에있는 Apoptotic 세포를위한 Phagocytosis 검정 Drosophila 태아

우리는 여기에 Drosophila 의 분산 배아 세포를 사용하여 식균 작용 분석을 설명합니다. 그것은 우리가 생체 내 식균 작용 수준을 쉽고 정확하게 정량화 할 수있게하며, 세포 사멸 세포의 식균 작용에 필요한 새로운 분자를 확인합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 초파리에서 in vivo phagocytosis를 측정하여 apoptotic cell engulfment에 대한 특정 관심 유전자의 관여를 평가하는 것입니다. 이 방법은 세포사멸 세포 삼킴과 관련된 메커니즘에 대한 면역학 및 발달 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포를 사용하여 생체 내 식균 농도를 쉽고 정확하게 측정할 수 있다는 것입니다.

염증을 유발하는 위험한 세포를 제거하기 위해서는 식세포작용에 의한 자가사멸세포(apoptotic cell)가 필요하기 때문에 이 기술의 의미는 염증성 질환 및 자가면역 질환의 치료로 확장됩니다. 200마리의 성체 암컷과 200마리의 성체 수컷 초파리와 효모에 신선한 포도 주스 한천 한 접시를 50ml 원뿔형 튜브에 추가하는 것으로 시작합니다. 스폰지 캡으로 튜브를 닫고 섭씨 16도의 빛 속에서 2-3일 동안 파리를 배양합니다.

배화가 끝나면 파리를 어둠 속에서 섭씨 25도까지 1 시간 동안 옮기고 오래된 접시를 효모가없는 새 접시로 교체하십시오. 파리가 2시간 동안 알을 낳도록 합니다. 그런 다음 섭씨 16도에서 26시간 동안 플레이트를 배양합니다.

다음 날, 페인트 브러시를 사용하여 배아를 0.2%의 트리톤 X-100이 보충된 PBS 1ml로 옮깁니다. 두 번 씻은 후 차아염소산나트륨 용액 1.2ml를 배아에 첨가하여 융모막을 제거합니다. 3분 후, 새로운 PBS와 Triton X-100으로 배아를 4번 세척합니다.

세척된 배아를 6cm 아가로스 플레이트에 옮기고 플레이트를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 마이크로 팁을 사용하여 16기 배아를 식별합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 약 50개의 16기 배아를 1.5ml 마이크로 시험관으로 옮깁니다.

배아 세포를 분리하려면 먼저 150마이크로리터의 PBS로 배아를 두 번 세척합니다. 배아를 새로운 1.5ml 마이크로 시험관에 이식합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 콜라겐분해효소를 첨가하고 펠릿 믹서로 배아를 30회 균질화합니다.

균질화가 끝나면 배아 세포를 10회 분쇄하고 세포 현탁액을 새로운 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 1분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 세포를 10회 더 분쇄하고 섭씨 37도의 인큐베이터에 다시 1분 동안 다시 넣습니다.

두 번째 배양이 끝나면 800마이크로리터의 PBS를 세포에 첨가하고 원심분리로 세포를 수집합니다. 70미크론 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과하기 전에 200마이크로리터의 트립신에 펠릿을 재현탁합니다. 800 마이크로리터의 PBS에서 40 마이크로리터의 열 비활성화 소 태아 혈청으로 효소 활성을 중지하고 원심분리로 세포를 수집합니다.

침전된 세포를 200마이크로리터의 신선한 PBS에 재현탁시키고 다른 원심분리로 세포를 수집합니다. 펠릿을 30마이크로리터의 PBS에 재현탁하고 세포를 아미노프로필트리에톡시실란으로 코팅된 유리 슬라이드에 장착합니다. 세포가 부착되면 피펫을 사용하여 슬라이드에서 여분의 PBS를 제거하고 60-70 마이크로 리터의 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다.

