Name: Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 학습하세요 형광 추적기를 이용한 마우스 뇌 혈관 투과성 분석 방법으로 혈액-뇌 장벽 기능을 정량적으로 평가할 수 있습니다. 이 기술은 뇌졸중 및 알츠하이머병 연구에 활용됩니다.

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저자는 Sphingonet 컨소시엄이이 작업을 지원 하기 위한 Leduq 기초에 의해 투자를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품 또한 "혈관 차별화 및 리 모델링" 공동 연구 센터에 의해 지원 되었다 (CRC / Transregio23, 프로젝트 C1)와 7. FP, COFUND, 괴테 국제 Postdoc 프로그램 이동-IN, No. 291776 자금. 우리 더 처리 및 유전형 캐슬 린 서머를 한 쥐와 그녀의 기술 지원에 대 한 인정합니다.

모든 동물은 절차 동안 통증이 나 불편을 최소화 하는 최대 관심을가지고 처리 합니다. 이 절차 우리 기관의 동물 보호 지침을 다음과 같이 하 고 지역 위원회 (Regierungspraesidium 다름슈타트, 승인 번호 FK/1044)에 의해 승인 되었습니다.
침투성 시험 쥐에서 vivo에서 에 대 한 작업 단계의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 각 단계의 자세한 내용은 아래 설명 되어 있습니다.
1입니다. 동물 처리
<ol><li>
준비 및 추적기 및 마 취약의 관리
	<ol>
<li>침투성 시험 전날 이상 포함 하는 조직에 대 한 레이블된 튜브와 금형을 준비 합니다. 깨끗 한 증기 두건에서 작업 하 고 80% 에탄올으로 청소 하는 도구를 사용 하 여 프로토콜을 통해 무 균 상태를 유지 합니다. 현재 프로토콜에 대 한 3-6 개월의 성숙한 성인 연령 집단에 있는 남성 또는 여성 야생-타입 (WT) 또는 angiopoietin-2 (중앙-2) 함수 이득 (GOF) CD1 마우스를 사용 합니다. 앞에서 설명한 10쥐의 유전형을 수행 합니다. 참고: 80% 알코올 살 균 계기 초래 하지 것입니다 있지만 준비 샘플의 오염을 최소화 됩니다.</li>
		<li>2mm 주식으로 메 마른 PBS에 모든 추적기를 희석 하 고-20 ° c.에 빛에서 보호 하는 aliquots를 저장</li>
		<li>(Tetramethyl Rhodamine) TMR 같은 추적기를 선택 하 고 (fluorescein isothiocyanate) 고유 여기/방출 스펙트럼과는 FITC는 리 형광 현미경 검사 법에 의해 모두 염료 간의 최소한의 간섭 결과로 고칠 수 (는 TMR을 사용 하 여 또는 FITC 각각 필터)와 fluorometry 침투성 분석 결과 대 한 플레이트 리더에 의해. 참고: TMR dextran 3 kD FITC dextran 3 kD는 연구에 사용 된 두 리 고칠 수 및 따라서 사용 될 수 있는 또한 알데하이드와 immunohistochemical 분석 후 고정 지역 차이 조사 하기 위하여.</li>
		<li>최대한 주의 기관 관리 지침에 따라 모든 동물을 처리 합니다. 추가 추적 프로그램 1:1 믹스10,13의 각 추적기의 100 µ L를 사용 하 여 결합 될 때 200 µ L까지 증가 될 수 있다 100 µ L 추적 솔루션으로 intraperitoneally 각 마우스를 주사. 혼자 autofluorescence 배경 빼기에 대 한 가짜 제어 역할을 추적기 대신 PBS를 가진 하나 이상의 동물을 주입.</li>
		<li>추적 프로그램 삽입 후 5 분 anesthetize i.p 주사 마 취 제 및 Xylazine를 가진 동물 (100 mg과 5-10 밀리 그램 0.9%에서 염 분 당 킬로그램 몸 무게 각각, 150 µ L 당 25 g 마우스 칵테일의). 참고: 수 의사 연 고는 적용 되지 눈에 절차 동안 동물 마 취과 관류/희생 사이 기간 이었다 짧은 (10 분) 관찰 되지 있던 모든 눈의 건조.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
혈액 수집 및 심장 관류
	<ol>
<li>동물 마 취 관리 후 심장 관류 10 분에 대 한 준비. 동물 마 취의 수술 평면에 도달 했습니다 수 있도록 발 트 위치 응답의 부재를 확인 합니다.</li>
		<li>그들의 뒤에는 동물을 80% 에탄올 복 부의 피부에 적용. 바로 흉 곽 아래에 작은 절 개 (2 cm)와 복 벽을 열어 작은 위를 사용 하 여. 횡 경 막에서 간 고 천천히 횡 격 막 흉 막 캐비티 15노출 극복 합니다.</li>
