Name: 전 비보 인간 면역 결핍 바이러스 1와 Histoculture 인간 림프 조직 및 여성 생식 기 점 막의 감염 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 학습하세요 인간 편도선 및 여성 생식기 점막을 이용한 HIV-1 ex vivo 감염 방법을 통해 바이러스 병원성과 전파 메커니즘을 연구하는 기법입니다. 이 모델은 조직의 원래 세포 구조를 2-3주간 유지하여 보다 정확한 감염 동태 분석이 가능합니다.

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이 작품은 재단 Blanceflor 본 콤 파 니 비시 옛 Bildt (http://blanceflor.se/), 에이즈 (http://www.aidsfond.se/, 참고 FOa2014-0006)와 피코 안드레아 전자 리비 Lorini (http에 대하여 재단 스웨덴 의사에서 교부 금에 의해 지원 되었다 : / / fondazionelorini.it/) 안드레아 Introini에.

인간의 조직의 컬렉션에 대 한 프로토콜 로컬 관할 당국에 의해 윤리적인 승인을 요구할 수 있습니다. 편도 선 수술, 자 군 절제 등 지정 된 수술의 경우는 표본은 연구 목적을 위해 특별히 수집 하 고 연구에 여겨진다 인간 대상 연구 (건강의 국가 학회. 인간 주제에 연구입니다. https://humansubjects.nih.gov/walkthrough-investigator#tabpanel11)입니다. 그러나, 조직 기증자 개인 및 의료 데이터를 가져오기 (예., 성별, 나이, 현재 약물 사용, 감염 등의 역사)를 해석 하는 실험 결과 동의 해야 하는 개인 정보 보호에 대 한 포즈 우려 도움이 될 수 있습니다 조직 컬렉션에 대 한 프로토콜에서 해결.
주의: 전체 프로시저가 수행 되어야 합니다 밖으로 생물 안전 캐비닛에. '건강 한' 개인에서 그들을 포함 하 여 모든 인간의 표본, 전염 성 요원을 항구 수 있습니다. 연산자는 실험 HIV의 사용을 포함 하지 않는 경우에 안전 하 게 처리 조직 표본, 혈액을 매개로 병원 체와 함께 작동 하도록 훈련을 받아야 한다. 조직 해 부 및 hiv 감염의 절차의 위험 평가 연산자 및 동료의 안전을 보장 하기 위해 훈련 된 직원에 의해 수행 되어야 합니다. HIV 감염의 사용 국가 유해 체액 및 혈액을 매개로 병원 균 연구소 관련 규정에 따라 전용된 biosafety 수준 2 또는 3 환경을 필요합니다.
1입니다. 젤라틴 스폰지의 준비
참고: 비록 그것이 엄격 하 게 조직 해 부 하기 전에 젤라틴 스폰지를 준비 하는 데 필요한, 그것은 더 편리 조직의 또는 많은 기증자에서 큰 금액을 처리 하는 경우에 특히, 여기에 설명 된 순서에 따라.
<ol><li>문화 매체 (CM)를 준비 하 고 항생제 솔루션 (Tircacillin-clavulanate 믹스) CMT (자료 테이블)을 사용 하기 전에 그것을 보충. 모든 남은 항생제 솔루션을 삭제 합니다. 참고: Ticarcillin 및 CMT에서 clavulanate 제대로 안정 있습니다. 필요한 경우, 다시 보충 CMT 항생제 솔루션 준비에서 약 24 시간 후. 매체 마다 24 h 동안 문화 explant을 항생제 솔루션을 추가 하는 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>CMT의 약 20-30 mL로 100 m m x 20 mm 페 트리 접시를 채우십시오. 참고:이 설정은 최적의 시간에 두 6-잘 접시 또는 한 12-잘 접시에 대 한 충분 한 젤라틴 스폰지를 준비 하는. 많은 접시 필요한 경우 속도 준비를 더 넓은 샬레와 큰 CMT 볼륨을 사용 합니다.</li>
	<li>소독 집게를 사용 하 여 배양 접시에 젤라틴 sponge(s)를 전송 합니다. 양쪽에 스폰지를 젖은 고 1 분 살 균 주걱을 사용 하 여 약 2 분 페 트리 접시의 바닥에 스폰지를 눌러에 대 한 매체를 흡수 하기 위해 스폰지. 참고:이 단계는 중요 한 중요성의 때문 스펀지에서 공기 방울의 존재는 문화 매체 영양소는 조직에 도달 하는 모세 혈관 차단입니다. 젤라틴 스폰지는 탈수 때 매우 취 성. 부드럽게 아래로 눌러 스폰지에 처음 특히 주걱으로 스폰지를 위반을 피하기 위해.</li>
