 초 산 (hFTAA)를 제시. hFTAA 사용 하기 쉬운 이며, 기타 세포 마커 또는 공동 면역 형광에 얼룩과 호환 됩니다. 광범위 한 연구는 기존의 녹말 체 염료 보다는 질병 관련 단백질의 광범위를 감지 하는 그 hFTAA을 입증 했다. 또한, hFTAA 또한 녹말 체 fibril 다형성의 연구 수 있도록 고유한 집계 morphotypes의 광학 할당에 적용할 수 있습니다. 이미징 방법론 적용은 선택 사항, 우리 여기 보여 hyperspectral 화상 진 찰 (HIS), 레이저 스캐닝 confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 (FLIM) 이미징. 이 보기 LCOs 사용 될 수 있는 도구로 형성의 더 상세한 지식 및 amyloids의 구조적 속성을 얻기 위해 일부 이미징 기술을 보여준다. 모든 기존의 광학 현미경 검사 법 기술, 탐지를 허용 하려면 집계의 미세한 크기에 대 한 요구 사항에 대해서 기술 하는 중요 한 제한이입니다. 또한, 집계 hFTAA 바인딩 수 있도록 반복적인 β 장 구조를 구성 한다. 과도 한 고정 및/또는 epitope 노출 집계 구조 또는 구조를 수정 하는 가난한 hFTAA 바인딩 렌더링 하 고 따라서 정확한 이미징에 한계를 포즈 수 있습니다.