		<li>양측 흉 곽을 잘라 고 왼쪽된 심 실 노출 하려면 컷된 흉 골을 해결. 좌 심 실의 뒷부분에 연동 관류 시스템에 연결 된 21-게이지 나비 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>오른쪽 아 트리 움 펑크와 신속 하 게 (10 s) 혈 청 컬렉션 튜브에 혈액 1 mL 피 펫 팁 (최종 마감)를 사용 하 여 흉 강에 발표의 200-300 µ L를 수집 하 고 얼음에 저장. 참고:이 관류 절차는 비 생존.</li>
		<li>즉시 혈액 수집 관류 시스템 (10-12 rpm, 5 mL/min)에 전환 하 고 따뜻한 (RT) 1 x PBS로 3 분에 대 한 동물을 perfuse (Ca의 무료2 +Mg2 + 이온). 참고: PBS 포함 캘리포니아2 +/Mg2 + 이온 활용할 수 있습니다 더 나은 심장 활동에는 관류 동안. PBS 관류에 대 한 사용의 총 금액은 15 ~ 20 mL의 범위입니다.</li>
		<li>간, 색상을 지적 함으로써 관류 품질 평가 신장 관류 후 화이트/창백을 표시. 참고: 신장 또는 간 관류 반드시 나타내지 않습니다 뇌 관류로 동맥 (경 동맥/척추) 도달 뇌 대동맥에서 특히 심 방 찔린 중 3 단계에서 준비 하는 동안 파열 얻을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 조직 처리
<ol><li>장기 수집 및 저장
	<ol>
<li>관류의 끝에, 자 궁 경부 전위 및 수확 뇌와 신장에 의해 동물의 죽음을 확인 합니다. 관류 품질은 좋은 동물 침투성 분석에서 제외 되므로 뇌 관류 (meninges의 혈관에서 보이는 혈액), 머리의 색깔에 의해 확인 합니다. 메스 (그림 1)를 사용 하 여 2 hemibrains로 두뇌를 구분 합니다.</li>
		<li>후 엽과 소 뇌의 무료 메스 한 hemibrain와 dissect 그리고 2 mL 튜브에는 hemicerebrum를 전송. 소 뇌 침투성 평가에 필요한 경우 추가 튜브에 헤 미-소 뇌를 저장 합니다.</li>
		<li>다른 2 mL 튜브에 단일 신장 전송. 드라이 아이스에 샘플을 즉시 저장 합니다.</li>
		<li>기본적으로 나머지 신장과 hemi-뇌 (소 뇌와 후 엽으로 구성 된)에 포함 조직-테크 최적의 절삭 온도 (O.C.T) 드라이 아이스에 화합물.</li>
		<li>결국, 원심 10, 000g, 4 ° c.에서 10 분에 혈 청 컬렉션 튜브에 얼음에 저장 된 혈액 샘플 1.5 mL 튜브에 혈 청 supernatants 전송 및 드라이 아이스 컨테이너에 넣어.</li>
		<li>추가 처리까지-80 ° C 냉장고를 드라이 아이스에 수집 된 모든 샘플을 전송 합니다. 참고: 그것은 녹고 동결로 후 균질 효율성 증가로 균질 단계를 진행 하기 전에 샘플을 동결 하는 것이 중요입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>균질 및 원심 분리
	<ol>
<li>Hemi-뇌와 신장 샘플 다운-80 ° C에서 냉동 얼음에 thaw와 장기를 포함 하는 튜브를 무게. 이러한 무게에서 조직 무게를 여러 빈 관 (약 20)의 평균 값을 뺍니다. 추가 300 µ L 및 감기 1의 200 µ L 신장과 hemi-뇌, 각각 포함 된 튜브에 X PBS. 참고: (헤 미-소 뇌, 100 mg 아래) 같은 조직의 낮은 금액에 대 한 개별 튜브의 무게는 것이 좋습니다.</li>
		<li>소계 (PTFE) 유 봉 약 15 스트로크를 수행 하 여 전기 오버 헤드 교 반기 (1, 000 rpm)에 연결 된과 원래 eppendorf 관에서 각 샘플을 균질 (1 스트로크 = 1 및 1 다운). 샘플 사이 PBS 가진 유 봉 헹 구 고 닦아 다음 예제를 진행 하기 전에 건조. 참고: 균질 동안 세제의 사용 했다 fluorometry 잠재적인 간섭으로 인해 피할 수 있습니다. 그러나,이 프로토콜에 세포내 추적 감지 또한 조직을 철저 하 게 균질 한 라운드의 동결 해 동 후는 더 효율적으로.</li>
		<li>빛과 15000 g, 20 분, 탁상 원심 분리기에 4 ° C의 끝에 모두 함께 원심 분리기에서 보호 하는 얼음에 무 균된 샘플을 저장 합니다. 즉각적인 fluorometry 또는 나중에 분석할 수-80 ° C에서 얼음에 새로운 1.5 mL 튜브 supernatants 전송.</li>
	</ol></li>
	<li>형광 측정 및 정량화
	<ol>
<li>이전 단계의 끝에 동결 조직 상쾌한 및 혈 청 샘플은 호 일 빛에서 그들을 보호 하는-80 ˚C에 저장 된 얼음에 녹여.</li>
