성인 인간 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경의 고수익 문화의 간단한 세대

이 프로토콜의 전반적인 목표는 인간 성인 피부 섬유아세포에서 유도된 뉴런의 고수율 배양을 생성하는 것입니다. 이 방법은 세포의 나이를 유지하는 환자 기반 신경계의 퇴화를 허용하기 때문에 신경 장애 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 단 25일 만에 매우 표준화되고 효율적인 방식으로 모든 연령대의 사람들로부터 유도 뉴런을 생성할 수 있다는 것입니다.

이를 통해 질병 모델링, 독성학, 진단 및 매우 큰 규모의 약물 스크리닝 분석을 포함한 광범위한 생물 의학 응용 분야를 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 뇌 훈련을 하는 병동의 박사 과정 학생인 Shelby와 우리 연구실의 Karlonia입니다. 먼저 자동 세포 해동 시스템을 사용하여 성인 인간 피부 섬유아세포를 해동합니다.

자동 세포 계수기로 세포 수를 계수한 후 10ml의 섬유아세포 배지가 포함된 T-75 플라스크당 20만 개의 세포를 파딩합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 유지하십시오. 다음날, 오래된 배지를 새로운 섬유아세포 배지로 교체하십시오.

세포가 95% 포화도에 도달할 때까지 3-4일마다 섬유아세포 배지를 계속 교체하십시오. 재프로그래밍으로 인한 성인 인간 피부 섬유아세포를 도금하기 한 시간 전에 24웰 플레이트의 각 웰에 250마이크로리터의 0.1% 젤라틴을 코팅합니다. 접시를 섭씨 37도에서 배양합니다.

플라스크에서 섬유아세포 배지를 흡입하고 Dulbecco의 인산염 완충 식염수로 한 번 세척합니다. 세척 후 섭씨 37도에서 T-75 플라스크당 0.05%트립신 1.5ml로 세포를 3분 동안 용해합니다. 그런 다음 트립신 용액을 중화하기 위해 3ml의 섬유아세포 배지를 추가합니다.

15ml 튜브에서 분리된 세포를 플라스크의 세포를 두 번 씻어내어 냉각합니다. 그런 다음 400G에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상등액을 배출하고 세포 펠릿을 1ml의 섬유아세포 배지에 다시 현탁시킵니다.

그런 다음, 100, 000 세포를 달성하기 위해 섬유아세포 배지 13.2 밀리리터에 1, 320, 000 세포의 세포 현탁액을 준비합니다. 접시에서 젤라틴을 흡입한 후 Dulbecco의 인산염 완충 식염수로 접시를 두 번 씻습니다. 그런 다음 각 웰에 500마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하고 밤새 섭씨 37도에서 배양합니다.

13.2ml의 섬유아세포를 중간 섭씨 37도까지 데웁니다. 그런 다음 실온에서 층류 후드의 렌티바이러스 벡터를 해동합니다. transduction enhancer 없이 배지에 20의 다양한 감염으로 성인 인간 피부 섬유아세포를 감염시키는 데 필요한 양의 렌티바이러스를 추가합니다.

그런 다음 배지를 렌티바이러스 벡터를 추가하여 500마이크로리터의 섬유아세포 배지로 교체합니다. 밤새 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다. 다음 날, 렌티바이러스가 포함된 배지를 렌티바이러스 벡터가 없는 새로운 섬유아세포 배지로 교체합니다.

바이러스 transduction 후 3일째에 섬유아세포 배지를 제거하고 500마이크로리터의 초기 신경 세포 전환 배지를 추가합니다. 일주일에 두 번 또는 세 번, 각 웰에서 225마이크로리터의 오래된 배지를 250마이크로리터의 새로운 초기 뉴런 변환 배지로 교체하십시오. 바이러스 형질도입 후 18일째에 초기 신경세포 전환 배지를 제거하고 500마이크로리터의 후기 신경세포 전환 배지로 교체합니다.

25일째 또는 실험 종료일까지 이전과 같이 2-3일마다 배지를 계속 교체합니다. 1000마이크로리터 피펫을 사용하여 매체를 제거합니다. 그런 다음 각 웰에 250마이크로리터의 세포 해리제 2개를 추가하고 세포가 분리되어 단일 세포로 떠오를 때까지 플레이트를 10-20분 동안 인큐베이터에 그대로 둡니다.

그 동안 FACS 버퍼를 준비합니다. 1000 마이크로 리터 피펫으로 분쇄하십시오. 세포 덩어리가 남아 있으면 조금 더 오래 배양하십시오.

얻어진 단일 세포 현탁액을 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 후기 신경 세포 변환 배지로 웰을 두 번 플러시하고 동일한 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 400G에서 5분 동안 원심분리하고 초자연을 버립니다.

다음으로, 세포 펠릿을 200마이크로리터의 FACS 완충액에 다시 현탁시킵니다. 다시 400G에서 5분 동안 셀을 스핀다운하고 초자연을 버립니다. FACS 버퍼 및 원심분리기에서 셀을 다시 일시 중단합니다.

두 번 더 반복합니다. 그런 다음 인간 CD56 항체가 1-50 농도로 함유된 50마이크로리터의 FACS 완충액에 세포 펠릿을 빛에서 멀리 떨어진 얼음 위에서 15분 동안 다시 현탁시킵니다. 400G에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 세포 펠릿을 200마이크로리터의 FACS 완충액에 용해시켜 세포를 세척합니다.

다시 400G에서 5분 동안 세포를 원심분리한다. FACS 버퍼로 두 번 세척한 후 원심분리를 합니다. 마지막으로, 밀리리터당 10마이크로그램의 프로피듐 요오드화물을 함유한 200마이크로리터의 FACS 완충액에 다시 현탁합니다.

NCAM 항체 또는 프로피듐 요오드화물로 염색되지 않은 대조군 샘플의 형광 강도 수준을 기준으로 게이팅을 사용하여 NCAM 양성 및 프로피듐 요오드화물 음성 세포를 분류합니다. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산하고 후기 신경 세포 변환 배지가 있는 폴리-L-오르니틴 피브로넥틴 및 라미닌 코팅 플레이트에 센티미터 제곱당 50, 000개의 세포를 시드합니다. 실험 종료점까지 후기 신경 세포 전환 배지로 일주일에 2-3회 배지의 절반을 계속 변경합니다.

대표적인 위상차 이미지는 전환 기간 동안 세포의 형태학적 변화를 보여줍니다. 세포 형태학의 중요한 변화는 5일째부터 볼 수 있습니다. 22일째가 되면 세포의 약 절반이 뉴런으로 전환됩니다.

대표적인 아미노 형광 이미지는 세포에 표준 신경 마커가 있음을 보여줍니다. 25일째가 되면 세포는 신경 세포 형태를 얻고 MAP2 및 TAU와 같은 신경 세포 마커를 발현합니다. 핵은 DAPI로 염색됩니다.

이 비디오를 시청한 후에는 성인 인간 섬유아세포에서 유도 뉴런을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 여기에는 재프로그래밍을 위한 세포 도금, 바이러스 형질도입, 세포 유지 및 정제를 위한 FACS 분류가 포함됩니다. 이 기술의 개발은 신경 장애 분야의 연구자들이 질병과 관련된 다양한 특징과 잠재적 치료법을 연구할 수 있는 길을 열었습니다.

그리고 그것은 인간의 신경 시스템일 뿐만 아니라 환자와 질병에 특이적인 시스템에서 이루어질 수 있습니다.