방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

이 프로토콜의 전반적인 목표는 이미징을 통해 살아있는 설치류의 종양 성장 및 전이를 추적하는 것입니다. 방사성 핵종 형광 융합 리포터는 양전자 방출 단층 촬영을 통해 비침습적 in vivo 검출을 가능하게 하며, 형광체는 결과의 생체 외 확인을 돕습니다. 이 방법은 장기간에 걸쳐 살아있는 동물에서 세포를 추적해야 할 때마다 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이는 원격 전이에 대한 이해와 종양 진행에 대한 치료의 영향에 기여할 수 있습니다. 설명된 기술은 자동 합성에 의해 생성된 PET 추적자를 사용한 매우 민감하고 비침습적인 생체 내 이미징에 의한 암세포 추적입니다. 이는 기존의 방법론에 비해 동물 사용을 크게 줄여줍니다.

이 방법을 처음 접하는 개인은 그 복잡성에 압도당할 수 있습니다. 특히 PET 방사성 추적자의 자동 합성은 이 과정을 크게 단순화합니다. 우리는 이 방법의 시각적 시연이 중요한 이미징 관련 단계에 대한 이러한 관점을 보여준다고 믿습니다.

이 기술의 의미는 암세포와 함께 추적할 수 있는 새로운 치료법의 전임상 테스트로 확장됩니다. 이 방법은 암 생물학 및 치료법 개발에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 생체 내 현지화, 재배치, 확장 및 특정 개체군에 대한 장기 모니터링이 관심의 대상이 될 때마다 가능합니다.

먼저 리포터 유전자 플라스미드를 사용하고, 렌티바이러스 입자를 생성하고, 세포를 형질도입하고, 이를 특성화합니다. 그런 다음 NISFP 발현 세포주에서 방사성 추적자 흡수에 의한 리포터 유전자 기능을 분석합니다. 정제된 세포와 성장 배지를 6개의 웰 플레이트에 파종하여 모든 샘플이 3회에 걸쳐 준비되도록 합니다.

다음날 아침, 무혈청 성장 배지로 세포를 세척하고 30분 동안 섭씨 37도에서 F18 테트라플루오로보레이트 50kg 베크렐로 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 상층액을 수집하고 100마이크로리터를 사전 라벨링된 수집 튜브로 옮깁니다. 남은 상층액을 버리고 칼슘과 마그네슘을 함유한 얼음처럼 차가운 PVS 1ml로 세포를 생리학적 수준으로 세척합니다.

세척 용액을 수집하고 세척 용액 100마이크로리터를 사전 라벨링된 수집 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 세탁 과정을 한 번 더 반복하십시오. 트립신과 EDTA를 모두 함유한 PVS 500마이크로리터를 첨가하여 세포를 들어 올립니다.

세포가 분리될 때까지 섭씨 37도에서 샘플을 배양하고 현미경을 사용하여 분리를 확인합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 라벨이 부착된 수집 튜브로 옮깁니다. 다음으로 세포 샘플을 섭씨 4도에서 4분 동안 250G로 원심분리합니다.

자동 감마 카운터를 사용하여 4가지 샘플 유형 각각에서 샘플을 계산하고 방정식 1을 사용하여 흡수율을 구합니다. F18 테트라플루오로보레이트 합성을 시작하려면 적절한 화학 후드에 자동 무선 합성 플랫폼을 설정하고 올바른 XML 파일이 제어 컴퓨터에 로드되었는지 확인하십시오. 합성기가 작동하는 동안 F18 테트라푸오로보레이트가 생산된 다음 음이온 교환 카트리지에서 정제됩니다.

음이온 교환 카트리지는 물로 헹구고 질소 가스로 건조시킵니다. 최종 생성물은 1밀리리터의 0.9% 염화나트륨이 포함된 음이온 교환 카트리지에서 암시되고 배출 라인을 통해 유리 수집 바이알로 옮겨집니다. 이미징을 시작하려면 서면 프로토콜에 따라 마우스를 마취하고 준비합니다.

그런 다음 멸균 0.9% 식염수를 사용하여 F18 테트라플루오로보레이트 용액을 50마이크로리터당 5메가베크렐로 희석합니다. 피하 주사 바늘이 있는 주사기를 사용하여 F18 테트라플루오로보레이트 용액 100마이크로리터를 추출합니다. 주사기의 방사능을 측정하고 측정 값과 시간을 기록합니다.

50마이크로리터의 F18 테트라플루오로보레이트 용액을 예열된 꼬리에 정맥 주사합니다. 그런 다음 주사기에 남아 있는 방사능을 측정하고 측정 값과 시간을 기록합니다. 방사성 추적자의 꼬리 정맥 주입은 매우 중요합니다.

우리는 오사 및 방사성 추적자 유출의 위험을 최소화하기 위해 동물 마취 하에 수행합니다. 동물은 PET 이미지 획득이 시작될 때까지 마취 상태를 유지합니다. 방사성 추적자 주입 후 정확히 45분 후.