		<li>384 잘 검정 잉크 판으로 희석된 혈 청 (30 µ L 1 x PBS + 20 µ L 세럼) 또는 (있는 그대로) 조직 supernatants의 50 µ L 플라스틱. 이 조직 homogenate 배경 일반적으로 희석제로 사용 하는 PBS의 이상으로 혈 청 및 조직의 supernatants 적절 한 배경 빼기를 보장 하기 위한 가짜 동물에서 적어도 하나의 샘플을 포함 합니다. 참고: 3 가짜 동물의 평균 비록 가짜 autofluorescence 값 (데이터 표시 되지 않음)에 아주 작은 변화 관찰 되었다 autofluorescence에 대 한 사용할 수 있습니다. PBS, 또한 뇌 샘플 같은 낮은 형광 샘플에 대 한 신호 대 잡음 비 증가 수와 그것을 diluting 하 여 혈 청 사용의 금액을 줄일 수 있습니다. 최대 10 µ L 세럼 40 µ L PBS와 그것을 diluting 테스트를 했다. 아니 거품 우물에 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>384 잘 블랙 플레이트 플레이트 판독기에 삽입 하 고 형광 측정을 선택 하는 새로운 스크립트를 엽니다.</li>
		<li>최적 이득을 설정 하 고 각각 TMR 또는 FITC dyee에 대 한 550/580 또는 490/520 여기/방출 (nm) 값을 사용 하 고 원시 형광 단위 (RFUs)를 측정 시작.</li>
		<li>플레이트 리더에서 원시 형광 단위 (RFUs)를 사용 하 여 해당 하는 가짜 값을 뺀 후 침투성 색인 (PI) 계산.<ol>
<li>
* 침투성 인덱스 (mL/g) = (조직 RFUs/g 조직 중량) / (혈 청 RFUs/mL 혈 청)
</li>
		</ol>
</li>
		<li>예제 계산 뇌 침투성 색인 (PI)에 대 한 동물 GOF1의 (표 1).<ol>
<li>GOF1 RFUs-가짜 뇌 RFUs 뇌 = 154-22.5 131.5 =</li>
			<li>GOF1 혈 청 RFUs-가짜 혈 청 RFUs 38305-27 = = 38278</li>
			<li>뇌의 무게 (g) = 0.195</li>
			<li>혈 청 볼륨 (ml) = 0.02</li>
			<li>뇌의 침투성 인덱스 (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352 참고: 침투성 인덱스 계산 항복 값을 절대 및 실험 및 조직 유형 사이 비교. 그러나 이들은 2 그룹 12사이 비교의 용이성에 대 한 비율으로 제시 될 수 있습니다. 이 두 그룹에 각 동물의 PI 1 아직 유지 간 동물 변형 제어 그룹에서 통해 컨트롤 그룹 평균 운전 제어 그룹의 평균 PI와 함께 나누어 얻을 수 있습니다. 이 변화는 1로 설정 하는 컨트롤 그룹을 기준으로 실험 그룹 (또는 그룹)에 대 한 값을 제공 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>추적의 면역 형광 시각화
	<ol>
<li>10 µ m는 cryostat에 섹션-20 ° C로 설정 하 고 실내 온도 슬라이드 섹션을 전송으로 조직-테크 화합물 (O.C.T) (2.1 단계)에 기본적으로 포함 된 신장/hemi-두뇌 블록을 잘라. 섹션은 일단 말리 면 (약 30 분), 전송 슬라이드-80 ° C 냉동 고 사용까지.</li>
		<li>얼룩이 지기의 날, 10 분 동안 37 ° C에서 슬라이드를 해 동 하 고 PBS에서 빠른 세척 뒤 실 온에서 10 분 동안 4 %paraformaladehyde (PFA)와 섹션을 수정.</li>
		<li>Permeabilization/차단 버퍼 1 %BSA 및 0.5% 트라이 톤 X-100 pH 7.5 실 온에서 1 h 포함 된 살 균 PBS의에서 섹션을 품 어.</li>
		<li>CD31 1 차 항 체로 상 온에서 1.5 h에 대 한 슬라이드를 품 어 (0.5 mg/ml, 멕 13.3 복제), 트라이 톤 X-100 (pH 7.2) PBS에 3 5 분 세척 뒤 살 균 PBS, 0.5% BSA 0.25%를 포함 하는 버퍼에 1: 100에 희석.</li>
		<li>수행 이차 항 체 외피 종의 함께 실 온에서 1 h 대 위의 버퍼 붙일 항 체 희석된 1: 500 (2 mg/mL)를 표시 합니다. CD31에 대 한 염소 반대로 쥐 알 렉 사 568 또는 알 렉 사 488 1: 500의 희석에 사용할 수 있습니다. DAPI를 포함 (300 μ M) 이차 항 체는 핵에 대 한 얼룩 (1:1, 000 희석 주식에서) 혼합.</li>
		<li>아쿠아 polymount와 스테인드 섹션을 탑재 하 고 어둠 속에서 실 온에서 중 합에 대 한 그것을 떠나 하룻밤.</li>
		<li>스펙트럼 영상 confocal 레이저 스캐닝 현미경 시스템을 사용 하 여 이미지를 취득 합니다. NIS 요소 소프트웨어 (버전 4.3)에 의해 이미지를 분석 합니다. 몽타주 그림의 생성을 위해 포토샵과 같은 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