민감하고 선택적 인간의 환자와 실험 동물에서 많은 다른 조직 종류에 있는 단백질의 많은 수에서 아 밀 로이드 예금의 얼룩 하는 것은 과학적 연구에서 임상 진단도 중요 합니다. 이 수 있는 방법을 보여 줍니다이 종이, LCOs, 얼룩 및 조직의 종류의 선택에서 아 밀 로이드의 복합 이미징에 대 한 hFTAA에 의해 궁 행을 사용 하 여 달성. 10 년 전 이상 thiophene 기반 녹말 체 ligands의 첫 출간 이후13, 아 밀 로이드 예금 다양 한 조직의 다양 한 단백질의 구성 된 몇 군데 있다 LCOs6,7,11를 사용 하 여 14,,1516 (그림 1). 항 체 또는 다른 조직학 표시와 함께,는 LCOs (그림 1a, 그림 2) 진단 및 과학적 목적을 위한 훌륭한 도구를 제공합니다. 형광 표식의 적절 한 선택, 여러 fluorophores (그림 1a, hFTAA 및 DAPI, 면역 형광 검사 설정에서 그림 2a hFTAA) 같은 섹션에 몇 군데 있습니다. 그것은 또한 명시 및 형광 (그림 2b, hFTAA 그리고 한 덩어리 얼룩이 지는 항 체)를 사용 하 여 얼룩에 대 한 연속 섹션을 사용 하 여. 최근, hFTAA 콩고 빨강 얼룩이 임상 진단7,15 (그림 3)에 매우 유망한 보완 될 입증 되었습니다.
지난 십년 동안 이미징 기술의 개발 양적 방식에서 사이 분, 하지만 아 밀 로이드 예금에서 같은 시간 심오한 차이에서 차별 수 녹말 체 염료의 필요를 증가 했다. LCO 내 활용된 시스템의 바인딩 모드에 변화에 보고 하는 독특한 능력으로 그것을 제공 한다. 분자의 왜곡 활용된 시스템에서 바인딩 각도에서 왜곡으로 이어질 수 있으며 전자 (그림 4a)의 수송을 방해 수 있습니다. 이 차례로 모두 여기 및 방출 파장에 방출 일생에 LCO의 형광 특성에 반영합니다. 그의 방출에 대 한 긴 통과 필터를 장착 한 직 립 형광 현미경에 사용 합니다. 여기 및 방출 스펙트럼 confocal 현미경 검사 법 그리고 FLIM에, 우리는 펄스 레이저는 LSM780를 사용합니다. 다양 한 기법을 예증 하 우리 한 개체 (베타 아 밀 로이드 (Aβ) 플 라크는 APP 유전자 변형 마우스에서)를 몇 군데 (그림 4b-e). Hyperspectral 형광 스펙트럼 (그림 4b) 스펙트럼 교대 및 플 라크의 다른 지역에서 강도 변화 평가 대 한 수 있습니다. 여기 스펙트럼 confocal 현미경 검사 법 (그림 4c)에서 다운스트림 실험, 예를 들어, 여러 fluorophores와 얼룩 조합에 대 한 최적의 여기 파장을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 방법은 또한 구조적 차이 LCO의 바인딩 모드에서의 검색을 위한 유용한 증명할 수 있습니다. Confocal 모드에서 방출 스펙트럼 hFTAA에서 또는 여러 LCOs 또는 LCO 및 면역 형광 조합 실험에서 colocalization를 평가 하기 위해 여러 fluorophores의 조합에서 형광 방출 속성을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 조합입니다. HFTAA의 형광 수명 높은 hFTAA의 바인딩 모드에 있는 작은 변이 의해 영향을 받습니다. 따라서 FLIM 바인딩 대상 (그림 4 d)에 의해 hFTAA에 부과 된 차이 사이 차별에 강력한 도구입니다. 이 예를 들어 다른 프리온 긴장8사이 차별에 사용할 수 있습니다. Confocal 영상 및 3 차원 이미지에 Z-스택 처리 녹말 체 집계 (그림 4e)의 전반적인 형태를 탐험을 위한 유용한 도구입니다. 다시, 추가 fluorophores의 사용 보증금의 구성 이해에 도움이 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig1.jpg"> 