그런 다음 타이머를 45분부터 카운트다운하도록 설정하고 마우스가 흉골 위치에서 테이블 위에 놓여 있는지 확인합니다. 적절한 수술 모니터링 기구를 설치하고 계속 진행하기 전에 기구가 제대로 작동하는지 확인하십시오. 그런 다음 CT 이미징 및 PET 이미지 획득을 위한 퍼러미터를 설정합니다.

카운트다운 타이머가 15분을 가리키면 CT 이미지 획득이 시작되고 타이머가 0분을 가리키면 PET 이미지 획득을 시작합니다. 먼저 안락사된 쥐 전체의 방사능을 측정하고 측정 값과 시간을 기록합니다. 그런 다음 생쥐를 해부하고 필요한 조직을 수확합니다.

꼬리가 있거나 없는 나머지 사체의 방사능을 측정합니다. 이 값을 기록하고 측정 시간을 기록하십시오. 다음으로, 적출된 모든 조직의 무게를 개별적으로 측정하고 일광 및 형광광 아래에서 암 장기의 사진을 찍습니다.

그런 다음 다운스트림 조직학을 위해 조직을 OCT에 삽입합니다. 수확된 모든 조직의 방사능을 측정하고 값을 기록하며 측정 시간을 기록합니다. 마지막으로, 방정식 2에 설명된 대로 데이터를 표준 흡수 값 또는 SUV로 제시합니다.

이 실험에서는 방사성 핵종 형광 기록기 유전자 이미징을 사용하여 설치류 종양 모델에서 종양 진행을 추적했습니다. 컨포칼 형광 현미경 검사는 NISFP의 정확한 원형질막 국소화를 입증했습니다. NISFP 기능 및 특이도는 NIS가 제공한 방사성 추적자 흡수를 사용하여 정량화되었습니다.

유사한 NIS 발현 수준을 가진 세포주를 발현하는 4T1NISRFP와 4T1NISRFP 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다. 중요한 것은 프리클로산염 블록이 모든 세포주에서 얻어진 방사성 추적자 흡수가 특정 NISFP 발현에 기인한다는 것을 입증했다는 것입니다. 종양이 있는 동물의 전신 PET 영상은 종양 진행 및 전이성 확산에 대한 정보를 밝혔습니다.

여기에 표시된 예는 폐에 여러 개의 뚜렷한 결절이 있는 광범위한 장기 전이를 보여줍니다. 주입된 투여량의 퍼센트와 폐에서 개별 전이의 점유량은 다양했다. 그러나, 부피 정규화 퍼센트 주입 용량 값은 유사한 범위 내에 있었다.

이중 모드 리포터 유전자의 형광 단백질은 동물 해부 중 형광광 아래에서 암 조직 식별을 가능하게 했습니다. 그 후 생체 외 방사성 추적자 생체 분포를 통해 방사성 추적자 흡수율이 높은 장기가 밝혀졌고, 이에 따라 NIS 발현 조직이 밝혀졌습니다. 갑상선과 침샘, 그리고 위는 고유하게 NIS를 발현하지만, 다른 모든 긍정적인 신호는 종양 및 전이와 같은 암 조직을 나타냅니다.

방사성 핵종 형광 리포터는 또한 다운스트림 조직 절편에서 암세포를 식별할 수 있도록 합니다. 이 기술은 암 분야의 연구자들이 자연 전이의 과정을 시각화하고 약물이 이에 어떤 영향을 미치는지 테스트할 수 있는 길을 열었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 단계를 미리 신중하게 계획하는 것이 중요합니다.

세포주를 확립하고, 동물 종양 모델을 설정하고, 이미징을 위한 모든 시약과 장비를 필요한 날짜에 사용할 수 있어야 합니다. 처음에는 소규모 파일럿 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 일단 마스터하면 방사성 추적자 생산 및 생체 내 동물 이미징이 적절하게 수행된다면 하루 8시간 동안 6마리의 동물을 대상으로 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 형광 단백질과 결합된 방사성 핵종 리포터 NIS를 사용하여 생체 내 세포 추적이 가능한 리포터 유전자에 접근하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 세포주를 발현하는 NISFP 리포터를 특성화하여 in vivo 이미징에 필요한 PET 방사성 추적자를 생산하고 분포 실험을 통해 in vivo 및 ex vivo 실험을 수행할 수 있어야 합니다. 이 절차에 따라 추가 질문에 답하기 위해 형광구 측정법과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

예를 들어, 종양의 면역 세포 프로필과 전이가 서로 어떻게 관련되어 있는지 또는 시간이 지남에 따라 어떻게 변하는지 등이 있습니다. 생산하는 세포주에 마이크로플라스미드가 없는지 확인하는 것을 잊지 마십시오. 마이크로플라스미드는 결과에 영향을 미치는 것으로 보고되었기 때문입니다. 중요한 것은 방사성 동위원소로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 자신과 타인에 대한 보호가 우선시되어야 한다는 것을 잊지 마십시오.