혈액-뇌 장벽 부전 기본 및 보조 뇌종양 이나 뇌졸중 등 신경 성 질환의 숫자와 연결 됩니다. BBB 붕괴는 종종 CNS 부 종 생명이 연결 됩니다. 트리거 오프닝 분자 메커니즘의 해명 또는 BBB의 폐쇄는 그러므로 신경 장애 그리고 일반적으로 치료 의미의 조사 연구자에 의해 있다. 그러나, 조사 하는 방법을 문학에서 보고 된 BBB 침투성에서 vivo에서 수시로 연관 된다 형광 이미지17,18 의 지루하고 주관적인 정량화에 의존 하는 기술적인 어려움 , 19. 또한, 방법의 일부 포함 뇌 형광 이미징으로 더 단단한 방 벽을 형성 하지 않는다 표면 뇌 혈관의 침투성을 나타내는 그릇입니다. 동물은 종종 중요 한 피 분수 인해 잘못 된 해석으로 이어지는 끼얹는다는 객관적인 뇌 조직 흡 광도 (예: 에반스 블루 침투성 평가)에 따라도 때 정량화 수행 되...

Microvascular 내 피 세포 (ECs)는 ensheathed 기저 lamina에, 밀접 하 게 관련 된 pericytes (Pc), 및 지하실 막의 끝 발1 봉투 이다 (ACs)에서 지 원하는 이루어져 혈액-뇌 장벽 (BBB) ,2. 여러 셀 형식을 지원 하 고 규제 장벽 기능을 주로 ACs 및 Pc, 상호 작용 하는 ECs 그리고 또한 신경 및 microglia, 모두는 함께 형성 neurovascular 단위 (NVU). NVU는 BBB는 혈액을 매개로 독 소 및 두뇌에 들어가기에서 병원 체의 전송 제한 기능에 대 한 중요 합니다. 이 함수는 ECs 사이 p-당단백질 (P-gp) 그 경과 분자 endothelium 입력으로 다시 같은 전송기의 작용으로 인해 claudin-5, occludin, zonula occludens-1, 꽉-접합 분자의 결과 선박 루멘1,2,3. 그러나 BBB는 영양분 (포도 당, 철, 아미노산) 등 필수 분자의 수송에 대 한 특정 전송기 EC 플라즈마 막1,,23에 의해 수 있습니다. EC 레이어 luminal (혈액 연결)와 abluminal (뇌 연결 막) 대 한 구체적이 고 vectorial 전송 기능4,5 수 있도록 다양 한 전송기의 분포에 관하여 매우 편광은 . BBB 단단히 CNS 환경 규제에 대해 보호 하는 동안, CNS 약물 전달 기능 BBB와 파 킨 슨 등 질환에 대 한 주요 도전 이다. BBB 장애와 신경 질환에도 장벽 부전 손상 Alzheimer의 질병 (광고)에서 예를 들어 특정 전송 대상에 포함 될 수 있습니다 때문에 특히 두뇌 약물 전달 증가 추측 될 수 없다. 광고에서 LRP1, 분노, P-gp 등 여러 가지 아 밀 로이드 베타 전송기 dysregulated 것으로 알려져 있습니다 하 고 쓸데6,,78수 있습니다 따라서 이러한 전송기를 대상으로 합니다. BBB는 획, 광고, 수 막 염, 다 발성 경화 증 및 뇌 종양9,,1011등 여러 신경 질환에 손상 이다. 장벽 기능 복원 치료 전략의 중요 한 부분 이며 따라서 그 평가 중요 한.
이 작품에서는, 우리는 설명 된 객관적이 고 침투성 분석 결과 우리가 성공적으로 적용할 여러 마우스 라인 모두 실험과 유전자 변형 질환 모델10,12,13 설치류에 대 한 양적 프로토콜 ,14. 방법은 혈관 칸막이 추적기를 제거 뒤에 쥐의 관류 형광 추적기의 간단한 복 주사를 기반으로 합니다. 뇌 및 기타 장기 수집된 게시물 관류 및 침투성 객관적인 평가 절대 침투성 인덱스 플레이트 리더에서 조직 homogenates의 형광 측정에 따라 있습니다. 모든 원시 형광 값 조직 homogenates 또는 어떤 추적 프로그램에는 영향을 받지 않는 가짜 동물에서 혈 청을 사용 하 여 배경색을 수정할 수 있습니다. 충분 한 정규화 세럼 볼륨, 혈 청 형광, 및 조직, 따라서 저조한 침투성 인덱스를 완전 하 고 실험 및 조직 유형 사이 비교의 무게에 대 한 포함 되어 있습니다. 그룹 사이 비교의 용이성, 절대 침투성 인덱스 값 수 쉽게 변형 될 비율을 우리12이전 수행 했다. 동시에, 저장 된 hemi-두뇌와 신장 수 활용할 수 추적 프로그램 시각화를 위한 형광 현미경 검사 법10. 고전적인 형광 현미경 검사 법 이기는 하지만 조직 단면도 및 반 정량 분석에 대 한 이미지의 주관적인 선택으로 인해 성가신 침투성에 지역 차이 얻기에 중요 한 될 수 있습니다. 자세한 단계는 프로토콜에서 제공 됩니다 그리고 적절 한 노트 추가 됩니다. 이 성공적으로 다른 작은 동물을 확장할 수 있는 쥐에서 vivo에서 침투성 시험을 수행 하기 위한 필요한 정보를 제공 합니다. 분석 결과 추적기의 많은 종류에 적용 될 수 있습니다 추적기와 독특한 형광 스펙트럼의 조합에 의해 침투성 평가 기반으로 책임과 크기에 대 한 허용.