	<li>약 1 c m2의 동일한 크기의 조각으로 rehydrated 젤라틴 스폰지를 잘라 사용 무 균가 위. 1 스폰지 조각 문화 접시의 각 음에 집게를 사용 하 여 전송 합니다. 12-잘 접시 (경부)에 각 음 6 잘 플레이트 (편도)의 그리고 잘 당 1 mL에 CMT의 3-4 mL를 추가 합니다. 조직 explants는 스폰지에 로드할 준비가 될 때까지 37 ° C, 5% CO2, ≥ 90% 습도 설정 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 참고: 접시에 추가 하는 CMT의 볼륨 explants는 액체-공기 인터페이스에서 유지 하는 스폰지의 두께를 조정 한다.</li>
</ol>2입니다. 인간의 편도 선 조직의 해 부
참고: 편도 해야 처리, 수술 후 즉시 이상적으로 수술 당일. 또는, 표본 남아 있을 수 있습니다 하룻밤에 잠긴된 CMT 4 ° c.에
<ol><li>CM 수 있도록 충분 한 시간을 실 온 (RT)에 도달 하거나 물 욕조에 넣어 37 ° c.에 미리 예 열 사용 하기 전에 항생제 솔루션 (CMT) CM를 보충 한다. 남은 모든 항생제 솔루션을 삭제 합니다. 포 셉, 메스 해 부 절차 동안 필요할 때마다을 깨끗 한 용기에 70% 에탄올 용액을 붓는 다. 도구를 청소 하 고 다른 기증자 로부터 표본 해 사이 메스 블레이드를 변경.</li>
	<li>소독 집게를 사용 하 여 CMT의 10-20 mL를 포함 하는 100 mm 페 트리 접시에 편도 운송 컨테이너에서 전송. 참고: 멎, 피 묻은, 광범위 한 분야와 표본 또는 괴 사 성 조직 폐기 해야한다.</li>
	<li>절단 표면으로 페 트리 접시의 뚜껑을 사용 하 여 조직 해 부. 집게와 조직을 부드럽게 잡고, 살 균 메스와 블레이드를 사용 하 여 여러 큰 조각으로 각 편도 선 잘라. 주의: 처리 날카로운 도구를 인간의 표본을 해 부 부상 및 오염 위험을 증가. 연산자 추가 보호로 금속, 메쉬, 절단 방지 장갑 착용을 고려해 야 합니다.</li>
	<li>제거, 피 묻은, 멎 고 섬유질 조직, 그리고 모든 부품 및/또는 녹색 갈색 색상으로 사용 하 여 집게 메스 tonsilloliths (석 회 질된 물질)을 포함 하. 참고: 조직에의 한 조각에 대 한 작업, 그것은 조직의 건조를 피하기 위해 중간에 빠져들 조직의 나머지를 유지 하는 것이 중요.</li>
	<li>두께에서 약 2 m m의 조각으로 각 조직 조각을 잘라. 이전 단계에서 모든 원치 않는 부분을 제거 합니다. 2 m m 두께 스트립에 조직 조각을 잘라. 2 m m 두꺼운 블록으로 조직 스트립을 잘라. 이 약 8 m m3의 조직 explants 될 해야 합니다.</li>
	<li>해 부와 함께 진행 하는 동안 조직의 건조를 피하기 위해 CMT의 10-20 mL를 포함 새로운 100 mm 페 트리 접시에는 explants 전송. 해 부의 끝에, 무작위로 explant 분포 접시를 소용돌이 친다. 장소 9 조직 explants 그들 사이 공간이 집게를 사용 하 여 6 잘 플레이트에 각 젤라틴 스폰지 위에. 인큐베이터에 접시를 반환 합니다. 참고: 일반적으로, explants 교양 하룻밤와 에이즈-1 문화의 접종 다음 날 수행 됩니다. 이것은 세균 이나 곰 팡이 오염 없이 문화에서 개발 다는 것을 확인 하입니다. 또한, 세포는 절 개 후 편도 선 조직 explants 탈출구 경향이 있다. 이 과정은 크게 문화1의 첫 24 시간 이내 완료 됩니다.</li>
	<li>유해 체액 및 특정 위험 평가 처리에 연구소의 규정에 따라 적절 한 컨테이너에서 모든 생물 학적 폐기물의 처분.</li>
</ol>3. 편도 선 조직 감염 Explants 에이즈-1
참고: 독립적인 실험 사이의 결과 변화를 줄이기 위해, 동일한 바이러스 준비 전체 연구를 위해 사용 될 해야 합니다. 것 활성화 된 주변 혈액 단 세포에 바이러스를 전파 수 고 표면에 뜨는 문화 반복 중지 및 재개 (자료 테이블)을 피하기 위해 aliquoted-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
<ol><li>37 ° c.에 미리 예 열 물 욕조에 CM을 넣어 사용 하기 전에 항생제 솔루션 (CMT) CM를 보충 한다. 모든 남은 항생제 솔루션을 삭제 합니다.</li>
