Name: Ex Vivo Normothermic 간 관류의 작은 동물 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 배우세요 쥐를 이용한 체외 정온 간 관류 모델로 장기 보존 손상을 완화하고 이식 연구에서 간 기능을 평가하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 간단하고 비용 효율적입니다.

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이 작품은 장기 이식, 관류, 엔지니어링 및 오하이오 주립 대학에서 재생에 대 한 NIH T32AI 106704-01A1와 토니 flesch 식 기금에 의해 지원 되었다.

모든 절차는 기관 동물 관리의 지침에 따라 수행 했다 국가 연구 위원회의 자비 롭 배려 그리고 사용의 실험실 동물 (IACUC)에 대 한 가이드 하 고 오하이오 주립 대학 IACUC 위원회에 의해 승인을 받은.
1. 초기 설정
<ol><li>
다음 결합 하 여 관류 솔루션 준비: 25% 알 부 민 86 mL, 윌리엄스 미디어의 184 mL, 페니실린/스 (10 U/mL 페니실린과 0.01 mg/mL 스), 인슐린 (50 U/L), 헤 파 린 (0.01 U/mL), L-글루타민 (0.292 g/L), 30 mL 및 300 mL의 총 볼륨을 날린 (0.010 g/L). 기본 perfusate를 못 고양이 그룹, 페그-고양이의 625 U/mL를 추가 합니다.
	<ol>
<li>PH 7.4에 트리 (hydroxymethyl) aminomethane (THAM)를 사용 하 여 perfusate 솔루션을 버퍼링 합니다. 동맥 혈액 가스 기계를 사용 하 여 perfusate pH를 확인.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
회로 (그림 1)을 설정 합니다.
	<ol>
<li>따뜻한 물 욕조에 설정 하 고 37 ° c.에 설정 워밍업을 기관 실을 수 있습니다.</li>
		<li>저수지에 혼합 및 버퍼 된 perfusate를 부 어 하 고 순환을 시작 합니다. 참고:이 단계에서 언급 한 perfusate 단계 1.1.1에서에서 준비 되었다.</li>
		<li>인라인 oxygenator 통해 흐름 카운터에 의하여 가스 (95% 산소와 5% 이산화탄소)를 켭니다.</li>
		<li>데이터 수집 소프트웨어를 켜고 클릭 "시작" 실험의 기간에 대 한 기록.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수술 현미경과 수술 실 (그림 2)를 설정 합니다.
	<ol>
<li>지구 온난화 보드, electrocautery, 마 취 및 생체 신호 (심장 박동과 산소 포화) 장비를 모니터링을 포함 하 여 모든 장비를 켜십시오. 참고: 현미경 설정을 사용 하는 현미경에 따라 달라 집니다 및 사용자의 편안 하 게 조정 될 수 있다.</li>
		<li>흡입 (분자량 184.5 g/mol)에 대 한 액체 isoflurane의 10 mL와 10 mL 마 취 주사기와 마 취 단위에.</li>
		<li>헤 파 린 (50 U), 외과 악기의 0.5 mL 주사기를 위치, 4-0와 7-0 비단 봉합, 멸 균 면봉, 및 4 cm x 4 cm 직 거 즈 스폰지 적절 하 게 (그림 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isoflurane 챔버를 준비 합니다.</li>
</ol>2입니다. 마 취의 유도
<ol><li>다음과 같은 개인 보호 장비 (PPE) 착용: 수술 용 마스크, 수술 용 장갑, 일회용 가운.</li>
	<li>쥐의 무게. 참고: 우리는 250-350 g 사이 Sprague-Dawley 쥐를 사용합니다.</li>
	<li>산소 압축기 및 isoflurane 켭니다. Isoflurane 챔버에 무게 되 고 후는 쥐를 놓고 뚜껑을 확보 합니다. 6% isoflurane 2 L/min의 산소 전달 사용 하 여 마 취를 유도. 참고: 사용 하는 정확한 isoflurane 복용량 사용 되 고 특정 마 취 시스템에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>전자 면도기를 사용 하 여 동물의 복 부 머리. 클립
</li>
	<li>동물 isoflurane 챔버에 장착.</li>
	<li>수술 실에서 마 취 장치를 켭니다.</li>
	<li>마 취 유도 완전히 isoflurane 상공에서 쥐를 제거. 발가락 핀치를 사용 하 여 마 취의 깊이 확인 합니다.</li>
</ol>3. 조달 절차
<ol><li>
16 G 포털 갑 (그림 3)를 준비 합니다.
	<ol>
<li>16 G angiocatheter로 시작 합니다. 튜빙의 7mm 섹션을 잘라. 3.5. 절 개를 중간 지점에서 측정 하 여 7 mm 섹션의 중간점을 확인 하 고 튜브의 앞쪽 절반을 제거.</li>