<table><tbody><tr><td>테트라메틸 로다민(TMR) 덱스트란 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3308</td><td></td></tr><tr><td>플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 덱스트란 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3306</td><td></td></tr><tr><td>케타민(Ketavet)</td><td>조에티스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자일라진(Rompun)</td><td>바이엘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% 식염수</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek O.C.T 화합물</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>37% 포름알데히드 용액</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td>4% 용액 준비</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민, 분획 V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>rat anti CD31 항체, 클론 MEC 13.3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 랫 alexa 568</td><td>분자 프로브</td><td>A-11077</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 랫 alexa 488</td><td>분자 프로브</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>분자 프로브</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>아쿠아 폴리 마운트</td><td>Polyscience Inc</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>21 게이지 버터 플라이 바늘</td><td>BD</td><td>387455</td><td></td></tr><tr><td>세럼 수집 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>41.1500.005</td><td></td></tr><tr><td>2mL 에펜도르프 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.500</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech 정밀 와이프 티슈 와이퍼</td><td>Kimberley-Clark Professional</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>384웰 블랙 플레이트</td><td>Greiner</td><td>781086</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 superfrost plus</td><td>Thermoscientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 유봉</td><td>Wheaton</td><td>358029</td><td></td></tr><tr><td>전기 오버헤드 교반기</td><td>VWR</td><td>VWR VOS 14</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 550</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C1 분광 이미징 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 시스템</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>연동 관류 시스템</td><td>BVK Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr></tbody></table>

vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

혈액-뇌 장벽 (BBB) 두뇌 microenvironment 독 소 및 순환에 있는 병원 체에서 보호 하 고 두뇌 항상성 유지 하는 특수 방 벽 이다. 방 벽의 주요 사이트는 그 장벽 기능 꽉 세포 접합 및 원형질 막에 경과 전송기에서 결과 뇌 모세 혈관의 내 피 세포. 이 함수는 pericytes와 함께 혈관 단위 (NVU)를 형성 하는 이다 통제 된다. Alzheimer의 질병 (광고), 등 여러 신경 질환 뇌종양 장애인된 BBB 기능으로 연결 됩니다. BBB 침투성의 평가 중요 한 신경 질환의 심각도 및 고용 치료 전략의 성공에 따라서.
우리는 현재 여기 간단한 아직 강력한 침투성 분석 결과 여러 가지 마우스에 성공적으로 적용 된 둘 다, 유전과 실험 모델. 방법은 매우 양적이 고 일반적으로 적용 되는 현미경에 의해 추적 형광 분석에 비해 객관적입니다. 이 방법에서는, 마우스는 쥐 마비 뒤 수성 불활성 형광 추적기의 믹스와 함께 intraperitoneally 주입 수 있습니다. 동물의 심장 관류 뇌, 신장 또는 다른 장기 수확 전에 수행 됩니다. 장기 무 균 및 centrifuged는 상쾌한에서 형광 측정에 의해 따라. 혈액 관류의 바로 전에 심장 펑크에서 그려진 혈관 칸막이를 정규화 목적을 위해 제공 합니다. 조직 형광은 양적를 젖은 무게와 혈 청 형광으로 정규화 추적 침투성 색인. 추가 확인, contralateral hemi 두뇌 immunohistochemistry 보존 추적 형광 시각화 용도로 활용할 수 있습니다.

