Name: 생체 외에서 Fabry에 Pompe 질병 테스트 약리 보호자 응답성을 효소 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 학습하세요 세포 배양 기반 분석법을 사용하여 Fabry 및 Pompe 질병의 대립유전자 변이를 신속하게 평가하는 방법을. 이 기술은 약리학적 샤페론 개발과 용해체 저장 질환의 치료 전략 수립에 활용됩니다.

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저자 맨디 Loebert 우수한 기술 지원을 티 나 Czajka를 인정 하 고 싶습니다. 우리는 편집 도움말 언어에 대 한 식물 루 오 (하버드의과 대학, 보스톤, 메사추세츠, 미국) 감사 합니다.

1. 준비의 돌연변이 pcDNA3.1/GLA와 pcDNA3.1/GAA 구문
참고: GLA 와 GAA 코딩 시퀀스 (cd)에 대 한 복제 전략 보고 이전15,18되었습니다.
<ol>
	<li>사이트 감독 Mutagenesis 사이트 지시 된 Mutagenesis를 사용 하 여
	<ol>
		<li>참조를 사용 하 여 시퀀스 NM_000169.2 및 NM_000152.4 mutagenesis GLA 와 GAA 유전자의에 대 한 템플릿으로 각각. 고 순도 소금 무료 뇌관 (25-37-mers) 개별적으로 돌연변이 소개 하는 그들의 길이 중앙 각각 시퀀스 수정 중 하나를 들고와 antisense 뇌관으로 상업적인 공급자에 의해 합성의 세트가 있다. 무료 뇌관 설계 도구를 사용 하 여 뇌관 디자인19를 지원 하기 위해.</li>
		<li>반응 혼합물 반응 솔루션에 대 한 표준 조건 및 제조업체에서 제공 하는 PCR 상태를 사용 하 여.<ol>
			<li>믹스 5 µ L 반응 버퍼, 10 x 10의 더블-좌초 템플릿 플라스 미드 DNA (pcDNA3.1/GLA 또는 pcDNA3.1/GAA)의 ng 125 각 뇌관의, 제공된 dNTP 혼합물의 1 µ L, 이온된 수 (최종 반응 볼륨의 적절 한 볼륨 시 약 DMSO의 3 µ L : 50 Μ L). 마지막으로, 2.5 U의 DNA 중 합 효소를 추가 하 고 아래로 pipetting으로 혼합. 부정적인 통제로 아니 뇌관 샘플 따라 수행.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>다음 프로그램을 사용 하 여 PCR을 시작: 1 분 1: 95 ° C 단계, 단계 2: 95 ° C 50에 대 한 s, 단계 3시 60분 ° C 50에 대 한 s, 8 분 4: 68 ° C 단계, 18 번, 2-4 단계를 반복 하 고 단계 5: 68 ° C 10 분.<ol>
			<li>Dpn의 1 µ L 추가 PCR, 다음 나 제한 효소 (10 U / µ L)와 추가 1 시간 동안 37 ° C에서 반응 유리병을 품 어.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>변환 및 원하는 클론을 위한 심사
	<ol>
		<li>제조업체의 권장 사항 따라 ultracompetent 셀의 약 수를 변환 합니다. 사용 SOC 매체 (0.5% (w/v), NaCl 10 m m, KCl 2.5 m m를 추출, 121 ° c, 소독 및 살 균 필터링 솔루션 MgCl2 , 10 및 20 m m의 최종 농도까지 포도 당을 각각 추가 tryptone 2% (w/v), 효 모) 제조업체의 대신 중간입니다. 절차 후 샘플 mutagenesis는 파운드에의 플레이트 250 µ L 플레이트 포함 100 µ g/mL 암 피 실린 고 18 h 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>Transformants의 수는 보장 &#62; 10 반응 생성 적어도 3 배 많은 식민지는 no-뇌관 제어 반응으로, 예를 들면, 식민지 계산을 촉진 하기 위하여 발광 격판덮개를 사용 하 여. 3 식민지를 선택 그리고 파운드 국물 매체에서 하룻밤 문화 3 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>다음 날, 플라스 미드 준비 표준 키트와 함께 수행 하 고 t 7을 사용 하 여 전체 시퀀스 분석 (5ʹ-TAA 전술 GAC TCA CTA 태그 GG-3ʹ) BGHr (5ʹ 태그 아 그 GCA CAG TCG AGG-3ʹ) 뇌관 통해 표준 생어 시퀀싱 및.</li>
		<li>분자 생물학 적당 한 도구를 사용 하 여 시퀀스를 분석 하. 원하는 돌연변이 검출 될 때 없고 더 이상 NM_000169.2 (α-galactosidase A)에 비해 시퀀스 또는 NM_000152.4 (산 성 α-glucosidase) 본, transfection 급 플라스 미드 정화에 대 한 복제를 선택 합니다.</li>
		<li>분 광 광도 계에서 흡 광도 측정 하 여 DNA의 순도 결정 합니다. 참고: 허용의 260/280 흡 광도 비율 플라스 미드 순도 항복 준비만 &#62; 셀 1.8 문화 실험.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2입니다. HEK293H 셀의 재배
<ol>
	<li>높은 포도 당 (4.5 g/L) Dulbecco´s 수정이 글 매체 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 보충에 HEK293H 세포를 유지 합니다. 셀 유지 한 5% CO2 분위기에서 37 ° C에서 인큐베이터 water-jacket.</li>
	<li>80-90%의 밀도를 세포 배양.</li>
	<li>매체를 발음 하 고 인산 염을 사용 하 여 버퍼링 없이 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +염 분 (PBS) 일단 씻어.</li>
	<li>0.05%를 추가 하 여 통로 트립 신-EDTA와 37 ° C, 5% CO25 분 동안 품 어.</li>
	<li>영구 문화를 유지 하기 위해 새로운 T75 플라스 크로 신선한 매체와 씨앗에 셀 1시 15분을 분할 한다. 25 이상 통행으로 셀을 사용 하지 마십시오.</li>
</ol>
3. pcDNA3.1/GLA와 pcDNA3.1/GAA 플라스 미드 Transfection 그리고 HEK293H의 치료
<ol>
	<li>transfection, 전에 24 시간 캘리포니아2 +, Mg2 +PBS 한번 T75 셀 문화 플라스 크에서 HEK293H 셀 세척. 위에 명시 된 트립 신-EDTA 0.05% 셀과 10% 보충 500 µ L DMEM 매체를 사용 하 여 24 잘 문화 판의 구멍에 씨앗 1.5 x 105 셀 수확 FBS 항생제 없이.</li>
	<li>제조업체의 설명서에 따라 transfection 프로토콜 수행 합니다. 일반적으로 혈 청 무료 DMEM의 100 µ L에 플라스 미드 DNA의 1 µ g의 transfection 시 약 2.5 µ L의 혼합물을 사용 합니다. 실 온에서 20 분 동안 incubate 고 그 후 drop-wise 방식으로 셀에 추가 합니다.</li>
	<li>37 °C/5% CO2 에서 4 h 기간 transfection 시 약을 포함 하는 매체를 제거 하 고 추가 10% 신선한 DMEM의 500 µ L FBS / 1% 페니실린/스. 참고:이 단계 1-Deoxygalactonojirimycin 염 산 염 (DGJ) 또는 1-Deoxynojirimycin 염 산 염 (DNJ) 추가할 수 있습니다 문화 매체에 의도 하는 곳 (20 µ M의 최종 농도 얻기 위해 10 mM의 수성 재고 솔루션을 사용 DGJ 및 DNJ ). 신선한 DGJ 또는 DNJ 플라스 미드 transfection 후 42 시간을 추가 되었습니다.</li>
</ol>
4. 세포 수확 및 α-galactosidase A 또는 산 성 α-glucosidase 활동 측정
<ol>
	<li>셀 수확
	<ol>
		<li>수확의 날, 인큐베이터에서 셀을 제거 하 고 매체를 발음 합니다. 조심 스럽게 셀 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +PBS로 2 회 세척. 참고:이 단계는 DGJ 및 DNJ는 α-galactosidase와 α-glucosidase의 강력한 억제제 각각, 어떤 남은 시험을 무효화 시키는 때문에 중요 한.</li>
		<li>셀 위에 직접 이온된 수의 200 µ L를 추가 합니다. 접시에서 셀 린스를 1.5 mL 반응 관에 그들을 전송 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>중지 및 재개 하 여 균질 화
	<ol>
		<li>적절 한 거품 랙 5 소용돌이에 샘플을 넣어 s는 세포 보다 효율적으로 만들기를. 액체 질소 10에 번갈아 샘플 넣어 s 및 실내 온도 물 목욕까지 완료 (5 분)는 녹고.</li>
		<li>5 번이이 절차를 반복 하 고 스핀에 10000 x g 5 분에 대 한 샘플.</li></ol></li></ol>상쾌한 및 새로운 반응 관에 피 펫을 유지 합니다.
	