	<li>피 펫과 6-잘 plate(s)에 매체를 발음 하 고 살 균 제 솔루션 컨테이너에서 삭제. 접시를 기울기와 잘 수 있도록 하단에 수집 하 고 발음 그것을 버리고 중간의 위쪽 부분에 젤라틴 스폰지를 부드럽게 밀어. 각 우물에 CMT의 3-4 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에 물 목욕에 있는 에이즈-1 바이러스 준비를 녹여 필요한 경우, CM (표 1)와 함께 바이러스 재고 희석. 참고: 선택한 inoculum 5-8 µ L (표 1)의 볼륨에 포함 된 있도록 바이러스 주식 희석 수 한다. 효율적인 감염, 그것은 녹고 HIV-1 준비와 조직 explants 감염 사이 필요한 최소 시간을 사용 하 여 중요 한.</li>
	<li>바로 위에 젤라틴 스펀지에 9 explants의 각 바이러스 inoculum 플라스틱 감염이 완료 되 자 마자 인큐베이터에는 plate(s)를 반환 합니다. 모든 잔여 바이러스 준비를 삭제 합니다. 섹션 5를 계속 합니다. 참고: 정확 하 게 제공 바이러스 inoculum 연산자를 고려해 야 역방향 pipetting 기술을 사용 하 여 모든 음에 대 한 팁을 변경 합니다. 이 피 펫 피스톤 지우기 위치 (두 번째 정류장)를 바이러스 inoculum, 아래로 밀어 포함 하 고 작은 반복된 샘플링 연관 거품 형성을 최소화 하 고 오류 inoculum을 전달 하기 위해 첫 번째 정류장에 추진 볼륨, 즉, 5-8 µ L.</li>
</ol>4. 해 부 및 자 궁 경부 점 막의 감염
참고: 최적의 결과 위해 자 궁 경부 거칠어 explants 해야 처리 되며 이상적으로 수술 당일 수술 후 가능한 한 빨리 감염. 또는, 표본 저장할 수 있습니다 하룻밤, 4 ° C에서 CMT에 잠수 하 고 감염 된 절 개 후 즉시.
<ol><li>CM 수 있도록 충분 한 시간을 RT에 도달 하거나 물 욕조에 넣어 37 ° c.에 미리 예 열 사용 하기 전에 항생제 솔루션 (CMT) CM를 보충 한다. 모든 남은 항생제 솔루션을 삭제 합니다. 집게와 메스 해 부 절차 동안 필요할 때마다을 깨끗 한 용기에 70% 에탄올 용액을 붓는 다. 도구를 청소 하 고 해 여러 기증자 로부터 표본 사이 메스 블레이드를 변경.</li>
	<li>소독 집게를 사용 하 여 전송할 샘플 운송 컨테이너에서 100 mm 페 트리 접시 CMT의 10-20 mL를 포함 하.</li>
	<li>절단 표면으로 페 트리 접시의 뚜껑을 사용 하 여 조직의 해 부. 집게, 조직 부드럽게 개최 ectocervix endocervix의 점 막 stromal 밑에서 고 점 막의 근육 조직 (submucosa) 메스와 블레이드를 제거 합니다. 참고: 조직에의 한 조각에 대 한 작업, 그것은 조직의 건조를 피하기 위해 중간에 빠져들 조직의 나머지를 유지 하는 것이 중요.</li>
	<li>점 막 2 m m 넓은 스트립으로 잘라 제거 하 고 조직의 단지 2 m m 두꺼운 층을 떠나 가능한 많은 submucosa 삭제. 2 m m 두꺼운 블록으로 스트립을 잘라. 이 약 8 m m3의 조직 explants 될 해야 합니다. 주의: 처리 날카로운 도구를 인간의 표본을 해 부 부상 및 오염 위험을 증가. 연산자 추가 보호로 금속, 메쉬, 절단 방지 장갑 착용을 고려해 야 합니다.</li>
	<li>해 부와 함께 진행 하는 동안 조직의 건조를 피하기 위해 CMT의 10-20 mL를 포함 새로운 100 mm 페 트리 접시에 전송 조직 explants. 해 부의 끝에, 무작위로 explant 분포 접시를 소용돌이 친다.</li>
	<li>살 균 겸 살 균 1.5 mL 원뿔 tube(s) (관 당 최대 16 explants)으로 explants 전송할. 피 펫을 사용 하 여 튜브에 모든 매체를 제거 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에 물 목욕에 있는 에이즈-1 준비 해 동 필요한 경우는 explants 포함 된 tube(s)에 CM. 전송 바이러스 바이러스 재고 희석. 모든 잔여 바이러스 준비를 삭제 합니다. 참고: 선택한 inoculum 최소 0.5 mL (표 1)의 볼륨에 포함 된 있도록 바이러스 주식 희석 수 한다. 독립적인 실험 사이의 결과 변화를 줄이기 위해, 동일한 바이러스 준비는 전체 연구 (자료 테이블)에 사용 되어야 한다.</li>
	<li>온도-통에 튜브를 전송 및 300 rpm에서 락 37 ° C에서 2 시간에 대 한 품 어. 부드럽게 튜브 몇 매 30-60 분 번 반전. 참고: 효율적인 감염, 그것은 녹고 HIV-1 준비 하 고 37 ° c.를 튜브를 전송 사이 필요한 최소 시간을 사용 하 여 중요 한</li>
