Submucosa 및 성인 마우스의 Lamina Propria 장의 Glial 세포의 고립

이 방법은 신경 과학 분야의 주요 질문, 특히 장 신경계의 기능에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 평활근이 아닌 얇은 판과 점막하에서 장 세포를 분리하는 빠르고 비효소적인 방법이라는 것입니다. 원위 위와 유문을 식별하는 것으로 시작합니다.

장간막을 잘라내면서 집게로 유문을 잡습니다. 그런 다음 가위 뒷면으로 둔기 절개를 사용하여 부착된 췌장을 긁어냅니다. 그런 다음 가위를 사용하여 찢어지지 않고 근위 장의 7cm를 제거합니다.

장 분절을 칼슘이나 마그네슘이 없는 얼음처럼 차가운 DPBS에 넣습니다. 다음으로, 18-20 게이지 바늘의 뭉툭한 끝에 부착된 5-10밀리리터 주사기를 사용하여 얼음처럼 차가운 DPBS로 배설물 내용물을 씻어냅니다. 장을 3cm 분절로 나누어 세로 근육을 제거합니다.

장간막과 종방향 근육의 신속한 제거는 얇은 판과 점막하에서 건강한 장 신경교세포를 분리하는 데 필수적입니다. 다음으로 면봉을 가지고 약 4cm 정도 잘라 목봉과 목봉을 분리합니다. DPBS에 나무 막대기를 담그십시오.

장 분절 중 하나를 젖은 스틱에 부드럽게 밀어 넣은 다음 바늘 코 집게를 사용하여 남아 있는 접착 장간막을 제거합니다. 그런 다음 깨끗한 면도날이나 메스를 사용하여 장간막이 부착된 장을 따라 두 개의 세로 흠집을 냅니다. 엄지와 검지 사이에 스틱 끝을 잡고 중지와 네 번째 손가락으로 세그먼트를 고정합니다.

DPBS로 면 끝을 적십니다. 젖은 면 끝을 근육을 따라 세로로 문질러 세로 근육 장간막 신경총 또는 LMMP를 풉니다. 그런 다음 면 끝을 수평으로 움직여 원형 근육에서 LMMP를 떼어냅니다.

완료되면 LMMP는 장 분절을 쉽게 벗겨냅니다. 장간막 신경총에서 EGC를 채취하려는 경우가 아니면 LMMP를 폐기합니다. 그런 다음 면도날을 사용하여 장 부분을 세로로 열어 나무 막대기를 제거합니다.

주로 점막과 점막하로 구성된 벗겨진 장 조직과 DPBS의 원형 근육을 얼음 위에 보관하십시오. 모든 장 분절이 준비될 때까지 다른 샘플에 대해 해부를 반복합니다. 상피 점막을 제거하려면 먼저 가는 가위를 사용하여 장을 약 0.5cm 조각으로 자르고 얼음처럼 차가운 EDTA HEPES DPBS 용액 30ml에 조각을 모읍니다.

용액이 들어있는 조직을 섭씨 4도에서 분당 약 60 틸트로 10 분 동안 흔듭니다. EDTA HEPES DPBS 버퍼를 위아래로 한 번 피펫팅하여 5ml 플라스틱 피펫을 미리 적신 다음 미리 적신 피펫을 사용하여 조직을 분쇄하고 현탁액을 20회 버퍼링하여 상피 점막을 제거합니다. 100미크론 나일론 세포 여과기에 혼합물을 부어 조직을 수집합니다.

그런 다음 바늘 코 집게를 사용하여 스트레이너에 남아 있는 조직을 30ml의 얼음처럼 차가운 EDTA HEPES DPBS가 들어 있는 새로운 50ml 원추형 원심분리기 튜브에 넣습니다. 섭씨 4도에서 조직을 10분 동안 흔들어 분당 약 60회 기울여 EDTA HEPES DPBS 배양을 두 번째 반복하여 추가 상피 점막을 제거합니다. 미리 적신 5ml 피펫을 사용하여 부드럽게 분쇄합니다.

조직은 상피가 더 많이 제거됨에 따라 피펫 내부에 달라붙는 경향이 있습니다. 이 시점에서 장 신경교세포(enteric glia cell)가 더 취약하기 때문에 부드러운 트리추레이션(trituration)이 필요합니다. 두 번째 배양 후 100미크론 나일론 세포 여과기에 혼합물을 붓고 흐름을 버리하여 조직을 수집합니다.

두 번째 흐름은 첫 번째 흐름보다 눈에 띄게 덜 탁해야 합니다. 용액이 거의 투명해질 때까지 10분 EDTA 배양을 반복합니다. 나일론 스트레이너의 조직을 5ml의 시중에서 판매되는 세포 회수 용액이 들어 있는 15ml 원추형 원심분리 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 25-30분 동안 흔들어 둡니다. 장 신경교세포(enteric glial cell)를 얇은 판막(lamina propria)에서 분리하기 위해 10회 부드럽게 분쇄합니다. 그런 다음 40미크론 필터를 통해 여과하고 여과액을 깨끗한 50밀리리터 튜브에 모읍니다.

나일론 필터의 티슈를 1ml의 DPBS로 헹굽니다. 조직을 버리고 5-6ml의 여과액을 깨끗한 15ml 원추형 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 2, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 그네 물통 분리기에 있는 000 시간 g에 여과액을 회전시키십시오.

기포가 발생하지 않도록 500 마이크로리터 피펫 팁으로 펠릿을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 펠릿을 최소 1ml의 재현탁액에 함유된 신경교세포를 재현탁합니다. 마지막으로, 라미닌으로 코팅된 6웰 플레이트의 각 웰에 200마이크로리터의 세포 현탁액을 첨가하거나 신경교세포(glial growth media)를 포함하는 12웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터를 추가하여 장 신경교세포를 플레이트화합니다. 여기에서 볼 수 있듯이 장 신경교세포가 부착되지 않고 24시간 이내에 퍼지지 않으면 분취가 실패한 것으로 간주되어야 합니다.

다음은 세포 분리 및 재현탁 후 24시간 후에 장 신경교세포가 PDL 라미닌 코팅 플레이트에 패치로 부착된 우수한 prep의 대표적인 예입니다. 신경교세포의 수는 세포가 부착되어 편평한 응집체로 퍼지는 증거를 나타내는 24시간 후에 결정할 수 있습니다. 군집의 가장자리에 있는 세포는 긴 돌기를 확장하는 경향이 있으며 GFAP, S100B 및 p75NTR과 같은 고전적인 신경교 마커를 발현합니다.

이 절차에 따라 장 신경교세포 이질성에 대한 추가 질문에 답하기 위해 면역조직화학, 웨스턴 블롯, 유세포 분석 및 칼슘 플럭스 이미징과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 장 신경계를 연구하는 연구자들이 신경교세포 생물학과 그것이 생쥐의 인접 점막 및 미생물총(microbiota)에 미치는 영향, 더 나아가 인간의 영향을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.