	
	<li>단백질 농도 결심 bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과 사용 하 여
	<ol>
		<li>이온된 H2O의 40 µ L을 포함 하는 각 샘플에 대 한 신선한 튜브를 준비 하 고 샘플의 10 µ L를 추가 합니다. 짧게 vortexing에 의해 솔루션을 믹스와 10 µ L 96 잘 접시 (3 중에서 각 샘플)의 캐비티에 전송. 이온 H2O 다음과 같이 표준 곡선을 얻기 위해 2 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 재고 솔루션을 희석: 50 µ H L2O/50 µ L BSA; 60 µ L H2O/40 µ L BSA; 70 µ L H2O/30 µ L BSA; 80 µ L H2O/20 µ L BSA; 90 µ L H2O/10 µ L BSA; 100 µ L H2o.</li>
		<li>BCA 시 약의 200 µ L을 추가 하 여 반응을 시작 (시 약 A와 B 시 50: 1 비율로 혼합) 및 궤도 통 (300 rpm)에 약간의 동요에서 37 ° C에서 어둠 속에서 1 시간에 품 어. 560에서 흡 광도 측정 플레이트 리더에 nm. 참고: 샘플은 일반적으로 1 µ L 당 1.5 µ g 단백질 사이의 포함 되어 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>인공 4-Methylumbelliferyl 기판 (4-얼굴)와 효소 활동 측정
	<ol>
		<li>0.05 (대 한 α-galactosidase A) 또는 (산 성 α-glucosidase)에서 0.5 µ g 단백질 / µ L 솔루션을 얻기 위해 신선한 1.5 mL 반응 관에 각 샘플의 피펫으로 계산 된 금액을 희석. 와 동 5 다시 s를 피펫으로 10 µ L를 96으로이 희석의 샘플 잘 플레이트 (중복에서 각 샘플).</li>
		<li>반응이 각각 기판 솔루션의 20 µ L을 추가 하 여 시작: Α-galactosidase a: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside (4-뮤-gal) 0.06 M 인산 염 구 연산 염 버퍼, pH 4.7에서에서에 대 한. 산 성 α-glucosidase에 대 한: 2 mM 4 methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (4-뮤-glu) 0.025 M 아세트산 나트륨, pH 4.0에서에서.</li>
		<li>궤도 통 (300 rpm)에 약간의 동요에서 37 ° C에서 어둠 속에서 1 시간에 대 한 효소 반응을 품 어. 1.0 M, pH 10.5 조정된 글리신-NaOH 버퍼의 200 µ L의 추가 의해 반응 종료.</li>
		<li>다음과 같이 표준 곡선 4-methylumbelliferone (4-MU) 0.01 mg/mL 주식에서의 준비: 100 µ L H2O / 아니 4-무; 80 µ L H2O / 20 µ L 4-무; 60 µ L H2O / 40 µ L 4-무; 40 µ L H2O / 60 µ L 4-무; 20 µ L H2O / 80 µ L 4-무; 아니 H2O / 100 µ L 4-뮤, 피펫으로 10 µ L 96 잘으로 각 희석의 (중복)에 접시와 볼륨 및 pH를 조정 하기 위하여 각 잘 하 1.0 M 글리신-NaOH 버퍼의 200 µ L를 추가.</li>
		<li>측정 형광 판독기에 효소 활동 적절 한 필터 집합 있고 형광 판독기 장치에 대 한 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다. 참고: 두 4-얼굴 기판 α-galactosidase A 또는 산 성 α-glucosidase 동안 4-무로 감소 된다. 출시 4-무 측정 될 수 있는 360와 465 nm에서 여기 및 방출 파장으로 각각 microplate 형광 판독기를 사용 하는 형광 색소 이다.</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Cardiff University. , 
 <a target="_blank" href="http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.">http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.</a> (2017).</li>
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<li>Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Chaperone+Therapy%3A+Preclinical+Development%2C+Clinical+Translation%2C+and+Prospects+for+the+Treatment+of+Lysosomal+Storage+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders.</a> Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).</li>
<li>Parenti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Chaperone+Enhances+Blood+%CE%B1-Glucosidase+Activity+in+Pompe+Disease+Patients+Treated+With+Enzyme+Replacement+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy.</a> Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