	<li>3-4 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 당로 6-잘 접시를 채우십시오. 에 있는 에이즈-1 보육의 살 균 제 솔루션을 피 펫을 사용 하 여 컨테이너에는 tube(s)에서 모든 바이러스 준비 취소. 6 잘 플레이트 집게를 사용 하 여 PBS를 포함 하는 explants 전송할.</li>
	<li>RT, 1 분에 대 한 PBS에 나머지 explants 허용 하 고 다음 그들을 씻어 부드럽게 pipetting으로 위아래 PBS 우물에 2-3 번. 살 균 제 솔루션을 피 펫을 사용 하 여 컨테이너에 PBS를 삭제 합니다. 각 우물에 새로운 PBS의 3-4 mL를 추가 합니다. 3 세척의 총에 대 한 두 번 더 반복 합니다. 바로 조직의 건조를 피하기 위해 스폰지는 explants 전송 전에 PBS를 삭제 합니다. 참고: Explants 특정 endocervix, 그리고 자 궁 경부 점 막의 감염 시 점액의 큰 금액을 놓습니다. 그것은 씻어 explants 및 문화 상쾌한에 바이러스의 후속 릴리스 난다 보존 바이러스 복제를 마스크 수 있기 때문에 가능한 많은 점액을 제거 하는 중요 한.</li>
	<li>12-잘 접시에 각 젤라틴 스폰지 위에 5-8 explants 전송 집게를 사용 하 여. 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.</li>
	<li>유해 체액 및 특정 위험 평가 처리에 연구소의 규정에 따라 적절 한 컨테이너에서 모든 생물 학적 폐기물의 처분.</li>
</ol>5입니다. Histoculture
<ol><li>감염 된 후 12-15 날까지 감염의 시간에서 출발 3 일 마다 CM 변경 합니다. CM 및 explants는 다른 매개 변수 중 hiv-1 복제를 평가 하기 위해 문화 시간에 걸쳐 정기적으로 샘플링할 수 있다.</li>
	<li>37 ° c.에 미리 예 열 물 욕조에 CM을 넣어 참고: 그것은이 단계에서 항생제 솔루션 CM을 보완 하기 위해 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>피 펫와 CM의 샘플을 수집 하 고 살 균 1.5 또는 2 mL 나사 모자 tube(s)-80 ° c.에 저장용으로 전송 참고: 복제 우물에서 CM 컬렉션에서 풀링됩니다.</li>
	<li>소독 집게와 조직 explants 수확 (옵션), 종이에 그들을 배치 하 여 explants에 초과 매체를 제거 하 고 explants 살 균 1.5 또는 2 mL 나사 모자 tube(s)로 전송. 처리 하거나 실험에 의해 필요에 따라 조직 샘플을 저장 합니다. 참고: cytometry, 위해 explants는 즉시 소화 (자세한 내용은 참조 하십시오 참조 1, 9, 16, 및 17)에 대 한 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 효소 칵테일으로. RNA 추출 explants-80 ° c.에서 그들을 저장 하기 전에 하룻밤 4 ° C에서 RNA 안정화 솔루션에 유지 됩니다. DNA 추출 또는 제자리에 (자 궁 경부) 얼룩, explants 스냅-액체 질소 나 드라이 아이스/에탄올 슬러리에 냉동 고 수-80 ° c.에 저장 또는 편도 선 explants는 제자리에 얼룩에 대 한 PBS와 4 %paraformaldehyde 해결책에 있는 침수에 의해 해결할 수 있습니다.</li>
	<li>잔여 CM에는 피 펫을 잘 발음 하 고 살 균 제 솔루션 컨테이너에 그것을 폐기. 접시를 기울기 고 하단, 수집 매체 수 있도록 우물의 상단 부분에 젤라틴 스폰지를 부드럽게 밀어 고 발음 그것을 폐기.</li>
	<li>각 우물에 CM의 3-4 mL를 추가 합니다. 소독 집게를 사용 하 여 어떤 조직 explants는 젤라틴 스폰지를 중간에 반환 합니다. 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.</li>
	<li>문화의 끝에, 유해 체액 및 특정 위험 평가 처리에 연구소의 규정에 따라 적절 한 컨테이너에서 모든 생물 학적 폐기물의 처분.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