		<li>이 지금은 평평한 부분을 분쇄 하는 hemostat를 사용 합니다. 라이터를 사용 하 여 입술을 만드는 angiocatheter의 다른 쪽 끝을 녹기. 불꽃에 직접 팁을 배치 하지 마십시오 또는 그것은 점화 하는 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
담 관 정을 준비 합니다.
	<ol>
<li>27 G angiocath 고만 카 테 터를 떠나 주입 포트 차단. 27 G cannular 튜브의 10 cm 섹션에이 연결 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>그것의 코를 가진 쥐를 마 취 코 콘에 놓고 그것의 4 개의 사지를 움직일 수 있습니다. 왼쪽된 뒷 끝에 모니터를 연결 하 여 생체 신호를 모니터링 합니다. 마 취의 적절 한 깊이 확인 하는 발가락 핀치를 수행 합니다. 4 %isoflurane 마 취를 계속 (무게 동물 > 250 g).</li>
	<li>70% 이소프로필 알코올로 동물의 복 부를 스프레이. 건조를 허용 합니다. 동물 살 균 드 레이프를 놓습니다.</li>
	<li>중간 절 개를 고 칼에서 사용 하 여 액을 날카로운가 위 (그림 4) 피부를 통해 확장을 확인 합니다. 부드럽게 복을 입력 하 고 근육을 incise. 이 절 개의 열 등 한 측면에서 방광과 간이 절이 개의 우수한 측면에서 손상 되지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>간 열 등 한 국경의 수준에서 크로스를 오른쪽과 왼쪽에 옆으로 절 개를 확장 합니다.</li>
	<li>2%까지 마 취를 설정 (동물 무게 > 250 g).</li>
	<li>곡선된 모기 클램프와 갈비뼈 늑 골 견인 기 (그림 5)를 사용 하 여 사용 하 여 칼 과정을 철회.</li>
	<li>falciform 인할지, 컷과 날카로운가 위 gastrohepatic 인 대.</li>
	<li>찾아서 타이-오프 인할지 정 맥 누출을 방지 하기 위해 가능한 그것의 근원에 가까운로 7-0 봉합을 합니다.</li>
	<li>쥐 살 균 moistened 목화 제보 주걱을 사용 하 여 내장을 들어낸 고 창 0.9% 정상적인 염 분을 적신 거 즈에 포장. 알아서 하지 작은 창 자의 맥 관 구조를 스트레칭.</li>
	<li>열 등 한 베 나 정 맥 (IVC) 초과 조직을 제거를 통해 해 부. 그냥 분기점을 우수한 IVC 뒤에 dissect 그리고 나중에 사용 (그림 6)에 대 한 4-0 비단 봉합의 루프를 전달 합니다.</li>
	<li>바로 부 신 정 맥에 노출을 제공 하는 오른쪽 신장 철회. 거 즈와 머리 간 오른쪽 엽을 철회. 최대한 IVC 가까이로 7-0 비단 봉합 사로 바로 부 신 정 맥에서 고 원심 넥타이 (그림 7)에 걸쳐 부식.</li>
	<li>신중 하 게 비장 정 맥 밖으로 해 부, 그것은 2 개의 7-0 비단 봉합을 사용 하 여 고 두 봉합 사이 가로질러.</li>
	<li>고 추가 혈관 포털 정 맥에 추가 길이 대 한 7-0 비단 봉합 사를 사용 하 여 필요한 경우 선. 참고: 있습니다 때로는 바로 부 신 정 맥 및 열 등 한 간 사이 infrahepatic IVC의 작은 분 지.</li>
	<li>Gastroduodenal 동맥 주위 dissect, 7-0 비단 봉합으로 gastroduodenal 동맥에서 고 gastroduodenal 동맥 선.</li>
	<li>간 동맥 주위 dissect 하 고 장소 주위 (그림 8) 7-0 비단 봉합 넥타이.</li>
	<li>
담 즙 덕트에 밖으로 해 부.
	<ol>
<li>담 즙 덕트의 길이 확인 합니다. 7-0 비단 봉합 사를 사용 하 여 선단부에서 담 즙 덕트에서 타이. 담 관 주위 7-0 비단 봉합의 루프를 가능한 proximally 놓습니다.</li>
		<li>작은 위로 덕트의 절반 직경 구멍을 뚫고 고 27 G 테 담 즙 덕트 proximally 합니다. 로마 샌들 넥타이 봉합 (그림 9)를 사용 하 여 장소에 테를 묶어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>음 경 정 맥 또는 IVC 27g 바늘을 사용 하 여 동물의 헤 파 린 (50 U)의 0.5 mL를 주사. 참고: 27 G 인슐린 주사기가 대신 사용할 수도 있습니다.</li>
	<li>클램프와 IVC 이전 배치를 사용 하 여에서 4-0 비단 봉합 넥타이.</li>
	<li>이전 배치를 사용 하 여 간 동맥을 묶어 7-0 비단 봉합.</li>
	<li>Microsurgical 클립을 사용 하 여 문맥을 클램프. 22 G angiocatheter를 사용 하 여 문맥 cannulate 플러시 간까지 1 mL 헤 파 린 (100 U)와 차가운 0.9% 정상적인 염 분의 60 mL와 문맥 blanches (그림 10). 참고: 간 즉시 희게 하지 않습니다 그것은 메 마른 면 끝 도포와 마사지 될 수 있습니다.</li>
	<li>IVC suprahepatic 하 고 높은 가능한 가슴에 그것을 통해 잘라.</li>
	<li>hepatectomy 다음과 같이 수행 합니다. 막 주위, 간 동맥을 잘라, 잘라는 IVC, 포털 정 맥을 잘라, 어떤 추가 인 대를 잘라 잘라내어 간 꺼내. 간 얼음 차가운 0.9% 정상적인 염 분 (그림 11)에 놓습니다.</li>