여기에 설명 된 프로토콜 대사의 유전 lysosomal 질병의 효소 손상 평가 대 한 강력한 결과 제공 합니다. 이 원고는 프로토콜 개정 출판 이전15입니다. 가장 중요 한 수정 포함 엄중 (즉, 돌연변이 벡터 구축 준비 과정), 세포 문화 프로토콜 (즉, HEK293H 셀 유지 보수 및 transfection 조건), 그리고 높은의 표준화 결과의 재현성에 매우 공헌한 실험 반복 (적어도 5)의 수입니다. 전부, 두 대상 유전자 mutagenesis에 쉽게 접근할 수 있으며 돌연변이의 다양성을 동시에 조립 될 수 있다. 상대적으로 높은 신호/잡음 비율 HEK293H 세포 내의 생 효소 활동은 무시할 수 1/50 (α-galactosidase A)과 지나치게 표현된 야생 유형 유전자의 1/20 (산 성 α-glucosidase) 고려 달성 했다. 따라서, 야생 유형 및 돌연변이 효소 사이 우수한 해상도가입니다. 총 단백질의 다른 금액 두 효소의 활동 분석 ...

12 lysosomal 저장 장애 (LSDs) 기본 유전자 변이 결과로 glycosidase 장애에 관련 된 이상 있다. Fabry (OMIM #301500) 병과 Pompe (OMIM #232300),1,2,3 보고 되었습니다, 이상의 500와 200 missense 돌연변이에 각각,는 총 변이 수의 약 60%에 해당 합니다. 수많은 새로운 유전자 이체는 아직도 확인 되 고, 많은 알 수 없는 의미. 광범위 한 생 화 확 적인 연구 공개 완전 한 손실-의-함수에 GLA 유전자의 특정 genotypes 지도 하지 않는다 (OMIM * 300644) Fabry 질병에 발생 하지만 열역학으로 호의 보인 접는 상태가4 실패 해당 효소 . ER 보존과 달리 기능적인 효소의 조 저하 발생합니다. 유사한 결론 Pompe 질병5를 포함 하 여 다른 LSDs에 그려 왔다. 또한, 효소 이체의 분자 특성 진단6, LSD 진행은 돌연변이의 특성에 따라 개별 과정 제안 시 변이의 임상 해석을 촉진 수 있습니다. 따라서, 임상 상담 및 치료 결정을 합리화 하기 위해서는 일반적으로 2 ~ 3 가지 임상 유형으로 기존의 분류를 재평가 해야 합니다.
효소 대체 요법 (ERT)는 두 질병 수 있습니다. 그러나, ERT, 두뇌와 골격 근육 등 영향을 받는 조직/장기에서 효능을 제한 했다. 또한, ERT의 치료 혜택을 위태롭게 하는 면역성 응답을 유도 수 있습니다. 약리학 보호자 (Pc)는 소위 응답 돌연변이 가진 환자에 대 한 매력적인 치료 대안 이다. Pc는 올바른 단백질 폴딩 및 차례로 바인딩과 그물 (응급실) 보존 및 응급실 관련 효소의 저하를 방지 하는 안정화에 대 한 분자 비 계 역할을 합니다. 또한, Pc 구두로 관리 될 수 있습니다 그리고 잠재적으로 혈액 뇌 장벽을 교차 수 있습니다. 따라서, PCT에 특정 genotypes 가진 환자를 치료를 위한 더 실행 가능한 옵션이 있을 수 있습니다. LSDs 응용 프로그램 PC에 광범위 한 검토를 위해 Parenti7에 의해 우수한 검토를 참조 하십시오.
질병을 일으키는 돌연변이 체 대립 유전자의 수백의 발견 전 임상 약물 테스트에 도전 하 고 맞춤된 의학 접근에 대 한 의무가 환자가의 간단 하 고 빠른, 매우 표준화 된 평가 필요로. LSD 유전자 돌연변이의 해로운 효과 평가 하 고 예측 PCT에 대 한 의무가 환자 후보 돌연변이 테스트, 신속 하 고 신뢰할 수 있는 효소 활동 측정 허용 하는 HEK293H 세포에 매우 표준화 초과 식 시스템은 개발. 유사한 이상 식 시스템 이전 COS-78,,910,11, HeLa 세포12또는 HEK293 Fabry Pompe 질병에 대 한 설명 되었습니다13 ,14,,1516 셀 glycosidase 유전자에 대 한.
아주 유사한 방법도 약리 보호자 질병의 치료에 대 한 응답을 예측 하는 "방법"으로 특허 되었습니다17 셀의 관련성을 나타내는 문화 시스템 임상 연습으로 통합 되 고.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II XL 부위 지시 돌연변이 유발 키트&nbsp;</td><td>Stratagene, La Jolla, CA, USA#</td><td>200522</td><td></td></tr><tr><td>프라이머 GLA[R301Q]-frw: 5&acute;- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[R301Q]-rev: 5&acute;- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-frw: 5&acute;-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-rev: 5&acute;-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-frw: 5&acute;-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A143T]-rev: 5&acute;-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[F455Y]-frw: 5&acute;-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[F455Y]-rev: 5&acute;-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-frw: 5&acute;-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-rev: 5&acute;-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[L552P]-frw: 5&acute;-TTG GGG GGA CCC CCC CCC AGG CGG CCA C-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-rev: 5&acute;-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>T7: 5&acute;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>BGHrev: 5&acute;-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Tryptone</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>8952.1</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>103,753</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1,064,041,000</td><td></td></tr><tr><td>Potasium chloride</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1,049,360,500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 x 6H2O</td><td>Merck, 다름슈타트, 독일</td><td>1,058,330,250</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-포도당 일수화물</td><td>Merck, 다름슈타트, 독일</td><td>1,083,422,500</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Merck, 다름슈타트, 독일</td><td>1,064,980,500</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>3908.2</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>X863.3</td><td></td></tr><tr><td>인산수소이나트륨</td><td>Merck, 다름슈타트, 독일</td><td>1,065,860,500</td><td></td></tr><tr><td>아세트산나트륨</td><td>Merck, 다름슈타트,</td><td>독일 1,062,640,050</td><td></td></tr><tr><td>빙초산</td><td>Sigma Aldrich, 뮌헨, 