인간의 조직 사용 explants 에이즈-1 감염의 연구는 전통적인 bi 차원 및 monotypic 실험 시스템 1 차 셀 또는 셀 라인, 세포 상호 작용 재현 하 그들의 뛰어난 능력 때문에 이점을 제공 하 고 휴대 기능 vivo에서그들은 (예를 들어, cytokine 생산). 그럼에도 불구 하 고, 편도 선 및 자 궁 경부 조직 수, 및 HIV 대상 셀1,16의 phenotypic와 기능적 특성 등 여러 측면에서 다르다. 같은 이유로 HIV-1 변형 (예:, CCR5 회귀선 HIV-1발 CXCR4 회귀선 HIV-1LAI.04대) 아니라 다른 공동 수용 체 차 있는 굴곡 운동으로 편도 자 궁 경부 (표 1)에서 다르게 수행합니다. 대상 세포에서 면역 유도 및 이펙터에 에이즈 coreceptors의 배포 사이트...

여기 언급으로 종래의 monotypic bi 차원 세포 배양 조직을 구성 하는 세포 유형의 큰 다양성 및 기관 간의 공간 및 기능 통신에 대 한 계정을 하지 않습니다. 이 점은 질병의 실험 모델에 대 한 파라마운트 중요성의 방해가 homeostatic 세포 상호 작용은 모든 병 리의 운전 요인. 조직 explants 그들은 vivo에서, 비록 제한 된 양의 시간1대는 cytoarchitecture와 기관의 많은 중요 한 기능적 측면을 유지 하기 때문에 건강 및 인 간에 있는 질병을 모델링 하기 위한 주요 이점을 제공 합니다. 예를 들어 디프테리아 사망 toxoid 등 파상풍 사망 toxoid, 회 항으로 비보 전 도전 시 편도 선 조직 항 원 특정 항 체2의 활발 한 생산 응답합니다. 어떤 다른 비보 전 모델 처럼, histoculture는 그것의 자신의 제한이: 간 기증자, 조직 분극, 제한 된 조직 생존, 변화와 confocal 현미경 검사 법1의 깊이 넘어 셀 모니터링에 어려움. 그럼에도 불구 하 고, 인간의 조직 explants 호스트 병원 체 상호 작용 및 잠재적인 치료 내정간섭3를 포함 하 여 인간에서 항상성 및 병원 성 면역 과정을 공부 하는 선택의 모델을 남아 있다.
에이즈-1 병의 중요 한 이벤트는 조직에서 자리를 차지할. 생식 기 점 막의 감염 모든 hiv-1 전송 이벤트 전세계4의 대부분을 차지 한다. 림프 조직 급성 감염 시 바이러스 복제의 주요 사이트 latently 감염 세포5의 뜻깊은 수영장을 비호 하 고 그들의 지 속성 치료6을 달성 하기 위해 주요 장애물을 나타냅니다. 인간 림프 및 점 막 조직의 문화 및 비보 전 도전 에이즈-1의 연구에 대 한 격리 된 세포에 따라 기존의 시스템에 비해 몇 가지 장점을 제공 합니다. 예를 들어, 조직 상주 세포 주변 혈액 단 셀1반대로 exogenous 활성화의 부재에 에이즈-1 감염을 지원할 수 있습니다. 림프 조직 explants의 사용 기본 CD4 T 세포 소모즉, 방관자 효과7, 급성 감염의 특징은 몇 가지 주요 메커니즘의 더 나은 이해를 허용 했다. 림프 조직8 여 포 B 셀 등 여성 생식 기 점 막 explants9 상피 구조의 보전이이 사이트에서 에이즈-1 감염의 공간 및 기능 기능을 통합 독특한 기회를 제공 합니다. Antiretrovirals 및 multitarget microbicides12, 의 전 임상 시험에 대 한 뿐만 아니라 모델을 연구 및 herpesvirus 공동 감염10,11, histocultures 성공적으로 사용 되었다 마지막으로, 13 , 14 , 15.
여기, 편도 선 및 낮은 여성의 성 기 요로 (자 궁 경부)에서 점 막 조직에서 얻은 인간 조직 explants의 문화에 대 한 자세한 프로토콜 덮고 비 편광 방식으로 에이즈-1 도전 explant를 조직 해 부 설명 합니다. 문화 지원, 젤라틴 스폰지를 사용 하 여 액체 공기 인터페이스에서 조직 explants의 모세 혈관, 따라서 그들의 자연적인 감퇴를 지연 스폰지를 통해 문화 매체 영양소에 대 한 액세스를 제공 하면서 산소를 공기에 노출을 극대화 합니다. Hiv-1 복제를 평가 하는 우리의 시스템에 가장 즉각적인 방법은 immunoassay 또는 정량 시간이 지남에 explant 문화 매체에 발표 하는 바이러스의 양을 측정 하는 것입니다. 에이즈-1 감염 및 병 인 (예., CD4 T 세포 소모) cytometry 여 조직 explants 대량 RNA/DNA 추출 및 정량, 제자리에서 얼룩, 또는 조직 소화 시 단일 세포 분석 평가할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>젤폼 12-7 mm 흡수성 젤라틴 스폰지&nbsp;</td><td>Pfizer</td><td>NDC:&nbsp; 0009-0315-08</td><td>Gelfoam과 Spongostan은 편도선과 경추 조직 모두에 대한 조직 치료에서 동등하게 우수한 성능을 발휘합니다.</td></tr><tr><td>SPONGOSTAN Standard 70 &times; 50 &times; 10 mm 흡수성 지혈 젤라틴 스폰지</td><td>Ferrosan Medical Devices</td><td>MS0002</td><td>Gelfoam과 Spongostan은 편도선 및 경추 조직 모두에 대한 조직검사에서 동등하게 잘 수행됩니다.</td></tr><tr><td>페놀 레드 및 글루타민이 함유된 RPMI 1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21875034</td><td>MEM 비필수 아미노산, 피루브산 나트륨, 겐타마이신, 암포테리신 B 및 FBS 15%(v/v)를 RPMI1640 첨가하여 배양 배지(CM)를 만듭니다.</td></tr><tr><td>Modified Eagle's medium(MEM) 비필수 아미노산(100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140035</td><td>MEM 비필수 아미노산, 피루브산 나트륨, 겐타마이신, 암포테리신 B 및 FBS 15%(v/v)를 RPMI1640 첨가하여 배양 배지(CM)를 만듭니다.