그림 1: 다양 한 조직 유형 및 단백질 집계 h FTAA의 얼룩 보여주는: 각 질 집계 (DAPI와 counterstained), 간 (b) p62-긍정적인 r 포함 산발적에 구성 된 (한) Mallory Denk 시체 포함-몸 근육 (s-IBM) 근육 조직, (c) 아 밀 로이드 인간의 췌 장, (d) 인간의 내장, (e) 양 scrapie (prions) 마우스에서에서 아 밀 로이드의 면역 글로불린 경 쇄 뇌, (f에서 작은 섬 녹말 체 폴 리 펩 티의 ) 만성 낭비 질병 (prions) 쥐의 뇌, APP23 마우스 뇌 플 라크 (g) Aβ (h) Aβ 병리학 APP/PS1 마우스 뇌, 그리고 (나) 지방 생 검에 transthyretin 인간 환자에서 아 밀 로이드의 진단 샘플에서 얼룩 표준 콩고 레드 (CR) 점수에 따라 1-4 등급. 노란색 영역 표시 hFTAA 녹말 체 예금 스테인드과 파란색은 지방 조직에서 autofluorescence. 스케일 바 길이 각 패널에 지정 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig2.jpg"> 
그림 2: 공동 항 체와 얼룩의 예. (a) 공동 얼룩 방지 혈 청 아 밀 로이드 단백질 A (AA) 면역 형광 검사와 같은 섹션에 인간의 AA 아 밀 로이드의 hFTAA. 왼쪽 위: AA 항 체 방출 640 nm; 488에서 상단 오른쪽 hFTAA nm; 하단 패널 오버레이 이미지 보여주는 colocalization 노란색. (b) 항 체 얼룩이 지 고 hFTAA 형광 연속 섹션에. 상단 패널: AA 항 체 DAB 얼룩, 하단 패널: hFTAA longpass 방출 필터 몇 군데. 눈금 막대: 100 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig3.jpg"> 
그림 3: 메이어의 되며/콩고 레드 (d는-)와 메이어의 되며/hFTAA (e) 얼룩진 인간의 마음에 transthyretin 아 밀 로이드에 짧은 패스 필터 형광을 비교 합니다. (한) 대물 이미지, (b) 대물 + 형광, (c) 대물 + 교차 편광판, (d) 대물 형광 + 교차 편광판, 405에서 (e) hFTAA 형광nm + 480 nm 여기 (연속 섹션d 는-). 눈금 막대: 100 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig4.jpg"> 
그림 4: 동일한 개체를 hFTAA로 얼룩진 여러 기술로 몇 군데는 세 APP23 마우스에 한 Aβ 패를 사용 하 여 보여 줍니다. hFTAA의 (a) 형광 속성의 구조적 상태에 의해 결정 됩니다. 평면 및 꼬인 상태에서 hFTAA의 구조에 표시 됩니다. (b) Hyperspectral 연속 방출 스펙트럼의 평가 대 한 이미지입니다. 하단 패널에서 스펙트럼은 색상 이미지의 박스형된 지역에 따라. (c) (i) Confocal 영상 여기 이미징 및 (ii 및 iii) 스펙트럼에 대 한 고 필터 모드 또는 (iv) 스펙트럼 모드에서 방출 영상. 아 밀 로이드, 어디 Aβ 플 라크의 주변에서 발견 되는 더 짧은 수명 그리고 생활 번 더 플 라크의 센터에 있는 구조적 차이의 탐지를 위한 (d) 형광 일생 이미지입니다. 하단 패널에 히스토그램 전체 플 라크에 대 한 생활 시간의 분포를 보여줍니다. 이미지는 히스토그램 아래 규모에 따라 채색 된다. (e) Confocal Z-스택 개체의 3 차원 구조를 표시 하려면 필터 모드에서 수집. 스케일 바 길이 각 패널에 지정 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