	<li>문맥 (그림 12)에서 16 G 혈관 팔목을 놓습니다. 간 비보 전 normothermic 간 관류 회로에 배치 합니다.</li>
</ol>4. 전 비보 Normothermic 간 관류
참고: 여기에 사용 되는 perfusate 프로토콜 단계 1.1.1에서에서 준비 되었다.
<ol><li>(그림 13) cuffed 문맥에 문맥 정 맥을 놓습니다.</li>
	<li>문맥 정 맥 배치 하는 동안 하려면 2 mL/min에서 회로 통해 perfusate의 흐름을 유지 합니다. 시계 어떤 스파이크 문맥 압력;에 대 한 모니터 이 선박 차단 되 고 필요 하다는 정 맥의 위치를 나타낼 수 있습니다.</li>
	<li>7-0 비단 봉합 사를 사용 하 여 perfusate의 반환 교류에 대 한 IVC 정에 봉합.</li>
	<li>일단 두 뉼 그 자리에 이면, 10-16 cmH2O의 범위에서 생리 적 압력에 도달할 때까지 1 mL/min에서 흐름을 선회 시작 합니다.</li>
	<li>
사전에서 1 mL 샘플 및 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 및 관류의 240 분에 후 포트를 가져가 라. 1 mL 샘플을 두 0.5 mL 샘플 나눕니다. 참고: 0.5 mL이 프로토콜 단계 4.5.1에서 사용 될 것입니다 그리고 0.5 mL 프로토콜 단계 4.5.2에서에서 사용 될 것입니다.<ol>
<li>스냅 액체 질소에 저온 관에이 샘플의 0.5 mL를 고정 합니다.</li>
		<li>Perfusate의 나머지 0.5 mL를 사용 하 여 동맥 혈 가스 분석을 실행 합니다.</li>
		<li>각 시간 지점에서 혈액 가스 분석을 실행 한 후 (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 및 240 분) pH 수준을 검토 하 고 pH 7.4로 돌아갈 필요는 perfusate 버퍼.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 h 관류의의 결론에 간 관류 회로에서 분리 합니다. 간 0.5 g 세그먼트로 나눕니다. 스냅 액체 질소에 저온 관에 간 조직 고정.</li>
</ol>5. 사후 실험 분석
<ol><li>
0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 및 상업 색도계 분석 실험 키트를 사용 하 여 240 분에서 perfusate에 알라닌 aminotransferase (ALT) 레벨을 결정 합니다.
	<ol>
<li>간단히, 60 분 측정 570에서 광학 밀도 값에 대 한 37 ° C에서 반응 혼합 시 약으로 perfusate를 품 어 nm microplate 리더를 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0.5 g의 간 조직 세포의 용 해 버퍼의 100 µ L 균질 하 고 조직 lysate 아데노신 3 인산 염 (ATP), 티 (GSH) 및 malondialdehyde (MDA)에 대 한 분석.
	<ol>
<li>간단히, 상업 시험 키트를 사용 하 여 간 조직 샘플의 ATP 수준을 측정 합니다. 반응 버퍼와 샘플을 혼합 하 고 30 분 측정 570에서 광학 밀도 대 한 실 온에서 품 어 nm microplate 리더를 사용 하 여.</li>
		<li>상용 시험 키트를 사용 하 여 간 조직 샘플의 GSH 레벨을 측정 합니다. 조직 샘플 분석 결과 칵테일 믹스. 405-414 nm에 광학 밀도 값을 측정 합니다.</li>
		<li>상용 시험 키트를 사용 하 여 간 조직 샘플의 MDA 레벨을 측정 합니다. TBA와 60 분 분리기 반응에 대 한 95 ° C에 열 샘플을 혼합 하 고 96 잘 접시에는 상쾌한 전송. 532에서 광학 밀도 측정 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0.5 g의 간 조직 세포의 용 해 버퍼의 100 µ L 균질 하 고 상업 시험 키트를 사용 하 여 상대 caspase-3/7 활동에 대 한 lysate 조직 분석.
	<ol>
<li>Caspase-3-7 시 분석 결과 버퍼와 조직 lysate를 혼합 하 고 30 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>잘 사용 하 여 각 microplate 리더에 형광 레벨을 측정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
상업적인 제자리에 죽음 탐지 키트를 사용 하 여 간 조직 샘플에 apoptotic 세포의 수준을 결정 합니다.
	<ol>
<li>사전 치료는 0.5 g 조직 섹션 10 U/mL 가수분해 K 10 분으로 하 고 60 분 수행 형광 현미경을 사용 하 여 분석에 대 한 37 ° C에서 반응 혼합물으로 품 어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