우리는 최근에 angiopoietin-2 (중앙-2) 함수 이득 (GOF) 마우스 건강 조건10제어 마우스 보다 더 높은 두뇌 혈관 침투성을가지고 나타났습니다. 뇌졸중 유발 쥐에서 그것은 또한 쇼 프 쥐 했다 더 큰 경색 크기와 제어 littermates 보다 큰 침투성. 이러한 결과 BBB에 침투성에 중앙 2의 중요 한 역할을 보여 줍니다. 따라서 프로토콜 GOF 마우스를 활용 하 고 비보에 침투성 분석 결과 설명 하기 위해 littermates를 제어 하는 그들을 비교. 그러나,이 방법은 어떤 질병 모델, 유전자 변형 마우스 모델에 적용 될 수 있다 또는 우리가 했던 이전 10,11,,1213...

여기 우리는 마우스 뇌 혈관 침투성 분석 결과 형광 추적기 관류 뇌혈관 장애의 동물 모델에 적용 되는 다음의 복 주사를 사용 하 여 현재. 한 반의 두뇌 양적 침투성을 평가 하 고 추적 프로그램 시각화/immunostaining에 대 한 다른 사용 됩니다. 절차 10 쥐에 대 한 5-6 시간 걸립니다.

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

이 절차의 전반적인 목표는 동물 모델에서 혈액 뇌 장벽 기능 장애를 평가하기 위해 형광 표지된 추적자를 사용하여 마우스의 뇌 혈관 구조의 투과성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 질병의 신경 혈관 투과성 및 치료 시 회복과 관련된 혈액 뇌 장벽 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 간단하고 정량적이라는 것입니다.이는 정량적 형광 측정법(fluometrictry)에 의한 투과성 평가와 지역 방어를 위한 형광 현미경 검사의 동시 평가 가능성을 제공합니다. 이 기술의 의미는 뇌종양, 뇌졸중 및 알츠하이머병을 포함한 여러 신경 장애의 진단 및 치료로 확장되는데, 이러한 질병은 생명을 위협하는 뇌부종 및 주요 치료 대상으로서의 BBD 기능 개선과 관련이 있기 때문입니다. 절차의 일부를 시연하는 것은 연구소의 과학 기술 책임자인 Miss Jadranka Macas가 될 것입니다.마우스에게 100마이크로리터의 2밀리몰 추적 용액을 복강내로 주입합니다. 염료 간의 간섭을 최소화하기 위해 뚜렷한 여기 방출 스펙트럼을 가진 FITC 및 TMR로 표지된 dextrans와 같은 라이신 고정성 추적자를 선택하십시오. 추적자를 결합하는 경우 200마이크로리터의 결합된 추적자 용액을 복강내에 주입합니다.자가형광 배경 제거를 위한 가짜 대조군 역할을 하는 차량 전용 주사를 포함합니다. 각 주사 후, 승인된 기관 프로토콜에 따라 마우스를 깊이 마취하기 전에 5분을 허용합니다. 마취제 투여 후 10분 후에 동물의 심장 관류를 준비합니다.발 경련 반응이 없는지 확인하여 마우스가 마취 수술 평면에 도달했는지 확인하십시오. 관류할 마우스를 등에 눕히고 복부 피부에 80% 에탄올을 바릅니다. 작은 가위를 사용하여 복벽에 2cm 절개를 만든 후 횡격막에서 간을 분리한 다음 횡격막을 천천히 잘라 복수의 구멍을 노출시킵니다.흉곽을 양측으로 자르고 절단된 흉골을 고정하여 좌심실을 노출시킵니다. 좌심실 후방의 연동 관류 시스템에 연결된 21게이지 나비 바늘을 삽입합니다. 오른쪽 심방에 구멍을 뚫은 다음 끝이 잘린 1ml 피펫 팁을 사용하여 방출된 혈액 200-300마이크로리터를 빠르게 채취하여 혈청 수집 튜브로 옮깁니다.수집된 혈액은 얼음 위에 보관하십시오. 혈액이 채취되는 즉시 관류 시스템을 켜고 실온의 칼슘 및 마그네슘 이온 프리 PBS로 동물을 3분 동안 관류합니다. 관류 후 창백하게 보이는 간과 신장의 색을 기록하여 관류 품질을 평가합니다.뇌를 적출한 후 수막의 혈관에 혈액이 보이지 않는지 확인합니다. 관류 품질이 좋지 않은 경우 샘플은 투과성 분석에서 제외되어야 합니다. 메스를 사용하여 뇌를 두 개의 반뇌로 분리하십시오.그런 다음 한쪽 반뇌에서 소뇌와 후각엽을 해부하고 대뇌를 2밀리리터 튜브로 옮깁니다. 적출한 신장 하나를 다른 2밀리리터 튜브에 넣습니다. 즉시 샘플을 드라이 아이스에 넣으십시오.