초파리 melanogaster Larval 및 성인 두뇌의 변화 분석

이 방법은 초파리 뇌 대사에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 식이요법이나 행동이 신진대사를 변화시키는지 여부에 관계없이 신경교세포의 과잉 증식이 대사 재프로그래밍에 어떤 영향을 미치는지에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 파리의 뇌를 한 번에 하나의 뇌만 측정하여 재현 가능한 결과를 얻을 수 있는 하나의 온전한 조직으로 대사적으로 분석할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 파리 뇌의 신진대사에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 각각 상상 디스크 및 예쁜꼬마선충과 같은 다른 조직 및 모델 시스템에도 적용할 수 있습니다.

미세조직 억제를 준비하려면 보관 용기에서 측정 중인 뇌당 하나의 미세조직 억제를 선택하고 구속 전용 대조군으로 사용하기 위해 최소 3개를 선택합니다. 메쉬 바구니와 6웰 플레이트를 사용하여 70% 에탄올로 구속 장치를 헹구고 탈이온수로 매번 2분 동안 세 번 씻습니다. 구속구에서 여전히 알코올 냄새가 나면 추가 물 세척을 수행하십시오.

분석 매체에서 마이크로 조직 구속제를 세척하고 사용할 준비가 될 때까지 용액에 그대로 둡니다. Drosophila melanogaster 유충 뇌를 해부하려면 배양된 Organ R 파리의 유리병에서 후반 instar 유충을 선택합니다. 500마이크로리터의 1x PBS가 들어 있는 깨끗한 해부 스폿 플레이트의 우물에 유충을 넣습니다.

다음으로 유충을 우물에서 부드럽게 흔들어 씻고 다른 깨끗한 우물로 옮깁니다. 그런 다음 해부 현미경 아래에 스폿 플레이트를 놓습니다. 한 쌍의 핀셋으로 유충의 중간 부분을 잡고 두 번째 핀셋으로 눈 고리를 잡습니다.

두 세트의 핀셋을 사용하여 유충을 반대 방향으로 부드럽고 부드럽게 당깁니다. 일반적으로 눈 고리에 부착된 상태로 유지되고 일반적으로 눈 더듬이 디스크가 부착된 뇌를 시각화합니다. 뇌를 제자리에 고정하기 위해 눈 고리를 사용하여 추가 조직을 조심스럽게 제거합니다.

마지막으로, 뇌에서 눈 고리를 분리하십시오. 그런 다음 핀셋을 사용하여 절개된 뇌를 1x PBS가 들어 있는 새로운 우물로 옮깁니다. 절개된 뇌를 96웰 대사 분석 플레이트에 추가하려면 먼저 실험용 웰, 대조 웰, 구속 전용 웰 및 배경 웰을 포함한 모든 웰에 50마이크로리터의 분석 매체를 추가합니다.

그런 다음 각 웰에 하나의 뇌를 조심스럽게 놓습니다. 해부 현미경 아래에서 구부러진 바늘 마이크로 프로브를 사용하여 뇌를 우물 바닥까지 누릅니다. 프로브를 사용하여 뇌를 세 개의 돌출된 구체 중간에 부드럽게 배치합니다.

96웰 대사 분석 플레이트에 미세 조직 억제를 추가하려면 먼저 가장자리에 놓습니다. 현미경으로 플라스틱 링이 아래를 향하고 메쉬가 위에 오도록 방향을 잡습니다. 그런 다음 현미경에서 플레이트를 제거합니다.

핀셋을 사용하여 양쪽의 구속 장치를 잡고 우물에 부드럽게 떨어뜨립니다. 구부러진 바늘 마이크로프로브를 사용하여 구속구를 웰 안으로 누릅니다. 마이크로 조직 구속 장치는 이 기술이 의미 있는 결과를 제공하기 위해 각 우물의 중심이 있는 뇌 위에 적절하게 배치되어야 합니다.

현미경으로 절개된 뇌가 조직 구속구를 통해 보이고 우물 중앙에 있는지 확인하고 분석에 사용할 모든 우물에 대해 절차를 반복합니다. 130마이크로리터의 분석 매체를 각 실험용, 대조군 및 구속 전용 웰에 조심스럽게 추가합니다. 미디어를 추가하는 동안 뇌와 미세 조직 구속구가 움직이지 않았는지 확인합니다.

그런 다음 180마이크로리터의 분석 매체를 4개의 모서리 웰에 추가하여 배경 제어로 사용합니다. 이 절차에서는 유틸리티 플레이트를 제거하고 뚜껑이 없는 셀 플레이트를 대사 분석기에 동일한 방향으로 추가합니다. 기기가 셀 플레이트를 흡수하고 트레이를 닫은 다음 분석을 시작하도록 Load Cell Plate"를 선택합니다.

분석이 완료되면 배출된 셀 플레이트와 카트리지를 제거합니다. 해부 현미경을 사용하여 분석이 완료된 후에도 뇌와 미세 조직 구속 장치가 여전히 웰에 적절하게 배치되어 있는지 확인하고 이상이 있는 웰을 분석에서 제외합니다. 최적화된 조건을 따랐을 때, 유충 및 성체 뇌를 사용한 분석은 분석 시작 약 25분 후인 안정화된 여섯 번째 시점에서 분당 150피코몰을 약간 초과하는 OCR 판독값을 도출했습니다.

이 속도는 최소 30분에서 최대 2시간 동안 유지됩니다. ECAR은 6번째 시점에서 유충 뇌보다 성인 뇌에서 약간 낮으며 최소 30분 동안 유지됩니다. 이 발견은 성장을 지원하기 위해 유충 단계에서 해당작용이 증가하는 것에 해당합니다.

올리고마이신(Oligomycin)과 같은 미토콘드리아 억제제를 주사하면 OCR 수치가 낮아져 ATP 의존성 호흡이 드러나고, 로테논(Rotenone)과 안티마이신 A(Antimycin A)를 추가로 치료하면 OCR이 낮아져 비미토콘드리아 산소 소비량이 밝혀집니다. 이 절차를 시도하는 동안 분석을 실행하기 전과 분석 중에 뇌의 중심을 잡고 미세 조직 억제 장치가 제자리에 고정되어 있는지 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 유전자 발현이 관찰된 대사 표현형에 어떻게 기여하는지에 대한 추가 질문에 답하기 위해 정량적 PCR 및 웨스턴 블롯 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.