모든 저자 들은 아무 관련 공개 보고서.

이식에 사용할 수 있는 간 이식의 중요 한 부족은 그리고 응답에 기증자 기준 확장된1,2,3,,45되었습니다. 기증자 부족 결과로 NEVLP 평가 기관 기능6,7을 수정 하는 방법으로 도입 되었습니다. 우리는 NEVLP의 쥐 모델을 설계 했습니다. 또한, 우리는이 모델을 사용 하는 중요 한 잠재적인 응용 프로그램 중 하나를 보여-간 perfusate에 비 발한 분자 첨가제의 테스트. 여기, 우리는 기본 perfusate 말뚝-고양이 추가 간 보존 상해를 완화 하는 기능을 시연 했다.
<s...

14,578 환자 간 이식 대기자 명단에 있으며 약 7000 이식 당 년1,2수행 됩니다. 이 중요 한 기증자 부족에 대응, 간 기증자에 대 한 기준을 확장 했다; 이 종종 한계 장기 또는 확장된 기준 기증자 하며 기본 이식 부전 및 지연된 이식 함수3의 더 높은 속도와 표준 기준 이식 보다 이식 후 덜 잘 수행할 것으로 예상 된다 4,,56. 그 결과, NEVLP 평가 기관 기능6,7을 수정 하는 방법으로 도입 되었습니다. 우리 NEVLP의 쥐 모델을 설계 하 고이 모델을 사용 하는 그것의 중요 한 잠재적인 응용 프로그램-간 perfusate에 비 발한 분자 첨가제의 테스트 중 하나를 보여 줍니다.
NEVLP (쥐) murine 및 돼지 모델 뿐만 아니라 폐기 인간의 장기6,,89평가 하고있다. NEVLP의 첫 인체 실험의 결과 또한 최근 게시10있다. 저체온증이 기계 관류 명확 하 게 신장 보존을 위한 표준 되고있다, 관류는 간 기계에서 발생 하는 온도 여전히 논란. NEVLP는 저체온증에 비해 많은 제안된 이점 및 subnormothermic 관류. 이들은 감소 보전 부상, 정상 장기의 기능 생리 조건, 장기 성능을 평가 하는 능력 및 기관 수리, 개조, 및 수정7,11를 위한 플랫폼으로의 복원 12,13,14,15,,1617.
연구의 상당수 돼지 NEVLP 모델을 사용 하 여 완료 되었습니다. 때 고려 모델을 사용 하 여 삭제 인간 장기 또는 인간 임상 시험이이 모델은 비교적 비싼 되지 않습니다, 하지만 그들은 우리의 작은 동물 NEVLP 모델에 비해 매우 비쌉니다. 중요 한 구성 요소는 실험 당 비용은 perfusate 이다. 우리는 상대적으로 저렴 한 비용에 perfusate의 300 mL와 4 h 관류를 완료할 수 있습니다. 또한, 쥐를 포함 하 여 작은 동물의 비용 돼지의 비용에 비해 매우 낮습니다.
쥐에서 NEVLP의 다른 모델에 비해 여기 모델 구현에 상대적으로 간단한 이며 광범위 한 응용 프로그램 있다. 관류 회로 그림 1에서 볼 수 있습니다. perfusate perfusate 저수지 (1), 물 외피 컨테이너에서 시작 합니다. Perfusate 롤러 펌프 (2) 저수지에서 가져온 이며 windkessel (3) 그리고 oxygenator (4)에 밀어. oxygenator 최대 가스 교환을 제공 역류 가스 및 perfusate 흐름에 대 한 설정 됩니다. Perfusate 다음 수익금으로 난방 코일 (5) 내부 생리 온도에, 그것을 보장 하기 위해 관류 챔버는 그리고 거기 공기 방울의 관류를 방지 하기 위해 거품 트랩 (6) 사전 (7) 및 후 기관 (8) 수를 perfusate 수 있는 샘플 포트 샘플링. perfusate 다음 문맥 정 맥을 통해 간을 입력합니다. 문맥 정 맥 압력 모니터 데이터 수집 소프트웨어에 있는 값을 차트에 첨부 됩니다. perfusate IVC 정 맥을 통해 간 종료 그리고 압력 이퀄라이저 블록 (9)으로 흐른다. 마지막으로, perfusate는 롤러 펌프를 통해 다시 압력 블록에서 가져온 이며 저수지에 비운. 이 모델 포함 하는 문맥에 지속적인 관류 및 간 동맥 및 투 석 다른 모델에 사용 되는 별도 고 추가 회로 필요, 타악기 흐름 밖으로 나뭇잎 하지만 이전 하지 입증 되었습니다. 필요한9,13.
perfusate에 새로운 치료 분자의 추가 탐험, 우리 효소 카 탈 라 제를 선택 했다. 카 탈 라 제는 생 선생님 폐품 선생님18의 효과 완화 하는 셀 내부 방어 메커니즘의 일부입니다. 카 탈 라 제 식 간 국 소 빈 혈 reperfusion 상해19에서 증가 된다. Catalase의 실험 또한 눈, 뇌, 그리고 폐20,,2122,,2324에 국 소 빈 혈 reperfusion 감소 입증 되었습니다. Pegylation 내 피 세포25에 피 catalase 이해에 원조 하는 catalase를 대상으로 표시 되었습니다. 못-고양이 되어 관리 체계적으로 간 국 소 빈 혈 reperfusion 상해; 감소에 제한 된 효능 그러나, 우리는26,,2728결과 추가 말뚝-고양이 격리 된 장기 관류 회로 개선 이어질 것을 가정 했다. 여기, 우리가 우리의 기본 perfusate 말뚝-고양이 추가 및 그것의 능력을 간 보존 부상 완화.