아 밀 로이드 증 착 다른 질병의 특징은 고 고생 많은 다른 기관. 이 문서에서는 발광 활용된 oligothiophene 형광 형광 현미경 검사 법 기술 함께에서 얼룩의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이 얼룩 메서드 검색 및 임상과 과학적인 설정에 단백질의 탐사를 위한 강력한 도구를 나타냅니다.

Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

이 방법의 전반적인 목표는 임상 및 과학적 설정 모두에서 단백질 응집체 침전물을 검출하는 것입니다. 프리온 질환 및 알츠하이머병 동물 모델 조직의 Hepta formyl thiophene acetic acid 염색 및 분석 과정이 설명되어 있습니다. 이 방법은 소량의 단백질 응집체 존재 여부 및 그 고유한 구조적 변이와 같은 아밀로이드 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 장점은 다른 기존 기술보다 선택성과 민감도가 더 높다는 점입니다. 원하는 시각화 기술에 맞춰 프로브를 맞춤 제작할 수 있으므로, 이 기술의 활용 범위는 다양한 단백질 미스폴딩 질환의 치료 및 진단으로 확장됩니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자들은 hFTAA가 매우 낮은 염색 농도를 요구하기 때문에 어려움을 겪습니다.HFTAA는 또한 기존 염료에 비해 더 긴 들뜸 및 방출 파장을 나타냅니다. 동결건조된 hFTAA를 2 mM 수산화나트륨에 재현탁하여 1 mg/mL 농도의 스톡 용액을 제조함으로써 발광 공액 올리고티오펜 용액을 준비하십시오. 스톡 용액을 유리 바이알에 옮겨 4 °C에서 보관하십시오.포르말린 고정 파라핀 임베딩 절편을 사용하는 경우, 자일렌에서 하룻밤 동안 탈파라핀 처리를 합니다. 염색 당일에 절편을 99% ethanol, 70% ethanol, dH2O, PBS 순의 용액에 각각 10분씩 담급니다. 그 후, 조직 절편을 상온 조건에서 건조시킵니다.조직이 마르는 동안, 스탁 용액을 PBS로 1:10,000 비율로 희석하여 hFTAA 작업 용액을 준비합니다. 조직이 마르면, 각 조직 절편이 덮일 정도로 hFTAA 작업 용액을 몇 방울씩 첨가합니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다.500 µL의 PBS로 염색액을 씻어낸 다음, 슬라이드를 PBS 배스에 10분 동안 담급니다. 절편을 상온에서 건조시킨 후, 형광 마운팅 매질을 사용하여 마운팅합니다. 마운팅 매질이 하룻밤 동안 안정되도록 둡니다.아밀로이드 검출은 마운팅 직후 또는 마운팅 없이도 수행할 수 있습니다. 하지만 실험의 목적이 고품질의 스펙트럼 정보를 수집하는 것이라면, 하룻밤 동안 배양하는 것이 바람직합니다. 현미경 소프트웨어를 실행하고, 프로젝트 이름을 지정한 뒤, 스펙트럼 이미지를 선택하고 획득을 시작하십시오.436 nanometer 여기 필터를 사용하여 접안렌즈를 통해 관심 대상을 선택하고 광로를 카메라로 전환합니다. 케이스 데이터 매니저에서 샘플 유형을 spectral로 선택하고 샘플에 라벨을 지정한 후 acquire를 누릅니다. 그러면 획득 창이 열립니다.스펙트럼 이미징 상태에서 설정 메뉴를 열고, 획득 속성(acquisition properties)을 선택한 뒤, 스펙트럼 범위를 460에서 700으로, 속도 품질을 최대 속도로, 측정 유형을 가스 레이저 협대역 필터(gas laser narrow filters)로 설정하십시오. 대화 상자를 닫습니다. 이미지 메뉴에서 라이브 풀(live full)을 선택하십시오.아이콘 바에서 프린지(fringes) 설정을 끕니다. 이미징할 영역을 선택하고 피크 메모리 값이 800 megabytes 미만인지 확인하십시오. 전체 이미지 밝기가 1, 000에서 3, 000 사이가 되도록 노출 시간을 설정하십시오.아이콘 바에서 색상 카메라 버튼을 누르십시오. 그러면 획득이 시작됩니다. 이미지 획득이 완료되면, 분광 이미지 획득 대화 상자에서 save를 누르고 케이스 데이터 관리자 대화 상자에서 new cell을 누르십시오.케이스 데이터 관리자에서 분석 시작 버튼을 사용하여 수집된 이미지를 엽니다. 데이터 분석 창이 열립니다. 