</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨, 100mM (100x)&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td>MEM 비필수 아미노산, 피루브산 나트륨, 겐타마이신, 암포테리신 B 및 FBS 15%(v/v)를 RPMI1640 첨가하여 배양 배지(CM)를 만듭니다.</td></tr><tr><td>겐타마이신 50 mg/mL (1000배)&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750037</td><td>MEM 비필수 아미노산, 피루브산 나트륨, 겐타마이신, 암포테리신 B 및 FBS 15%(v/v)를 RPMI1640 첨가하여 배양 배지(CM)를 만듭니다.</td></tr><tr><td>암포테리신 B 250 &mu; g/mL (100배)&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15290018</td><td>MEM 비필수 아미노산, 피루브산 나트륨, 겐타마이신, 암포테리신 B 및 FBS 15%(v/v)를 RPMI1640 첨가하여 배양 배지(CM)를 만듭니다.</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI1640 MEM 비필수 아미노산, 피루브산 나트륨, 겐타마이신, 암포테리신 B 및 FBS 15%(v/v)를 첨가하여 배양 배지(CM)를 만듭니다.</td></tr><tr><td>티카르실린 디소듐 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>T5639-1G</td><td>를 멸균 세포 배양 등급의 물, 티르카실린 디소듐(3g) 및 클라불란산칼륨(100mg)에 재현탁하고 혼합하여 100mL의 항생제 용액(100x)을 얻습니다. 분주하고 -20 &deg;C에서 보관하십시오. 반복적인 냉동 및 해동을 피하십시오. CM에 항생제를 보충하여 CMT를 만듭니다.</td></tr><tr><td>칼륨 clavulanate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33454-100MG</td><td>멸균 세포 배양 등급 물 티르카실린 디소듐(3g) 및 칼륨 클라불라네이트(100mg)에 재현탁하고 혼합하여 100mL의 항생제 용액(100x)을 얻습니다. 분주하고 -20 &deg;C에서 보관하십시오. 반복적인 냉동 및 해동을 피하십시오. CM에 항생제를 보충하여 CMT를 만듭니다.</td></tr><tr><td>멸균 인산염 완충액 식염수(PBS) pH 7.4, 칼슘, 마그네슘 및 페놀이 없음</td><td></td><td></td><td>수술 표본의 보관 및 운송에 사용합니다. PBS는 생리학적 pH를 가진 다른 등장성 용액으로 대체할 수 있습니다. 배양 배지는 하룻밤 보관에 가장 적합합니다.</td></tr><tr><td>멸균 세포 배양 등급 물</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 운송 용기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 % 에탄올 용액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>생물학적 폐기물 처리</td><td></td><td></td><td></td>용 소독제 용액</tr><tr><td>멸균 금속 집게 또는 핀셋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 금속 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 평면 계량 금속 주걱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 메스 및 블레이드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-웰 세포 배양 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12-웰 세포 배양 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 페트리 접시, 100 mm &times; 20 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>무세포 HIV-1 바이러스 준비 HIV-1BaL</td><td>NIH AIDS 시약 프로그램</td><td>510</td><td>바이러스는 여러 실험을 수행할 수 있을 만큼 충분히 큰 스톡을 생성하도록 전파되어야 한다. 바이러스 현탁액 및 -80°C에서 보관하십시오. 반복적인 냉동 및 해동을 피하십시오.</td></tr><tr><td>무세포 HIV-1 바이러스 제제 HIV-1LAI.04</td><td>NIH AIDS 시약 프로그램</td><td>2522</td><td>바이러스는 여러 실험을 수행할 수 있을 만큼 충분히 큰 스톡을 생성하도록 증식되어야 합니다. 바이러스 현탁액 및 -80°C에서 보관하십시오. 반복적인 냉동 및 해동을 피하십시오.</td></tr><tr><td>Lamivudine (3TC)</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>8146</td><td>DMSO에서 10mg/mL로 재현탁, 분취 및 -20°C에서 보관. 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오.</td></tr><tr><td>생물 안전 작업대</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>워터 재킷 CO2 인큐베이터, 37°로 설정; C, 5% CO2, &ge; 습도</td><td></td><td></td><td></td>90%</tr><tr><td>수조는 37°C로 설정되었습니다. C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 1.5 및 2mL 스크류 캡 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브용 가열 블록이 있는 건식 수조 쉐이커, 37°C로 설정; C, 300 분당 회전수</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