<table><tbody><tr><td>Perfusate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8% Albumin</td><td>CLS Behring, King of Prussia, PA</td><td>0053-7680-32</td><td></td></tr><tr><td>Williams Media</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>W1878</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Eli Lilly, Indianapolis, IL</td><td>0002-8215-91</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Fresnius Lab, Lake Zurich, IL</td><td>C504701</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>THAM</td><td>Hospira,</td> Inc,0409-1593-04 <td></td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 - 카탈라아제</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S9549 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>개인 보호 장비 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical Mask</td><td>Generic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>보호 가운</td><td>Generic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>수술용 장갑</td><td>Generic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Liver Procurement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley Rat</td><td>Harlan Sprague Dawley Inc.</td><td>250 -350 그램</td><td></td></tr><tr><td>수술용 현미경</td><td>Leica</td><td>M500-N w/ OHS</td><td></td></tr><tr><td>숯 캐니스터</td><td>Kent Scientific</td><td>SOMNO-2001-8</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pressure-Lok Precision Analytical Syringe&nbsp;</td><td>Valco 인스트루먼트 (주), Inc.</td><td>SOMNO-10ML</td><td></td></tr><tr><td>전기 수술 유닛</td><td>Macan</td><td>MV-7A</td><td></td></tr><tr><td>온난화 패드</td><td>Braintree Scientific</td><td>HHP2</td><td></td></tr><tr><td>SomnoSuite 소동물 마취 시스템</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-MVG-Module</td><td></td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>Kent Scientific</td><td>PS-MSTAT-RT</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란 챔버</td><td>Kent Scientific</td><td>SOMNO-0530LG</td><td></td></tr><tr><td>SurgiVet</td><td>Isotec</td><td>CDS 9000 탁상용</td><td></td></tr><tr><td>산소</td><td>Praxair</td><td>98015</td><td></td></tr><tr><td>리브 견인기</td><td>Kent Scientific</td><td>INS600240</td><td></td></tr><tr><td>GenieTouch</td><td>Kent Scientific</td><td>GenieTouch</td><td></td></tr><tr><td>Normal</td><td>Saline Baxter</td><td>NDC 0338-0048-04</td><td></td></tr><tr><td>4x4 부직포 스폰지</td><td>기준</td><td>104-2411</td><td></td></tr><tr><td>멸균 Q-Tips</td><td>Henry Schein 동물 건강</td><td>1009175</td><td></td></tr><tr><td>U-100 27 게이지 인슐린 주사기</td><td>Terumo</td><td>22-272328</td><td></td></tr><tr><td>5mL 주사기</td><td>BD</td><td>REF 309603</td><td></td></tr><tr><td>4-0 꼰 실크 봉합사</td><td>Deknatel, Inc.</td><td>198737LP</td><td></td></tr><tr><td>7-0 꼰 실크 봉합</td>사 <td>Teleflex Medical</td><td>REF 103-S</td><td></td></tr><tr><td>16 게이지 카테터</td><td>BBraun Introcan Safety</td><td>4252586-02</td><td></td></tr><tr><td>14 게이지 카테터</td><td>BBraun Introcan Safety</td><td>4251717-02</td><td></td></tr><tr><td>담관 캐뉼라 튜빙</td><td>Altec</td><td>01-96-1727&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><강한>간 관류 회로 구성 요소 </강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>물 목욕 워머</td><td>Lauda Ecoline Staredition</td><td>E103</td><td></td></tr><tr><td>데이터 수집 소프트웨어</td><td>ADInstruments&nbsp;</td><td>Labchart 7</td><td></td></tr><tr><td>간 관류 회로</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-2901</td><td></td></tr><tr><td>멤브레인 산소 발생기</td><td>Mediac SPA</td><td>M03069</td><td></td></tr><tr><td>롤러 펌프</td><td>Ismatec</td><td>ISM827B</td><td></td></tr><tr><td>가스 (95 % 산소 및 5 % 이산화탄소)</td> <td>Praxair</td><td>98015</td><td></td></tr><tr><td>Organ Chamber</td><td>Harvard Apparatus</td><td>ILP-2</td><td></td></tr><tr><td>1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube</td><td>USA Scientific</td><td>1418-7410</td><td></td></tr><tr><td>Mucasol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z637181</td><td></td></tr><tr><td>Microsurgical Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5610</td><td></td></tr><tr><td>대형 가위</td><td>S& T</td><td>SAA-15</td><td></td></tr><tr><td>집게 - 대형 앵글</td><td>S & T</td><td>JFCL-7</td><td></td></tr><tr><td>집게 - 작은 각진</td><td>S & T</td><td>FRAS-15 RM-8</td><td></td></tr><tr><td>클립 애플리어</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5440</td><td></td></tr><tr><td>가위 - 비 마이크로</td><td>FST 14958-11</td><td>14958-11</td><td></td></tr><tr><td>집게 - 스트레이트 팁</td><td>S & T</td><td>FRS-15 RM8TC</td><td></td></tr><tr><td>대형 미세 수술 클립</td><td>미세 과학 도구</td><td>18055-01</td><td></td></tr><tr><td>소형 미세 수술 클립</td><td>미세 과학 도구</td><td>18055-01</td><td></td></tr><tr><td>소형 미세 수술 클립</td><td>미세 과학 도구</td><td>18055-02</td><td></td></tr><tr><td>소형 미세 수술 클립</td><td>미세 과학 도구</td><td>18055-03</td><td></td></tr><tr><td>소형 모기 클램프</td><td>일반</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Post-Experiment Analysis </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit</td><td>BioVision</td><td>K752</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit</td><td>BioVision</td><td>K354</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione Assay Kit</td><td>Cayman Chemical</td><td>703002</td><td></td></tr><tr><td>지질 과산화(MDA) 분석 키트</td><td>Abcam</td><td>ab118970</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 분석 시스템</td><td>Promega</td><td>G8090</td><td></td></tr><tr><td>POLARstar OMEGA 마이크로플레이트 리더</td><td>BMG LABTECH</td><td>해당 없음</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo normothermic 간 관류의 작은 동물 모델