소뇌와 후각엽이 손상되지 않은 상태로 남아있는 신장과 반뇌를 TissueTech 최적 절단 온도 화합물에 고유하게 삽입하고 드라이 아이스에 넣습니다. 마지막으로, 10, 000 G에 혈액 표본을 4 섭씨 온도에 10 분 동안 원심 분리한 후에, 혈청 상등액을 1.5 밀리리터 관으로 옮기고 드라이 아이스 콘테이너에서 두십시오. 동결-해동 후 균질화 효율이 증가하므로 샘플을 섭씨 영하 80도의 냉동고로 옮깁니다.반대뇌와 신장 샘플을 얼음 위에 올려 해동한 다음 장기가 들어 있는 튜브의 무게를 잰다. 이 가중치에서 약 20개의 빈 튜브의 평균값을 빼서 조직 무게를 구합니다. 신장이 들어 있는 튜브에 300마이크로리터의 차가운 PBS를 넣고 반대뇌가 들어 있는 튜브에 200마이크로리터를 추가합니다.약 15번의 스트로크를 사용하여 전기 오버헤드 교반기에 부착된 PTFE 유봉으로 원래 마이크로분리관의 각 샘플을 균질화합니다. 균질화된 샘플을 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오. 샘플 사이에 PBS로 유봉을 헹구고 다음 샘플로 진행하기 전에 건조시킵니다.모든 샘플이 균질화되면 섭씨 15, 000G 및 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 형광 측정 및 정량화를 진행하기 전에 상등액을 얼음 위의 새로운 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 상층액을 384웰 플레이트로 옮기고 플레이트를 형광 리더에 삽입합니다.트레이서에 올바른 여기 및 방출 파장이 포함되어 있는지 확인하고 게인을 최적으로 설정합니다. 측정을 시작하고 데이터를 스프레드시트로 내보내 프로토콜에 설명된 대로 계산을 수행합니다. 염색 당일, 슬라이드에 장착된 10미크론 저온 유지 장치 절편을 섭씨 37도에서 10분 동안 해동합니다.그런 다음 실온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 섹션을 고정한 다음 PBS에서 빠르게 세척합니다. 1%PSA와 0.5%Triton X-100을 함유한 멸균 PBS에서 실온에서 1시간 동안 배양하여 절편의 비특이적 결합을 투과하고 차단합니다. 차단 후 CD31 1차 항체를 1:100 희석하여 실온에서 1.5시간 동안 슬라이드를 배양합니다.PBS로 각각 5분씩 3회 세척한 후, 종 특이적 형광 표지 항체를 사용하여 실온에서 1시간 동안 2차 항체 배양을 수행합니다. Aqua-Poly/Mount로 염색된 부분을 장착하고 어두운 곳에서 실온에서 중합을 위해 밤새 그대로 둡니다. 마지막으로, 분광 이미징 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 시스템을 사용하여 이미지를 획득합니다.투과성 분석을 위한 추적자 순환 시간을 확립하기 위해 추적자 주입 후 15분의 짧은 순환 시간과 2시간의 긴 순환 시간을 비교합니다. 순환 시간이 2시간이라는 긴 시간은 15분의 짧은 순환 시간에 비해 신장에 추적자 축적의 양이 적은데, 이는 혈관 구획에서 녹색으로 표시된 높은 청소율 FITC 덱스트란으로 인한 것일 수 있습니다. 이 효과는 단단한 혈액 뇌 장벽으로 인해 뇌에서 훨씬 더 극적입니다.적색 채널에서 관찰된 CD31 염색은 검사한 시점과 뇌 모두에서 신장에 혈관이 있음을 확인했습니다. 이 기술을 완전히 익히면 2명의 과학자가 함께 작업하면서 10마리의 쥐에 대해 5-6시간 이내에 수행할 수 있습니다. 이 기술을 시도하는 동안 혈액-뇌 장벽 투과성에 관한 질문에 답하기 위해 올바른 분자량, 차트 및 형광 특성의 추적자를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 BBD에 대한 면역 조직화학과 같은 다른 방법 및 질병 요인 채우기와 같은 다른 방법을 수행하여 질병 부위의 중증도 및 국소화와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 플루오레세인나트륨 분자를 사용하여 체외 혈액-뇌 장벽의 투과성을 평가하기 위한 투과성 분석에 대해 설명합니다.