독일</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>X969.2</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td><td>ZymoResearch, Freiburg, Germany</td><td>D4020</td><td></td></tr><tr><td>QIAfilter Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>12245</td><td></td></tr><tr><td>HEK293H cell line</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td><td>11631-017&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s 수정된 독수리 미디엄&nbsp;</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 태아 소 혈청&nbsp;</td><td>GE Healthcare, South Logan, Utah, USA</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One</td><td>VWR International GmbH, Hannover, Germany</td><td>82050-854</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plates (24 well)</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Germany</td><td>831,836</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 96 well plate</td><td>Greiner bio one, Frickenhausen, Germany</td><td>655185</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal 반응관, 1,5mL&nbsp;</td><td>사르스테트, N&uuml; mbrecht, Germany</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich, 뮌헨, 독일</td><td>D9641</td><td></td></tr><tr><td>1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride&nbsp;</td><td>토론토 연구 화학, 토론토, 캐나다</td><td>D236500</td><td></td></tr><tr><td>1-Deoxynojirimycin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich, 뮌헨, 독일</td><td>D9305</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Thermo Scientific, Braunschweig, Germany</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific, Braunschweig, Germany</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>4-methylumbelliferone</td><td>Sigma Aldrich, 뮌헨, 독일</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &alpha;-D-galactopyranoside</td><td>Sigma Aldrich, 뮌헨, 독일</td><td>M7633</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &alpha;-D-glucopyranoside</td><td>Sigma Aldrich, 뮌헨, 독일</td><td>M9766</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호 </td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubator type T6</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany</td><td>n.a.Luminous</td><td></td></tr> <tr><td>Plate Gr. 2 E</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>P265.1</td><td></td></tr><tr><td>3130 xl 유전자 분석기&nbsp;</td><td>Applied Biosystems, 다름슈타트, 독일</td><td>n.a.GFL-3032</td><td></td></tr> <tr><td>박테리아 셰이커</td><td>GFL, 부르크베델, 독일&nbsp;</td><td>n.a.Avanti</td><td></td></tr> <tr><td>J-25 원심분리기</td><td>Beckman/Coulter, Krefeld, Germany</td><td>n.a.Ultraspec</td><td></td></tr> <tr><td>3100 pro 분광광도계</td><td>Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom</td><td>n.a.water-jacket</td><td></td></tr> <tr><td>incubator&nbsp;</td><td>Binder, Tuttlingen, Germany</td><td>n.a.Vortex</td><td></td></tr> <tr><td>Genie 1 터치 믹서</td><td>Scientific Industries, Bohemia, NY, USA</td><td>n.a.Z</td><td></td></tr> <tr><td>233 MK-2 냉장 마이크로튜브 원심분리기</td><td>Hermle, Tuttlingen, Germany&nbsp;</td><td>n.a.LaboStar</td><td></td></tr> <tr><td>초순수 장치</td><td>Siemens, Berlin, Germany</td><td>n.a.Thermo</td><td></td></tr> <tr><td>Shaker PST-60HL-4 orbital shaker</td><td>Biosan, Riga, Latvia</td><td>n.a.Tecan</td><td></td></tr> <tr><td>GENios Reader</td><td>Tecan, M&auml; nnedorf, 스위스</td><td>n.a.HI</td><td></td></tr> <tr><td>223 마이크로프로세서 pH 측정기</td><td>HANNA Instruments, Arvore, Portugal</td><td>n.a.CASY</td><td></td></tr><tr><td> Cell Counter + Analyser System Model TT</td><td>Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magellan 데이터 분석 소프트웨어 v6.6</td><td>Tecan, M&auml; nnedorf, 스위스</td><td>n.a.GraphPad</td><td></td></tr> <tr><td>Prism 5.04</td><td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; 미국</td><td>n.a.Microsoft</td><td></td></tr> <tr><td>Office 2010</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA</td><td>n.a.BioEdit</td><td></td></tr> <tr><td>Alignment Editor, V7.0.1</td><td>http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Abbreviations</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>frw = forward; rev = reverse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>n.a. = 해당 없음</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

