생체 외에서 Fabry에 Pompe 질병 테스트 약리 보호자 응답성을 효소 측정

전 임상 재현, 빠르고, 효율적인 약리 보호자를 호출 하는 "고아" 약물의 소설 클래스에 대 한 테스트 있도록 수요가 있다. 우리 소설 약리 보호자 약물으로 서 적격 환자에 대 한 간단 하 고, 고도로 표준화, 다양 한 세포 문화 기반 분석 결과 화면을 개발 했다.

이 수정된 세포 배양 프로토콜의 전반적인 목표는 Fabry 및 Pompe 질병의 대립유전자 변이에 대한 신속한 표현형 평가를 제공하는 것입니다. 이 방법은 예후 결과 및 치료 결정과 같은 리소좀 저장 질환 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 재현성이 높고 pharmaco-chaperones와 같은 신약 개발에 도움이 될 수 있다는 것입니다.

부위 지시 돌연변이 유발을 수행하려면 참조 서열 NM 00169.2 및 NM 00152.4를 GLA 및 GAA 유전자의 돌연변이 유발에 대한 템플릿으로 각각 사용하는 것으로 시작합니다. 무료 Primer Design 도구를 사용하여 프라이머 설계를 지원할 수 있습니다. 그런 다음, 상업 공급자에 의해 합성된 고순도의 무염 프라이머 세트를 가지고 있으며, 센스 및 안티센스 프라이머는 각각의 염기 변형 중 하나를 운반하여 길이의 중심이 되어 개별적으로 돌연변이를 도입합니다.

50 마이크로리터 부피의 반응 혼합물을 준비하고 제조업체가 제공하고 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 표준 조건을 사용하여 PCR 프로그램을 실행합니다. PCR 후 1마이크로리터의 Dpn1 제한 효소를 첨가하고 반응 바이알을 섭씨 37도에서 1시간 동안 계속 배양합니다. 혈장 DNA를 유능한 대장균 세포로 형질전환하고 텍스트 프로토콜에 따라 원하는 형질전환의 플라스미드를 준비한 후 적절한 분자 생물학 도구를 사용하여 염기서열을 분석합니다.

원하는 돌연변이가 검출되고 알파-갈락토시다아제 A에 대한 NM 000169.2 또는 산 알파-갈락토시다아제에 대한 NM 000152.4와 비교하여 더 이상의 염기서열 이상이 보이지 않는 경우, transfection 등급 플라스미드 정제를 위한 클론을 선택합니다. 분광 광도계에서 흡광도를 측정하여 DNA의 순도를 측정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 T75 배양 플라스크에서 HEK293H세포를 배양한 후, transfection 24시간 전에 칼슘 또는 마그네슘이 없는 PBS를 사용하여 세포를 한 번 세척합니다.

0.05% Trypsin-EDTA로 세포를 수확하고 24웰 배양판의 구멍에서 10% FBS가 보충된 500마이크로리터의 DMEM을 사용하여 5개의 세포에 1.5배의 10을 파종합니다. 제조업체의 설명서에 따라 세포 transfection을 수행하십시오. 100마이크로리터의 무혈청 DMEM과 2.5마이크로리터의 트랜스펙션 시약에 용해된 1마이크로그램의 플라스미드 DNA 혼합물을 사용합니다.

용액을 실온에서 20분 동안 배양한 다음 적방울 방식으로 세포에 추가합니다. 섭씨 37도 및 5%CO2에서 4시간 후 트랜스펙션 시약이 포함된 배지를 제거하고 10% FBS 및 1%페니실린-스트렙토마이신이 함유된 500마이크로리터의 신선한 DMEM을 추가합니다. 이 단계에서 선택할 수 있는 옵션으로, DGJ 또는 DNJ를 의도한 배양 배지에 추가합니다.

수확 당일에는 인큐베이터에서 세포를 제거하십시오. 그런 다음 배지를 흡인하고 칼슘과 마그네슘이 함유된 PBS를 사용하여 세포를 조심스럽게 두 번 씻습니다. DGJ와 DNJ는 두 효소의 억제제이기 때문에 이 단계가 중요하며, 따라서 남은 효소는 테스트를 무효화합니다.

세척 후 200마이크로리터의 탈이온수를 세포 위에 직접 추가합니다. 그런 다음 플레이트에서 세포를 헹구고 1.5ml 반응 튜브로 옮깁니다. 샘플을 적절한 폼 랙에 놓고 5초 동안 와류로 가열하여 용해를 보다 효율적으로 만듭니다.