스펙트럼 표시 대화 상자를 사용하여 ROI를 선택함으로써 이미지의 각 픽셀에서 스펙트럼 정보를 수집할 수 있습니다.이미지의 관련 영역에서 ROI를 정의하고 선택하십시오. Lib 버튼을 사용하여 스펙트럼 데이터를 텍스트 파일로 저장하십시오. 저장된 txt 파일은 원하는 분석 소프트웨어로 가져올 수 있습니다.현미경 소프트웨어를 열고 공초점 현미경 설정을 시작합니다. 레이저 강도는 0.2%, 핀홀은 1 Airy unit, 프레임 크기는 1,024 x 1,024 픽셀, 스캔 속도는 7(16회 스캔 평균화), 비트 깊이는 8비트로 설정합니다. 방출 스펙트럼을 수집하려면 람다 모드를 선택하고 아르곤 레이저를 488 nanometers로 설정하십시오.32 채널 gasp 검출기의 22개 채널을 사용하여 499에서 691 나노미터 사이의 방출광을 수집하십시오. 게인을 755로 설정하십시오. 라이브 버튼을 클릭하고 팔레트를 범위 표시기로 변경한 후, 빨간색으로 표시되는 과포화 픽셀이 없도록 게인을 조정하십시오.정지 버튼을 클릭한 다음 스냅 버튼을 눌러 이미지를 캡처하십시오. 단일 채널 이미지를 얻으려면 스마트 설정 옵션을 선택하십시오. FITC와 Alexa 532를 선택하십시오.선형 언믹싱(linear unmixing)을 선택하고 적용하십시오. 픽셀이 과포화되지 않도록 게인(gain)을 조정합니다. 라이브 모드 동안 FITC의 게인은 693으로, Alexa 532의 게인은 433으로 설정하십시오.정지 버튼을 클릭한 후 스냅 버튼으로 이미지를 캡처하십시오. 현미경을 FLIM 모드로 전환합니다. 핀홀은 20, 들뜸 파장은 490 nanometers, 레이저 강도는 0.5%로 설정하십시오. 40 megahertz의 펄스 레이저를 사용하십시오.FLIM 소프트웨어에서 550nm 이상으로 광자 계수를 설정하십시오. 디스플레이 파라미터 창에서 최대 계수가 약 4,000 photon counts가 될 때까지 광자 계수를 추적하십시오. 파일을 저장하고 SPC 이미지로 내보내십시오.이 이미지는 DAPI로 대조 염색한 간세포 내의 케라틴 응집체로 구성된 Mallory-Denk 소체를 보여줍니다. 여기서는 산발성 봉입체 근염 골격근 조직에서 P62 양성 봉입체가 나타나 있습니다. 이 이미지는 인간 췌장의 췌도 아밀로이드 폴리펩타이드 아밀로이드 봉입체를 보여줍니다.인간 장 내의 면역글로불린 경쇄 아밀로이드 침착물이 여기에 표시되어 있습니다. 이 이미지는 생쥐 뇌 내의 양 스크래피 프리온 단백질 응집체 침착물을 보여줍니다. 만성 소모성 질병에 감염된 생쥐 뇌의 프리온 단백질 응집체가 여기에 표시되어 있습니다.이 이미지는 APP23 생쥐 뇌의 A-beta-아밀로이드 플라크를 보여줍니다. 그리고 이 이미지는 APP-PS1 생쥐 뇌의 A-beta 병변을 보여줍니다. 이들은 표준 Congo Red 점수 산정 방식에 따라 1에서 4등급으로 분류된 인간 환자의 트랜스티레틴 아밀로이드 진단 샘플에서 얻은 지방 생검 도말 표본입니다.노란색 영역은 hFTAA로 염색된 트랜스티레틴 아밀로이드 침착물을 나타내며, 파란색은 지방 조직의 자가형광입니다. 이 절차를 수행할 때, 적절히 낮은 농도로 염색하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 또한, 최대한의 대비를 얻고 자가형광 및 배경 염색 형광을 방지하기 위해 롱패스 필터를 사용하십시오.이 절차에 따라, 응집된 단백질과 공동 응집된 단백질을 식별하기 위해 면역형광법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 아밀로이드증 분야의 연구자들은 단백질 응집 구조를 탐구할 수 있게 되었으며, 유기 화학 분야에서는 이러한 표적을 위한 새로운 프로브를 설계할 수 있는 길이 열렸습니다. 이 영상을 시청한 후에는 각각 다른 기술로 이미징하기 위한 LCO 염색 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 형광 이미징을 위해 발광 결합 올리고티오펜 염료(헵타머-포르밀 티오펜 아세트산 또는 hFTAA)를 사용하여 조직 절편의 아밀로이드를 염색하는 기술에 대해 설명합니다. 아밀로이드는 β장이 풍부한 비정상 단백질 응집체입니다. 조직 샘플에서 이들을 검출하면 아밀로이드 관련 질환 또는 단백병증의 진단 및 치료에 도움이 됩니다.