생체 외에서 fabry에 pompe 질병 테스트 약리 보호자 응답성을 효소 측정

In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease

Lysosomal 저장 장애 (LSDs) 같은 희귀 monogenic 질병을 치료 하는 맞춤된 의학의 사용은 복잡 한 임상 시험 디자인, 높은 비용 및 낮은 환자 수에 의해 도전을 했습니다. 수백 개의 돌연변이 체 대립 유전자는 LSDs의 대부분에 연루 됩니다. 질병은 일반적으로 심각도 따라 2 ~ 3 가지 임상 유형으로 분류 됩니다. 또한, 유전자 형의 분자 특성 임상 결과 예측 하 고 환자 치료를 알릴 수 있습니다. 따라서, 우리는 heterologously-Fabry Pompe 질병에서 확인 된 돌연변이 표현 하는 HEK293H 세포에 따라 간단한 셀 문화 분석 결과를 개발 했다. 유사한 분석 결과 최근 Fabry 질병에 의무가 돌연변이 약리 보호자 치료 (에서 PCT)에 대 한 식별 하기 위해 전 임상 시험으로 도입 되었습니다. 이 원고는 PCT에 대 한 적격 환자 식별 Fabry Pompe 질병 유전자 이체의 신속한 phenotypic 평가 하 고 새로운 pharmacochaperones의 개발에 도움이 있습니다 개정된 셀 문화 분석 결과를 설명 합니다.