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

간 이식의 중요 한 부족, 이식에 사용할 수 있는 이며 응답에서 기증자 기준을 확대 했습니다. 그 결과, normothermic 비보 전 간 관류 (NEVLP)를 평가 하 고 장기의 기능을 수정 하는 방법으로 도입 되었습니다. NEVLP에는 저체온증에 비해 많은 이점이 있다 고 보존 부상, 정상 장기의 기능 생리 조건 평가 기관 성능, 그리고 오르간 수리에 대 한 플랫폼으로의 복원 감소 subnormothermic 관류 등 리 모델링, 그리고 수정. Murine 및 돼지 NEVLP 모델 설명 되었습니다. 우리는 NEVLP의 쥐 모델을 설명 하 고이 모델을 사용 하 여 중요 한 응용 프로그램 중 하나를 보여-치료 분자 간 perfusate에 추가 사용 하 여. 카 탈 라 제 생 반응성 산소 종 (선생님) 폐품 이며 눈, 뇌, 그리고 폐에 국 소 빈 혈 reperfusion 감소 입증 되었습니다. Pegylation은 endothelium에 catalase를 대상으로 표시 되었습니다. 여기, 우리는 기본 perfusate pegylated catalase (못-고양이) 추가 간 보존 상해를 완화 하는 기능을 시연 했다. 우리의 설치류 NEVLP 모델의 장점은 큰 동물 모델에 비해 비싼 아니에요입니다. 이 연구의 한계는 그것은 현재 간 이식 후 관류는 포함 하지 않습니다. 따라서, 확실 하 게 예측 후 장기 이식의 함수를 만들 수 없습니다. 그러나, 쥐 간 이식 모델은 잘 설립 하 고 확실히이 모델과 함께에서 사용 될 수 있습니다. 결론적으로, 우리는 저렴, 간단 하 고, 쉽게 복제 가능한 NEVLP 모델을 쥐를 사용 하 여 설명 했다. 이 모델의 응용 프로그램 테스트 소설 perfusates 및 perfusate 첨가제, 테스트 기관 평가 위한 소프트웨어 및 장기를 복구 하도록 설계 된 실험을 포함할 수 있습니다.

그룹 당 3 개의 쥐의 샘플 크기 사용 되었다. ALT는 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 및 관류의 240 분에서 측정 했다. 우리가 사용 하는 학생의 t-기본 perfusate 및 기본 perfusate 플러스 각 시간 지점에서 못 고양이 그룹 사이 결과 비교 하는 테스트. 기본 perfusate 및 기본 perfusate 플러스 말뚝-고양이 그룹을 비교, 거기에서는 훨씬 적은 (p &lt; 0.05) 기본 perfusate 플러스 150, 180, 210, 240 분 (그림 14A)에서 못 고양이 그룹에서 ALT.
간 조직 기본 perfusate 및 기본 perfusate 플러스 말뚝-고양이 그룹에서 조직 손상 분석 하기 위해 조달 했다. 우리가...

상당한 간 기증자 부족 이며 간 기증자에 대 한 기준을 확대 했습니다. Normothermic ex vivo 간 관류 (NEVLP)를 평가 하 고 장기의 기능을 수정 개발 되었습니다. 이 연구 NEVLP의 쥐 모델을 보여 줍니다 고 간 보존 부상 완화 pegylated catalase의 능력을 테스트 합니다.