10-15분 후 고정액을 제거하고 PBS에서 1분 동안 세포를 세척합니다. 항 Croquemort 항체로 세포를 면역 염색하려면 먼저 슬라이드를 메탄올에 연속적으로 담근 다음 0.2% Triton X-100을 보충한 PBS를 단독으로 사용합니다. 다음으로, PBS에 5% 전체 돼지 혈청 20마이크로리터와 0.2% Triton X-100을 실온에서 20분 동안 사용하여 비특이적 결합을 차단합니다.

과도한 차단 용액을 제거하고 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 20마이크로리터의 안티 크로크모트 안티세럼으로 세포에 라벨을 붙입니다. 다음 날 아침, PBS와 Triton X-100으로 슬라이드를 세척하여 10분씩 5회 배양합니다. 마지막 세척 후 PBS에서 슬라이드를 10분 동안 헹굽니다.

그런 다음 20마이크로리터의 알칼리성 인산가수분해효소 표지된 Anti-Rat IgG를 실온에서 1시간 동안 세포에 표시합니다. 배양이 끝나면 시연된 바와 같이 PBS와 Triton X-100으로 슬라이드를 5회 세척한 다음 완충 용액에 10분 동안 담가둡니다. 그런 다음 phosphatase 기질 용액으로 세포를 라벨링하고 광학 현미경으로 세포를 관찰합니다.

적혈구 과립에 강한 보라색 신호가 나타나면 과도한 기질을 제거하고 슬라이드를 EDTA가 보충된 완충액에 5-10분 동안 담그십시오. 배양이 끝나면 5분 PBS 세척 2회로 세포를 헹구고 10분 동안 평형 완충액으로 처리합니다. 용액을 제거한 후 20마이크로리터의 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 용액으로 세포에 37°C에서 1시간 동안 라벨을 붙입니다.

그런 다음 슬라이드에서 용액을 제거하고 세포를 0.5 밀리리터에 담그고 17 밀리리터의 물에 완충액을 10 분 동안 씻습니다. 다음으로, 5분 PBS 세척으로 세포를 3회 헹구고 실온에서 30분 동안 20마이크로리터의 안티 디곡시제닌 과산화효소로 라벨을 붙입니다. 배양이 끝나면 시연된 대로 PBS에서 세포를 4회 세척하고 세포사멸세포가 갈색으로 변할 때까지 30초 단위로 슬라이드를 과산화효소 기질에 담급니다.

최적의 염색이 이루어지면 슬라이드를 물에 담궈 과산화효소 반응을 멈춥니다. 이 이미지에서, hemocytes라고 불리는 Drosophila 대식세포는 hemocyte marker Croquemort와 분산된 배아 세포에서 TUNEL에 의한 phagocytosed apoptotic cell의 존재에 대해 염색되었습니다. Croquemort 양성 세포는 세포의 작은 과립에서 보라색 신호를 나타내는 반면 TUNEL 양성 세포는 전체 말뭉치에서 갈색 신호를 나타냅니다.

또는 혈구는 과립만 염색하는 대신 전체 혈구를 염색하는 항-GFP 항체로 염색할 수 있습니다. 이 실험에서는 야생형 또는 단일 돌연변이 배아에서 총 적혈구에 대한 식세포형성 적혈구의 비율을 분석하여 식세포 지수가 야생형 파리보다 단일 돌연변이 균주에서 더 낮았으며, 적혈구와 세포사멸세포의 총 수는 비슷하여 세포사멸세포 삼킴을 위한 돌연변이 유전자의 필요성을 나타냈습니다. 단일 유전자의 RNAi knockdown은 또한 phagocytic index를 감소시키는 반면 hemocytes 및 apoptotic cell의 총 수는 비슷하게 유지되어 apoptotic cell mediated phagocytosis에서 조사된 phagocytosis receptor의 관여를 더욱 강조합니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 15시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 세포의 식세포 능력에 대한 최적의 평가를 위해 과도한 혈구 마커와 TUNEL 염색을 피하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 모든 초파리 배아에 대한 현장 식세포작용 분석을 수행하여 삼킴 부위 또는 혈구의 분포에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.

개발 후, 이 기술은 면역학 분야의 연구자들이 초파리에서 세포사멸 세포 삼킴의 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 초파리 배아에서 생체 내 식세포작용을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.