Mutagenesis 절차 GLA 유전자 mutagenesis의 효율성을 평가 하는 돌연변이 다음 범주 중 하나로 분류 되었다. 이 방법은 돌연변이 생성 하는 GLA 돌연변이의 66.5%에 대 한 첫 번째 시도에서 가져온 밝혔다. 약간 수정 된 두 번째 PCR 후 추가 25%를 얻을 수 있습니다.
카테고리 1:는 mutagenesis PCR 첫 번째 시도에서 효과적 이었습니다.
카테고리 2: 첫 번째 mutagenesis PCR 실패 (접시, 아니 삽입된 돌연변이에 식민지); 어 닐 링 온도 증가 시켜 같은 뇌관을 사용 하 여 반복 설정 68 ° C 효과적 이었습니다.
<p clas...

전 임상 재현, 빠르고, 효율적인 약리 보호자를 호출 하는 "고아" 약물의 소설 클래스에 대 한 테스트 있도록 수요가 있다. 우리 소설 약리 보호자 약물으로 서 적격 환자에 대 한 간단 하 고, 고도로 표준화, 다양 한 세포 문화 기반 분석 결과 화면을 개발 했다.

생체 외에서 Fabry에 Pompe 질병 테스트 약리 보호자 응답성을 효소 측정

The use of personalized medicine to treat rare monogenic diseases like lysosomal storage disorders (LSDs) is challenged by complex clinical trial designs, ...