Ex Vivo Normothermic 간 관류의 작은 동물 모델

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

이 방법은 이식 및 장기 보존 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 응용 분야에는 새로운 관류액 및 관류액 첨가제 테스트, 장기 평가를 위해 설계된 소프트웨어 테스트, 장기 복구를 위해 고안된 실험 수행이 포함됩니다. 이 기술의 주요 장점은 여기에 제시된 정상온열 생체 외 간 관류 모델이 간단하고 쉽게 복제할 수 있으며 비용이 저렴하고 광범위한 응용 분야를 가지고 있다는 것입니다.16게이지 포털 커프를 준비하는 것으로 시작하십시오. 튜브의 5mm 부분을 자르고 2.5mm를 측정하여 단면의 중간 지점을 결정합니다. 중간 지점을 절개하고 튜브의 앞쪽 절반을 제거합니다.지혈제를 사용하여 이제 평평한 이 부분을 부수십시오. 라이터를 사용하여 혈관 카테터의 다른 쪽 끝을 녹여 입술을 만듭니다. 다음으로, 카테터만 남기고 27게이지 혈관 카테터에서 주입구를 절단하여 담관 캐뉼라를 준비합니다.이것을 27 게이지 캐뉼러 튜브의 10cm 섹션에 연결합니다. 마취된 쥐를 마취 콧방울 안에 코를 넣고 네 팔다리를 움직이지 못하게 합니다. 모니터를 왼쪽 뒷다리에 부착하여 활력 징후를 모니터링합니다.적절한 마취 깊이를 확인하기 위해 발가락 꼬집기를 수행합니다. 동물의 복부에 70%의 이소프로필 알코올을 뿌리고 말리십시오. 동물 위에 멸균 드레이프를 놓습니다.그런 다음 날카로운 가위를 사용하여 xiphoid에서 치골까지 정중선을 절개 한 후 부드럽게 복막에 들어가 근육을 절개합니다. 절개 부위를 왼쪽과 오른쪽으로 측면으로 확장하여 간의 아래쪽 경계 수준에서 십자가를 형성합니다. 이 시점에서 이소플루란 마취를 2%로 낮추십시오.곡선형 모기 클램프를 사용하여 xiphoid 과정을 후퇴시키고 늑골 견인기를 사용하여 갈비뼈를 수축시킵니다.그런 다음 날카로운 가위를 사용하여 팔시폼, 흉간 및 위간 인대를 자릅니다. 누출을 방지하기 위해 가능한 한 원점에 가까운 7-0 봉합사로 횡격막 정맥을 찾아 묶습니다. 다음으로, 멸균 된 적신 면봉 어플리케이터를 사용하여 쥐의 내장을 제거합니다.0.9%의 생리식염수가 적신 거즈로 장을 감싸고 혈관 조직이 늘어나지 않도록 주의합니다. 그런 다음 하대정맥을 절개하여 과도한 조직을 제거합니다. 분기점 바로 위의 IVC 뒤를 절개하고 나중에 사용할 수 있도록 4-O 실크 봉합사의 고리를 통과시킵니다.다음으로, 오른쪽 신장을 수축시켜 오른쪽 부신 정맥에 노출시키고 거즈로 간의 오른쪽 엽을 우월하게 수축시킵니다. 7-0 실크 봉합사로 오른쪽 부신 정맥을 IVC에 최대한 가깝게 묶고 넥타이 원위부에서 소작합니다. 그런 다음 비장 정맥을 조심스럽게 해부하십시오.두 개의 7-0 실크 봉합사를 사용하여 묶고 두 봉합사 사이를 가로질러 자릅니다. 위십이지장 동맥 주위를 절개한 후 7-0 실크 봉합사와 결찰물로 위십이지장 동맥을 묶습니다. 그런 다음 간 동맥 주위를 절개하고 그 주위에 7-0 실크 봉합사 넥타이를 느슨하게 놓습니다.다음으로 담관을 절개합니다. 그런 다음 담관의 길이를 확인하고 말단부에 묶은 다음 담관 주위와 가능한 한 근방에 봉합사 고리를 놓습니다. 작은 가위를 사용하여 담관 직경의 절반 정도의 구멍을 뚫고 27 게이지 카테터를 담관 근처에 삽입합니다.로마 샌들 타이 봉합사를 사용하여 카테터를 제자리에 묶습니다. 다음으로, 27게이지 바늘을 사용하여 0.5ml의 헤파린을 음경 정맥(IVC)에 주입합니다. 그런 다음 이전에 배치된 4-0 실크 봉합사를 사용하여 IVC를 고정하고 이전에 배치된 7-0 실크 봉합사를 사용하여 간 동맥을 묶습니다.이제 미세 수술 클립을 사용하여 문맥을 고정합니다. 22 게이지 혈관 카테터를 사용하여 문맥을 캐뉼레이션하고 간이 희어질 때까지 100 단위의 헤파린이 함유된 60ml의 차가운 0.9% 일반 식염수로 플러시합니다. 간을 씻어낸 후 간상IVC를 노출시키고 가능한 한 가슴 높이로 자릅니다.횡격막 주위를 절단한 다음 간 동맥, IVC, 문맥 및 추가 인대를 절단하여 간 절제술을 수행합니다. 간을 들어 올려 얼음처럼 차가운 0.9%의 생리식염수를 넣습니다. 마지막으로 16게이지 혈관 커프를 문맥에 삽입하고 간을 생체 외 정상열 간 관류 회로에 연결합니다.각 관류를 시작하기 전에 회로에 대한 육안 검사를 수행하여 회로 구성 요소 또는 튜브에 대한 손상 또는 축적을 식별하고 수행해야 합니다. 회로에 박테리아 또는 기타 물질이 축적된 경우 부품을 교체하거나 청소해야 합니다. 분당 2밀리리터로 관류액을 흘려보내는 것으로 시작합니다.문맥 압력의 급증이 있는지 모니터에 관찰하면 혈관이 막혀 캐뉼라의 재배치가 필요함을 나타낼 수 있습니다. 7-0 실크 봉합사를 사용하여 관류액 및 봉합사의 복귀 흐름을 위해 프로탈 정맥 캐뉼라를 커프가 있는 문맥에 삽입합니다. 두 캐뉼러가 모두 제자리에 있으면 10-16cm 범위의 물 범위의 생리적 압력에 도달할 때까지 분당 1밀리리터씩 관류물의 흐름을 높이기 시작합니다.관류 중에 pre-port 및 post-port에서 1ml 샘플을 제거합니다. 각 1 밀리리터 샘플을 두 개의 0.5 밀리리터 샘플로 나눕니다. 액체 질소의 극저온 튜브에 있는 0.5ml 부분 표본 중 하나를 스냅 동결하고 나머지 0.5ml의 관류액을 사용하여 동맥혈 가스 분석을 실행합니다.그런 다음 pH를 측정하고 필요에 따라 관류액을 완충하여 pH 7.4로 되돌립니다. 4시간 동안 관류한 후 관류 회로에서 간을 분리하십시오. 간을 0.5g 분절로 나누고 극저온 튜브로 옮기고 액체 질소에서 스냅 동결합니다.ALT는 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 및 240분의 관류에서 측정되었습니다. 염기 관류액과 PEG-CAT 그룹에는 염기 관류액에 비해 ALT가 현저히 적으며, 이는 150, 180, 210 및 240분에 검은색으로 표시됩니다. 조직 ATP는 염기 관류액 단독 그룹과 비교하여 염기 관류액과 PEG-CAT 그룹에서 유지되었습니다.조직 MDA 생산은 염기 관류액과 PEG-CAT 그룹보다 염기 관류액 그룹에서 유의하게 높았습니다. 총 GSH는 염기 관류액 단독 그룹과 비교하여 염기 관류액과 PEG-CAT에서 유지되었습니다. 정상 발열 생체 외 간 관류의 제안된 각 응용 프로그램은 폐기된 인간 장기에서 테스트한 다음 인간 간에서 테스트하기 전에 동물 모델에서 체계적으로 테스트해야 합니다.여기에 제시된 모델은 쉽게 복제할 수 있고 관련 없는 테스트를 제거하며 비용이 저렴하기 때문에 이상적입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 쥐를 사용하여 저렴하고 쉽게 복제할 수 있는 정상온열 생체 외 간 관류 모델을 실행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 간 세포를 분리하기 전에 콜라겐 분해 효소 용액을 사용하여 문맥을 통한 마우스 간 관류 절차를 설명합니다.