그런 다음 해동이 완료될 때까지 10초 동안 액체 질소와 실온 수조를 번갈아 가며 샘플을 사용합니다. 균질화 절차를 5 번 반복한 후에, 10, 000g에 5 분 동안 표본을 회전시키십시오. 그런 다음 상등액을 새 반응 튜브로 옮깁니다.

BCA 분석을 수행하려면 40마이크로리터의 탈이온화된 H20이 들어 있는 각 샘플에 대해 새 튜브를 준비하고 10마이크로리터의 샘플을 추가합니다. 각 용액을 간단히 와류로 혼합하고 각 시료 10마이크로리터를 96웰 플레이트의 공동으로 3중으로 옮깁니다. 표준 곡선을 준비하려면 텍스트 프로토콜에 따라 밀리리터당 2mg의 BSA 원액과 탈이온화된 H2O를 희석합니다.

시약 A와 시약 B를 결합한 후 200마이크로리터의 BCA 시약 용액을 첨가하여 반응을 시작하고 암흑 속에서 섭씨 37도 및 300rpm의 오비탈 쉐이커에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 플레이트 리더에서 560나노미터의 흡광도를 측정합니다. 샘플에는 일반적으로 마이크로리터당 1-1.5마이크로그램의 단백질이 포함되어 있습니다.

각 샘플의 계산된 양을 희석하고 새로운 1.5ml 반응 튜브에 피펫으로 넣어 용액 마이크로리터당 0.05마이크로그램의 알파-갈락토시다아제 A 또는 0.5마이크로그램의 산 알파-글루코시다아제를 얻습니다. 샘플을 다시 5초 동안 와류로 가열하고 이 희석액 10마이크로리터를 96웰 플레이트에 복제하여 피펫팅합니다. 각 기질 용액 20마이크로리터를 추가하여 반응을 시작합니다.

알파-갈락토시다아제 A의 경우, 0.06몰 인산염-구연산염 완충액, pH 4.7에 2개의 4-메틸룸벨리페릴 알파-D 갈락토피라노시드 또는 4-MU-gal을 첨가합니다. 산성 알파 글루코시다아제의 경우, 0.025 몰 나트륨 아세테이트, pH 4.0에 2 밀리 몰 4-메틸 룸벨 라이프릴 알파 -D 글루코피 라노 시드 또는 4-MU-glu를 첨가하십시오. 효소 반응을 섭씨 37도, 300rpm의 어둠 속에서 오비탈 쉐이커에서 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 200마이크로리터의 1.0몰 pH 10.5 조정 글리신 수산화나트륨 완충액을 첨가하여 반응을 종료합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 밀리리터 스톡당 0.01mg에서 4-MU의 표준 곡선을 준비하고 10마이크로리터의 용액을 복제하여 96웰 플레이트에 피펫팅합니다. 부피와 pH를 조정하기 위해 각 웰에 1.0 몰 글리신 수산화 나트륨 완충액 200 마이크로리터를 추가합니다.

마지막으로, 적절한 필터 세트가 장착된 형광 판독기에서 효소 활성을 측정합니다. 그리고 형광 판독기 장치에 적합한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. GLA 유전자 돌연변이 유발의 효과를 평가하기 위해 돌연변이를 세 가지 범주로 분류하고 첫 번째 시도에서 약 66.5%가 얻어진 것으로 나타났습니다.

약간 수정된 두 번째 PCR 후 추가로 25%를 얻을 수 있습니다. 범주 3에서는 원하는 클론을 얻기 위해 프라이머 재설계와 같은 더 많은 노력을 기울여야 했습니다. 이 표는 3개의 알파-갈락토시다아제 A 및 3개의 산성 알파-글루코시다아제 돌연변이가 처리되지 않았거나 DGJ 및 DNJ로 처리된 것에 대한 효소 활성 측정 결과를 나타냅니다.

데이터는 기질 회전율에 대한 절대값으로 표시되며 야생형 효소로 정규화된 상대 값을 갖습니다. 절대 효소 활성 데이터는 빈 pcDNA 3.1 벡터로 transfection된 세포를 사용하여 HEK293H 세포의 내인성 효소 활성에 대해 보정되었습니다. 효소 활성 값은 해당 실험에서 야생형 효소로 정규화되었으며, 이는 서로 다른 돌연변이 간의 상대 값의 편차를 설명합니다.

이 실험의 세포 배양 후 분획은 실습 시간의 대부분을 차지하는 과정을 마스터하면 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 리소좀 저장 질환 분야의 연구자들이 파브리병과 폼페병의 유전자형-표현형 상관관계를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 프로토콜은 리소좀 저장 질환의 신약 개발에 도움이 될 수 있습니다.