이 수정된 세포 배양 프로토콜의 전반적인 목표는 Fabry 및 Pompe 질병의 대립유전자 변이에 대한 신속한 표현형 평가를 제공하는 것입니다. 이 방법은 예후 결과 및 치료 결정과 같은 리소좀 저장 질환 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 재현성이 높고 pharmaco-chaperones와 같은 신약 개발에 도움이 될 수 있다는 것입니다.부위 지시 돌연변이 유발을 수행하려면 참조 서열 NM 00169.2 및 NM 00152.4를 GLA 및 GAA 유전자의 돌연변이 유발에 대한 템플릿으로 각각 사용하는 것으로 시작합니다. 무료 Primer Design 도구를 사용하여 프라이머 설계를 지원할 수 있습니다. 그런 다음, 상업 공급자에 의해 합성된 고순도의 무염 프라이머 세트를 가지고 있으며, 센스 및 안티센스 프라이머는 각각의 염기 변형 중 하나를 운반하여 길이의 중심이 되어 개별적으로 돌연변이를 도입합니다.50 마이크로리터 부피의 반응 혼합물을 준비하고 제조업체가 제공하고 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 표준 조건을 사용하여 PCR 프로그램을 실행합니다. PCR 후 1마이크로리터의 Dpn1 제한 효소를 첨가하고 반응 바이알을 섭씨 37도에서 1시간 동안 계속 배양합니다. 혈장 DNA를 유능한 대장균 세포로 형질전환하고 텍스트 프로토콜에 따라 원하는 형질전환의 플라스미드를 준비한 후 적절한 분자 생물학 도구를 사용하여 염기서열을 분석합니다.원하는 돌연변이가 검출되고 알파-갈락토시다아제 A에 대한 NM 000169.2 또는 산 알파-갈락토시다아제에 대한 NM 000152.4와 비교하여 더 이상의 염기서열 이상이 보이지 않는 경우, transfection 등급 플라스미드 정제를 위한 클론을 선택합니다. 분광 광도계에서 흡광도를 측정하여 DNA의 순도를 측정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 T75 배양 플라스크에서 HEK293H세포를 배양한 후, transfection 24시간 전에 칼슘 또는 마그네슘이 없는 PBS를 사용하여 세포를 한 번 세척합니다.0.05% Trypsin-EDTA로 세포를 수확하고 24웰 배양판의 구멍에서 10% FBS가 보충된 500마이크로리터의 DMEM을 사용하여 5개의 세포에 1.5배의 10을 파종합니다. 제조업체의 설명서에 따라 세포 transfection을 수행하십시오. 100마이크로리터의 무혈청 DMEM과 2.5마이크로리터의 트랜스펙션 시약에 용해된 1마이크로그램의 플라스미드 DNA 혼합물을 사용합니다.용액을 실온에서 20분 동안 배양한 다음 적방울 방식으로 세포에 추가합니다. 섭씨 37도 및 5%CO2에서 4시간 후 트랜스펙션 시약이 포함된 배지를 제거하고 10% FBS 및 1%페니실린-스트렙토마이신이 함유된 500마이크로리터의 신선한 DMEM을 추가합니다. 이 단계에서 선택할 수 있는 옵션으로, DGJ 또는 DNJ를 의도한 배양 배지에 추가합니다.수확 당일에는 인큐베이터에서 세포를 제거하십시오. 그런 다음 배지를 흡인하고 칼슘과 마그네슘이 함유된 PBS를 사용하여 세포를 조심스럽게 두 번 씻습니다. DGJ와 DNJ는 두 효소의 억제제이기 때문에 이 단계가 중요하며, 따라서 남은 효소는 테스트를 무효화합니다.세척 후 200마이크로리터의 탈이온수를 세포 위에 직접 추가합니다. 그런 다음 플레이트에서 세포를 헹구고 1.5ml 반응 튜브로 옮깁니다. 샘플을 적절한 폼 랙에 놓고 5초 동안 와류로 가열하여 용해를 보다 효율적으로 만듭니다.그런 다음 해동이 완료될 때까지 10초 동안 액체 질소와 실온 수조를 번갈아 가며 샘플을 사용합니다. 균질화 절차를 5 번 반복한 후에, 10, 000g에 5 분 동안 표본을 회전시키십시오. 그런 다음 상등액을 새 반응 튜브로 옮깁니다.BCA 분석을 수행하려면 40마이크로리터의 탈이온화된 H20이 들어 있는 각 샘플에 대해 새 튜브를 준비하고 10마이크로리터의 샘플을 추가합니다. 각 용액을 간단히 와류로 혼합하고 각 시료 10마이크로리터를 96웰 플레이트의 공동으로 3중으로 옮깁니다. 표준 곡선을 준비하려면 텍스트 프로토콜에 따라 밀리리터당 2mg의 BSA 원액과 탈이온화된 H2O를 희석합니다.시약 A와 시약 B를 결합한 후 200마이크로리터의 BCA 시약 용액을 첨가하여 반응을 시작하고 암흑 속에서 섭씨 37도 및 300rpm의 오비탈 쉐이커에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 플레이트 리더에서 560나노미터의 흡광도를 측정합니다. 샘플에는 일반적으로 마이크로리터당 1-1.5마이크로그램의 단백질이 포함되어 있습니다.각 샘플의 계산된 양을 희석하고 새로운 1.5ml 반응 튜브에 피펫으로 넣어 용액 마이크로리터당 0.05마이크로그램의 알파-갈락토시다아제 A 또는 0.5마이크로그램의 산 알파-글루코시다아제를 얻습니다. 샘플을 다시 5초 동안 와류로 가열하고 이 희석액 10마이크로리터를 96웰 플레이트에 복제하여 피펫팅합니다. 각 기질 용액 20마이크로리터를 추가하여 반응을 시작합니다.알파-갈락토시다아제 A의 경우, 0.06몰 인산염-구연산염 완충액, pH 4.7에 2개의 4-메틸룸벨리페릴 알파-D 갈락토피라노시드 또는 4-MU-gal을 첨가합니다. 산성 알파 글루코시다아제의 경우, 0.025 몰 나트륨 아세테이트, pH 4.0에 2 밀리 몰 4-메틸 룸벨 라이프릴 알파 -D 글루코피 라노 시드 또는 4-MU-glu를 첨가하십시오. 효소 반응을 섭씨 37도, 300rpm의 어둠 속에서 오비탈 쉐이커에서 1시간 동안 배양합니다.그런 다음 200마이크로리터의 1.0몰 pH 10.5 조정 글리신 수산화나트륨 완충액을 첨가하여 반응을 종료합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 밀리리터 스톡당 0.01mg에서 4-MU의 표준 곡선을 준비하고 10마이크로리터의 용액을 복제하여 96웰 플레이트에 피펫팅합니다. 부피와 pH를 조정하기 위해 각 웰에 1.0 몰 글리신 수산화 나트륨 완충액 200 마이크로리터를 추가합니다.마지막으로, 적절한 필터 세트가 장착된 형광 판독기에서 효소 활성을 측정합니다. 그리고 형광 판독기 장치에 적합한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. GLA 유전자 돌연변이 유발의 효과를 평가하기 위해 돌연변이를 세 가지 범주로 분류하고 첫 번째 시도에서 약 66.5%가 얻어진 것으로 나타났습니다.약간 수정된 두 번째 PCR 후 추가로 25%를 얻을 수 있습니다. 범주 3에서는 원하는 클론을 얻기 위해 프라이머 재설계와 같은 더 많은 노력을 기울여야 했습니다. 이 표는 3개의 알파-갈락토시다아제 A 및 3개의 산성 알파-글루코시다아제 돌연변이가 처리되지 않았거나 DGJ 및 DNJ로 처리된 것에 대한 효소 활성 측정 결과를 나타냅니다.데이터는 기질 회전율에 대한 절대값으로 표시되며 야생형 효소로 정규화된 상대 값을 갖습니다. 절대 효소 활성 데이터는 빈 pcDNA 3.1 벡터로 transfection된 세포를 사용하여 HEK293H 세포의 내인성 효소 활성에 대해 보정되었습니다. 효소 활성 값은 해당 실험에서 야생형 효소로 정규화되었으며, 이는 서로 다른 돌연변이 간의 상대 값의 편차를 설명합니다.이 실험의 세포 배양 후 분획은 실습 시간의 대부분을 차지하는 과정을 마스터하면 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 리소좀 저장 질환 분야의 연구자들이 파브리병과 폼페병의 유전자형-표현형 상관관계를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 프로토콜은 리소좀 저장 질환의 신약 개발에 도움이 될 수 있습니다.

in-vitro-enzyme-measurement-to-test-pharmacological-chaperone

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 프로토콜의 열충격 후 세포내 단백질 refolding을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 활동에 영향을 미칠 수있는 분자 보호자 및 공동 요소 또는 혼합물과 같은 foldases을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 반딧불 루시페라제 활동은 보호자 역할 refolding 활동을 측정하는 기자로 사용됩니다.