전 비보 인간 면역 결핍 바이러스 1와 histoculture 인간 림프 조직 및 여성 생식 기 점 막의 감염

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Histocultures 허용 인간의 조직 내에서 세포 상호 작용을 공부 하 고 그들은 통제 된 실험실 조건에서 모델 호스트 병원 체 상호 작용을 채택 될 수 있다. 인간의 조직 중 다른 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 감염 ex vivo 효능 및 항 바이러스 약물의 독성을 테스트 플랫폼으로 초기 질병 병 인, 조사를 성공적으로 사용 되었습니다. 현재 프로토콜에서 우리가 처리와 에이즈-1 조직 explants 인간의 편도 및 자 궁 경부 거칠어, 감염 약 2 주 동안 액체 공기 인터페이스에 젤라틴 스폰지 위에 문화에서 그들을 유지 하는 방법을 설명 합니다. 이 아닌-편광 culture 설정 조직의 무결성과 기능적 아키텍처의 진보적인 손실의 주요 제한 남아 있지만 문화 매체에 산소, 영양소에 대 한 액세스를 극대화 합니다. 이 메서드는 hiv-1 복제 및 병 인 immunoassays, cytometry, 정량, 등 여러 가지 기술을 사용 하 여 모니터링을 수 있습니다. 중요성, 생리 변화 같은 표본의 다른 지역에서 explants 사이 에서도 조직 기증자, 사이의 실험 결과 영향을 크게 수 있습니다. 결과 재현성을 보장 하기 위해, 그것은 중요 explants, 기술 복제, 조건과 일치 하는 기증자 컨트롤의 적절 한 번호를 사용 하 여 여러 실험에서 데이터를 컴파일할 때 실험적 치료의 결과 정규화 (즉, ., 다른 기증자에서 직물을 사용 하 여 실시) 통계 분석을 위해.

조직 explants에서 hiv-1 복제를 평가 하기 위해 몇 가지 기법을 사용할 수 있습니다. 우리의 표준 읽어 에이즈-1 p24개 그 immunoassay18시간이 지남에 cm에서 발표의 양을 측정 하는 것입니다.
같은 HIV-1 재고의 동일한 inoculum 감염 다른 기증자 로부터 조직 explants는 다른 양의 바이러스 (표 1)를 얻을 수 있습니다. 이것은 수와 에이즈-1 대상 셀의 상태와 공동 감염 조직16,19에서 병원 균의 존재 등 여러 가지 요인 때문 이다. 그림 1에서 제공 하는 자 궁 경부 점...

인간의 조직 비보 전 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 감염 바이러스 병의 귀중 한 3D 모델을 제공합니다. 여기, 우리는 프로토콜 처리 및 조직 표본에서 인간의 편도 에이즈-1 여성 생식 기 거칠어 감염과 액체 공기 인터페이스에 문화에서 그들을 유지 하는 것을 설명 합니다.

전 비보 인간 면역 결핍 바이러스 1와 Histoculture 인간 림프 조직 및 여성 생식 기 점 막의 감염

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

이 방법은 HIV 분야에서 가장 영향을 받는 기관 중 2개 내에서 바이러스 전달 및 병인의 결정요인 식별과 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있다. 사실, 주요 고급 운전 질병 진행은 조직에서 일어난다. 감염의 특징 그리고 복잡성은 순환에 있는 세포에 의해 제대로 반영되거나 격리되고 시험관에서 감염됩니다.HIV 병인을 연구하는 전 생체 조직 배양의 주요 장점은 2 ~ 3 주 동안 세포 사이의 원래 의 간격 및 기능적 관계를 유지한다는 것입니다. 우선, CMT의 20~30밀리리터로 100밀리미터 페트리 접시를 채우고, 젤라틴 스폰지를 멸균 포셉을 사용하여 페트리 접시에 옮긴다.양쪽에 스폰지를 적시고 스폰지가 1 분 동안 매체를 흡수 할 수 있습니다. 멸균 주걱을 사용하여 약 2 분 동안 페트리 접시의 바닥에 스폰지를 누릅니다. 멸균 가위를 사용하여 수화 된 젤라틴 스폰지를 약 1 평방 센티미터의 동일한 크기로 자른다.그런 다음 집게를 사용하여 하나의 스폰지 조각을 배양 판의 각 우물에 옮겨 넣습니다. 편도선에 대한 6 웰 플레이트의 각 웰에 CMT의 3 ~ 4 밀리리터를 추가하고 자궁 경부를위한 12 웰 접시에 잘 당 1 밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 인큐베이터에 놓고, 37°C, 5%CO2로 설정되며, 조직 이축이 스폰지에 적재될 때까지 습도가 90%보다 크거나 같습니다.수송 용기에서 편도선을 멸균 포셉을 사용하여 CMT 10~20밀리리터를 함유한 100mm 페트리 접시로 옮킨다. 페트리 접시의 뚜껑을 절단 표면으로 사용하여 조직을 해부합니다. 집게로 조직을 부드럽게 잡고, 멸균 메스와 블레이드를 사용하여 각 편도선을 다른 큰 조각으로 자릅니다.집게와 메스를 사용하여 소작, 피 묻은 및 자궁 근종 조직뿐만 아니라 편도선 또는 녹색 갈색 을 포함하는 부품을 제거하십시오. 각 티슈 조각을 두께가 약 2밀리미터 의 조각으로 자른다. 이전 단계에서와 같이 원치 않는 부품을 제거합니다.그런 다음 티슈 슬라이스를 2mm 두께의 스트립으로 자른다. 마지막으로, 2 밀리미터 두께의 블록으로 조직 스트립을 잘라. 해부를 진행하는 동안 조직 건조를 피하기 위해 CMT의 10 ~ 20 밀리리터를 포함하는 새로운 100 밀리미터 페트리 접시로 이양을 옮김.해부의 끝에서, 박을 배스하여 배분 분포를 임의로 한다. 집게를 사용하여 6웰 플레이트에 각 젤라틴 스폰지 위에 9개의 티슈 를 놓고 그 사이의 공간을 허용합니다. 플