Blood-Brain Barrier 모방 투과성 분석: 추적자 분자에 대한 BBB 모방의 투과성을 평가하기 위한 체외 분석

이 비디오는 EAE 마우스 모델에서 혈액-뇌 장벽 파괴를 평가하는 절차를 보여줍니다. 다양한 크기의 형광 염료를 역궤도로 주입하여 뇌의 혈관을 순환합니다. 작은 염료는 틈을 통해 뇌 조직으로 누출되는 반면, 큰 염료는 장벽 손상 정도와 상관관계가 있는 파괴가 심한 경우에만 들어갑니다.

EAE 마우스 모델에서 형광 염료를 사용한 혈액-뇌 장벽 파괴 결정

본 연구의 목적은 쥐의 동계 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 포함하는 생체 BBB 모델의 재현성을 확인하는 것이 었습니다. 내피 세포 단일 층은 높은 봉사자 낮은 LY 투과성을 발표했다. 특정 TJ 단백질의 발현은 염증과 운송 및 수용체의 기능에 기능적인 응답은 평가했다.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

쥐의 뇌, 미세혈관 내피 세포 및 성상 세포의 공동 배양을 기반으로 혈액 뇌 장벽의 체외 모델을 확립하는 방법을 설명하고 검증합니다. 이 시스템은 형광 분자의 장벽 횡단 투과에 대한 나노 제형의 효과를 연구하는 유효한 도구임이 입증되었습니다.

쥐 뇌 혈관 벽의 맞은 편에 FITC로드 Ferritins의 생체 외 투과 년 : 모델 Nanoformulated 분자의 배달을 공부하기

이 연구에서 우리는 신경 퇴행 성 조건 하에서 혈액-뇌 장벽 장애를 평가 하기 위한 간단 하 고 효율적인 절차를 제시. 우리의 목표를 달성 하기 위해 우리는 높은 분자량 fluorescein isothiocyanate 표시 (FITC) 주입-마우스 경으로 알 부 민 정 맥 및 형광 현미경 검사 법에 의해 뇌 실질에 그것의 누설을 평가.

FITC 표시 된 알 부 민 신경 질환의 마우스 모델에서의 정 맥 주입에 의해 혈액-뇌 장벽 침투성의 평가

여기, 선물이 vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 혈관 단위의 장애를 조사 하는 프로토콜. 우리는 특별히 명과 limitans에서 혈액-뇌 장벽 침투성 및 백혈구 마이그레이션에 관련 된 gelatinase 활동을 확인 하는 방법 주소.

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

마약 중추 신 경계 종양을 대상으로 하는 것은 주요 도전 이다. 여기는 murine 및 인간의 세포를 사용 하 여 혈액 뇌종양 장벽의 생체 모방을 생산 하 고 중추 신 경계 종양 vivo에서 대상의 예측 가능성에 대 한 그들의 관련성을 토론 하는 프로토콜에 설명 합니다.

예측의 Vivo 페이로드 배달 접시에 혈액 종양-배리어를 사용 하 여

본 프로토콜에서, 턱밑샘(SMG)의 내피 장벽 기능은 이광자 레이저 스캐닝 현미경 하에 생체 내에서 시험 동물 모델의 각 정맥에 상이한 분자 가중 형광 추적자를 주입함으로써 평가되었다.

생체 내 마우스 턱밑샘의 혈관 투과성 검출

본 연구에서, 플루오레세인-이소티오시아네이트 표지(FITC) 덱스트란을 경구 위관영양을 통해 마우스에 투여하여 생체 내 및 혈장 및 대변 샘플 모두에서 장 투과성을 평가합니다. 장 장벽 기능은 많은 질병 과정에서 영향을 받기 때문에 이 직접적이고 정량적인 분석은 다양한 연구 분야에서 사용될 수 있습니다.

Fluorescein-Isothiocyanate-labeled dextran을 사용한 생쥐의 장 장벽 무결성 평가

서로 다른 시점의 마우스에 두 개의 형광 염료를 투여하여 혈액뇌장벽(BBB) 파괴로 인한 염료 유출을 시각화하는 방법이 개발되었습니다. 동결 보호제로서 글리세롤을 사용함으로써 동일한 샘플에 대한 면역조직화학이 촉진되었습니다.

경미한 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 혈액-뇌 장벽 파괴 평가

이 프로토콜은 Evan의 청색 염료 기반 평가를 사용하여 성인 제브라피쉬(Danio rerio) 모델에서 혈액뇌장벽(BBB) 무결성을 평가하는 신뢰할 수 있는 방법을 제시하여 신경혈관 파괴의 정성적 및 정량적 분석을 모두 가능하게 합니다.

게이트키퍼 시각화: 성인 제브라피쉬의 혈액-뇌 장벽 투과성에 대한 Evan의 파란색 염료 기반 평가

학습하세요 형광 추적기를 이용한 마우스 뇌 혈관 투과성 분석 방법으로 혈액-뇌 장벽 기능을 정량적으로 평가할 수 있습니다. 이 기술은 뇌졸중 및 알츠하이머병 연구에 활용됩니다.

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

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