세포 Refolding 분석

호흡과 산화 인산화와와 세포 생존에 관련된 mitochondrial 기능에 단백질 키나제 C (PKC) isozymes의 활성화 효과가 설명되어 있습니다. 접근 방식은 선택적으로 mitochondrial 기능과 세포의 에너지 상태를 결정하는 주요 세포 배양 및 assays의 다양한 PKC isozymes을 overexpress하는 adenoviral 기술을 적응.

신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

이 동영상은 합성 4-메틸룸벨리페릴 기질을 사용하여 샘플에서 α-갈락토시다아제 A 및 산 α-글루코시다아제에 대한 효소 활성의 체외 측정을 보여줍니다.

α-갈락토시다아제 A 및 산 α-글루코시다아제 효소 활성의 체외 측정

우리는 녹농균에서 유출 펌프의 체외 조사에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 리포좀 막 내에서 강력한 가역 및 조정할 수있는 양성자 기울기의 생성을 허용하고 따라서 protomotive 힘에 의해 격려하는 막 단백질에 적용 할 수 있어야한다.

녹농균에서 MexAB 유출 펌프의 체외 조사

본 보고서는 리슈마니아 세포 추출물을 사용하여 포스파티딜에탄올아민 메틸전이효소 활성을 측정하기 위한 체외 효소 분석을 설명합니다. 이 분석은 방사성 메틸기가 S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine에서 내인성 포스파티딜에탄올아민으로 전달되는 것을 기반으로 합니다.

시험 관내 분석에서 포스파티딜 메틸화 된 역가를 측정하는 방법

체외 ATPase 활성을 정량화하기 위한 기본 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 주어진 정제된 ATPase에 대한 활성 수준 및 요구 사항에 따라 최적화할 수 있습니다.

자질<em&gt; 체외</em효소 특성에 대한&gt; ATP 아제 활동

이 연구는 인간 골격근에서 미토콘드리아 산화 인산화(OXPHOS) 능력을 정량화하기 위한 생체 내 인-31 자기 공명 분광법(31PMRS) 기술의 실현 가능성을 보여줍니다.

인-31 자기 공명 분광학 : 측정을위한 도구 생체 미토콘드리아 산화 적 인산화 능력

여기에 제시된 기관지 충혈 충혈 또는 혈청과 같은 생물학적 유체에서 치티나제 활성을 측정하는 간단한 방법이 있다.

생물학적 샘플에서 치티나제 활성 측정

이 프로토콜은 GST 융합 TPR 모티프 공동 샤페론과 Hsp90 유래 펩타이드와 결합 된 수용자 구슬과 글루타티온 연결된 기증자 구슬을 사용하여 단백질 단백질 상호 작용을 조사하는 기술을 제시합니다. 우리는 Hsp90-FKBP51 또는 Hsp90-FKBP52 상호 작용을 중단하기 위하여 작은 분자를 스크린하기 위하여 이 기술을 사용하고 강력하고 선택적인 Hsp90-FKBP51 상호 작용 억제제를 확인했습니다.

동질적인 구드 기반 분석체를 사용하여 샤페론 - 코카페론 상호 작용의 연구

이 프로토콜은 히스톤 샤페론 올리고머화 및 안정성을 연구하기 위한 분석 크기 배제 크로마토그래피, 히스톤 샤페론-히스톤 상호작용을 밝히기 위한 풀다운 분석, 단백질 복합체의 화학량론을 분석하기 위한 AUC, 추정 히스톤 샤페론을 시험 관 내에서 기능적으로 특성화하기 위한 히스톤 샤페로닝 분석을 포함하는 일련의 방법을 설명합니다.

체외 분석, 풀다운 및 샤프롱 분석을 사용한 히스톤 샤페론의 특성 분석

이 프로토콜은 재조합 단백질 정제와 유비퀴틴 사슬 절단 분석을 결합하여 신경 발달 장애와 관련된 유전적 변이가 탈유비퀴틸화 효소 활성에 미치는 영향을 측정하는 방법을 설명합니다.

In vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay를 통한 신경 발달 장애 관련 Deubiquitylating Enzymes의 효소 활성 측정

학습하세요 세포 배양 기반 분석법을 사용하여 Fabry 및 Pompe 질병의 대립유전자 변이를 신속하게 평가하는 방법을. 이 기술은 약리학적 샤페론 개발과 용해체 저장 질환의 치료 전략 수립에 활용됩니다.

생체 외에서 Fabry에 Pompe 질병 테스트 약리 보호자 응답성을 효소 측정

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