ex-vivo-infection-human-lymphoid-tissue-female-genital-mucosa-with

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

<em&gt; 체외에서</em공부하기&gt; 공동 감염 모델<em&gt; Plasmodium falciparum</em인간의 기본 단핵구 파생 면역 세포에서&gt; - HIV-1 상호 작용

이 비디오는 인간 면역결핍 바이러스 1형, HIV-1에 의한 인간 자궁 점막 조직의 생체 외 감염 및 공기-액체 계면에서 젤라틴 스펀지 위에 대한 유지 관리를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 인간 조직 내에서 HIV-1 복제 및 발병 기전을 모니터링할 수 있습니다.

생체 외 조건에서 HIV 발병기전을 연구하기 위한 인간 자궁경부 점막 감염 모델

무 세포 HIV-1 입자와는 달리, 감염된 CD4 + T 세포를 형질 효과적으로 수지상 세포 (PDCS)에 의해 감지된다. 이 원고는 타입 I IFN의 방출에 의해 평가로서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 격리 PDCS는 PDCS 의해 선천성 센싱을 평가하는 HIV-1 감염 T 세포와 공동 배양 방법을 설명한다.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

자궁경부에서 림프구와 단핵구를 채취하기 위해 사이토브러시 샘플링을 사용하는 것은 여성 생식기 면역 분석을 위한 샘플을 제공하는 최소 침습 기술입니다. 이 프로토콜에서는 유세포 분석 분석을 위한 cytobrush 샘플 수집 및 면역 세포 분리에 대해 설명합니다.

컬렉션, 격리, 인간 자궁 경부 샘플의 유세포 분석

피부는 인간 병원체인 단순 헤르페스 바이러스 1형(HSV-1)의 표적 조직 중 하나입니다. HSV-1의 조직 침입 경로를 조사하기 위해 피부의 가장 바깥쪽 층을 나타내는 쥐 표피 시트의 생체 외 감염 모델을 구축했습니다.

단순 포진 바이러스 1 형과 쥐 표피의 생체 감염

여기에서는 상피내 감마 델타 T 세포의 분석을 위해 인간 상경부 내 림프구를 얻기 위한 분리 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 자성 비드 또는 세포 분류에 의해 자궁경부 감마 델타 T 세포의 정제를 위해 확장될 수 있습니다.

인간의 자궁 경부 감마 델타 T 세포의 분리 및 유세포 분석

이 프로토콜 신생아 NSG 쥐 방사선 조절로 인간 조 혈 줄기 세포의 intrahepatic 주입을 통해 humanized 쥐 (hu-NSG)를 설정 하는 방법을 제공 합니다. Hu NSG 마우스 HIV 감염 및 조합 항 레트로 바이러스 치료 (장바구니)에 취약 하 고 HIV 복제 및 대기 시간 조사에 대 한 적합 한 병 태 생리 모델 역할.

HIV 복제 및 대기 연구를 위한 인간 답게 끄 덕/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) 마우스 모델

여기에 제시된 것은 HIV에 감염된 개인과 건강한 대조군으로부터 인간의 1차 단핵구를 분리, 배양, 트랜스펙팅 및 분화하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

여기에 기술된 것은 인간화된 마우스에 있는 HIV 감염의 역학을 공부하기 위한 3개의 실험적인 접근입니다. 첫 번째는 만성 감염 사건의 연구를 허용하는 반면, 두 후자는 1 차감염 또는 바이러스 재활성화 후 급성 사건의 연구를 허용합니다.

인간화 면역 결핍 마우스 모델에서 만성, 급성 및 재활성화 HIV 감염

우리는 줄기 세포 이식, 질 내 인간 면역 결핍 바이러스 노출 및 액적 디지털 PCR RNA를 기반으로 인간화 및 인간 면역 결핍 바이러스 감염 NOG 마우스 모델의 생성 및 평가를위한 프로토콜을 개발했습니다. 정량화.

질 내 HIV 노출 및 HIV 감염 치료를 위한 인간화된 NOG 마우스

학습하세요 인간 편도선 및 여성 생식기 점막을 이용한 HIV-1 ex vivo 감염 방법을 통해 바이러스 병원성과 전파 메커니즘을 연구하는 기법입니다. 이 모델은 조직의 원래 세포 구조를 2-3주간 유지하여 보다 정확한 감염 동태 분석이 가능합니다.

전 비보 인간 면역 결핍 바이러스 1와 Histoculture 인간 림프 조직 및 여성 생식 기 점 막의 감염

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