아밀로이드 침전물의 hFTAA 염색: 조직 절편에서 형광 이미징을 위해 올리고티오펜 기반 염료를 사용하여 아밀로이드 피브릴을 시각화하는 기술

출처: Nyström, S., et al., 초분광 컨포칼 현미경 및 형광 수명 이미징에 의한 발광 복합 올리고티오펜으로 염색된 아밀로이드 조직 이미징. J. Vis. 특급 (2017). 이 동영상은 hFTAA 염료를 사용하여 아밀로이드 조직을 반영하는 색상으로 구분된 이미지에서 소형 코어를 파란색/녹색으로, 불안정한 주변부를 빨간색/노란색으로 표시하여 형광 수명 이미징 현미경 또는 FLIM으로 아밀로이드 구조를 분석하는 방법을 보여줍니다.

Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 사용한 조직 절편의 아밀로이드 구조 분석

우리는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 기초 판독하여 단백질 상호 작용을 분석 자동화 형광 수명 이미징 (FLIM)을 이용하는 오픈 소스 고 함량 분석 (HCA) 기기를 제시한다. 이 openFLIM-HCA 기기에 대한 데이터 수집은 소프트웨어 μManager 작성 및 데이터 분석 FLIMfit에 착수에 의해 제어된다.

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

생물 학적 샘플의 배경 autofluorescence는 종종 형광 기반 이미징 기술을, 특히 세 인간의 postmitotic 조직에에서 복잡. 이 프로토콜에 설명 합니다이 예제에서 autofluorescence를 효과적으로 제거 될 수 있다 어떻게 photobleach immunostaining 이전 샘플 소스를 상업적으로 사용할 수 있는 발광 다이오드 빛을 사용 하 여.

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 대 한 포 르 말린 고정 뇌 조직에 배경 형광의 간단한 제거

이 프로토콜에는 포스터 공명 에너지 전달, 및 현미경 이미징 형광 수명에 따라 무 단백질의 복잡 한 형성의 양적 시각화에 대 한 허용 하는 새로운 방법을 설명 합니다.

형광 일생 화상 현미경 검사 법에 의해 인신 매매 세포내 올 무를 떠 올 리

형광 일생 화상 진찰은 생활, 노화 및 응력 C. elegans 질병 모형에 있는 단백질의 집합 경향을 정량화하고 구별합니다.

형광 일생 화상 진찰을 사용하여 노화 C. Elegans에 있는 아밀로이드 구조물의 특성화

이 논문은 긴 붕괴 방출 샘플의 거시적 광발광 수명 이미징을 위한 새롭고 빠른 광학 이미저의 사용에 대해 설명합니다. 통합, 이미지 획득 및 분석 절차는 이미징을 위한 센서 재료의 준비 및 특성화와 생물학적 샘플 연구에서 이미저의 적용과 함께 설명됩니다.

생물 의학 응용 분야를 위한 Fluorescence Lifetime Macro Imager

이 논문은 편광에 민감한 이광자 현미경을 적용하여 표지가 없는 아밀로이드 상부구조-구형석 내의 국소 조직을 특성화하는 방법을 설명합니다. 또한 샘플을 준비 및 측정하고, 필요한 설정을 조립하고, 데이터를 분석하여 아밀로이드 섬유의 국소 조직에 대한 정보를 얻는 방법을 설명합니다.

Label-free Amyloid Structural Characterization을 위한 편광에 민감한 2광자 현미경

여기에서는 후속 다중 파라미터 라이브 셀 현미경을 수행하기 위한 다양한 다세포 스페로이드 형성 방법을 설명합니다. 형광 평생 이미징 현미경(FLIM), 세포 자가형광, 염색 염료 및 나노 입자를 사용하여 살아있는 3차원(3D) 암 및 줄기 세포 유래 스페로이드에서 세포 대사, 저산소증 및 세포 사멸을 분석하는 접근 방식을 시연합니다.

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

IBEX(Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity)는 헤파린 차단을 추가하여 비특이적 결합을 최소화하고 스펙트럼 검출과 전산 혼합 해제를 활용하여 자가형광을 억제함으로써 기본 IBEX 기술을 기반으로 합니다. 이 접근 방식은 배경 소스를 줄이면서 이미지 획득을 가속화하여 강력한 다라운드, 고파라미터 공간 단백질체 분석을 가능하게 합니다.

비특이적 조직 형광을 최소화하기 위해 스펙트럼 공초점 현미경을 사용한 하이플렉스 이미징

학습하세요 형광 현미경과 스펙트럼 이미징을 활용한 hFTAA 염색법으로 조직 내 단백질 응집체를 검출하는 방법입니다. 이 기술은 프리온병과 알츠하이머병 연구에 탁월한 선택성과 민감도를 제공합니다.

Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

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