In vivo Murine Liver Perfusion: 문맥을 통해 설치류 간에 용액을 주입하는 방법

동물 장기 생리학에 대한 연구는 실험적인 생체 외 관류 시스템을 수행하여 달성할 수 있습니다. 이전에 개발한 생체 외 간 관류 모델에 항상성 기관인 돼지 신장을 추가하는 것은 더 나은 생리학적 환경을 달성하기 위한 주요 단계가 될 수 있습니다.

자가 생체 외 관류 돼지 간-신장 실험 단계

지방산 간, 오래된 기증자로부터 이식, 또는 심장 죽음 (DCD) 후 검색 간장 등의 한계 이식 만이 저조한 기존의 차가운 정적 스토리지를 허용. 우리는 이전에 이식 한계 간 이식의 보존, 평가, 수리 subnormothermic 생체 간 관류의 새로운 모델을 개발했다.

Subnormothermic의 기술<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 간 스토리지, 평가를위한 관류 및 한계 간 이식의 수리

Normothermic 전 situ 심장 관류 (ESHP) 치는, 반 생리 적인 상태에서 마음을 유지 합니다. 작업 모드에서 수행 될 때 ESHP 심장 기능 및 장기 생존을 기증자의 정교한 평가 수행할 수 있는 기회를 제공 합니다. 여기, 우리는 ESHP 동안 심근 성능 평가 대 한 우리의 방법을 설명합니다.

작업 모드에 Situ 심장 관류 Ex normothermic: 심장 기능 및 대사 평가

프로토콜은 방광, 전립선, 성기관, 뼈, 근육 및 발 피부를 포함한 마우스 하반신의 시상 수혈에 대해 설명된다.

마우스에서 하복부 장기 및 뒷다리의 시투 폐쇄 회로 관류 에 설립

이 프로토콜은 포털 정맥 관류를 통한 대사 연구를 위해 손상되지 않은 마우스 간을 절제하는 간단한 방법을 설명합니다.

Ex Vivo 마우스의 포털 정맥을 통한 간 관류

여기에 설명된 간 정상열 기계 관류(NMP)의 돼지 모델은 보존 전략, 생존력 평가 도구 및 장기 복구를 위한 플랫폼으로서 NMP를 연구하는 데 성공적으로 사용될 수 있습니다. 이는 높은 번역 가치를 지니고 있지만 기술적으로 까다롭고 노동 집약적입니다.

Porcine Normothermic 격리 간 관류

정상 체온 생체 외 간 관류(NEVLP) 시스템이 마우스 간을 위해 만들어졌습니다. 이 시스템은 미세 수술에 대한 경험이 필요하지만 재현 가능한 관류 결과를 허용합니다. 마우스 간을 활용하는 능력은 새로운 관류액 첨가제를 식별하기 위한 분자 경로의 조사를 용이하게 하고 장기 복구에 중점을 둔 실험의 실행을 가능하게 합니다.

마우스의 Normothermic Ex Vivo 간 기계 관류

여기에서, 우리는 간 구조를 방해하지 않으면서 간 외 요인이 없는 상태에서 간 대사의 급성 및 직접적인 조절을 연구하기 위해 쥐 간의 현장 관류를 위한 강력한 방법을 제시합니다.

간 포도당 생산, 요소 형성 및 지방 분해는 관류 마우스 간 모델을 사용하여 정량화되었습니다.

목표는 EVLP 전반에 걸쳐 4시간 동안 일관된 폐 기능을 유지할 수 있는 쥐에서 새로운 생체 외 폐 관류(EVLP) 모델을 개발하고 설치류 모델에 EVLP를 적용하기 위한 견고한 방법을 제공할 구현 세부 사항을 업계에 제공하는 것입니다.

순환기 사사 후 쥐 폐를 위한 새로운 생체 외 폐 관류 시스템 구축

여기에서는 기존 플랫폼의 높은 비용과 제한된 유연성을 극복하도록 설계된 오픈 소스의 수정 가능한 규범 보온 외 관류 시스템에 대한 프로토콜을 제시하여 전임상 생물 의학 연구에서 보다 접근하기 쉽고 비용 효율적이며 반복적인 사용을 가능하게 합니다.

연구 과학자를 위해 설계된 오픈 소스 normothermic 관류 시스템

배우세요 쥐를 이용한 체외 정온 간 관류 모델로 장기 보존 손상을 완화하고 이식 연구에서 간 기능을 평가하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 간단하고 비용 효율적입니다.

Ex Vivo Normothermic 간 관류의 작은 동물 모델

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