Investigating Mammalian Axon Regeneration: <em>In Vivo</em> Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Qiao Li; Cheng Qian; Feng-Quan Zhou

doi:10.3791/58171

성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

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Neuroscience

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Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

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06:17 min

September 1, 2018

DOI: 10.3791/58171-v

Qiao Li¹, Cheng Qian¹, Feng-Quan Zhou^1,2

¹Department of Orthopaedic Surgery,Johns Hopkins University School of Medicine, ²The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience,Johns Hopkins University School of Medicine

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study explores electroporation as an efficient method for gene delivery into adult mouse dorsal root ganglion (DRG) neurons, aimed at enhancing understanding of axon regeneration. By applying this technique in vivo, the authors establish a model for investigating mechanisms behind neuronal regeneration.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Gene delivery techniques
Axon regeneration

Background

Regeneration of axons in the peripheral nervous system is crucial for recovery from injuries.
Electroporation is hypothesized to facilitate gene expression manipulation in neurons.
This method allows simultaneous overexpression and knockdown of target genes.
Adult mouse sensory neurons serve as the biological model for this study.

Purpose of Study

To develop an in vivo gene transfection method in adult mouse DRG neurons.
To study the biological processes involved in axon regeneration.
To establish a framework for future research on PNS regeneration mechanisms.

Methods Used

The main platform used is in vivo gene delivery via electroporation.
The key biological model includes adult mouse DRGs and associated sciatic nerve.
Critical steps involve precise surgical manipulation of the iliac crest, incision, and the electroporation protocol.
Key methodological details include injecting DNA plasmids or RNA oligos and applying electric pulses to the target tissues.

Main Results

Successful electroporation resulted in fluorescence labeling of DRG neurons, enabling visualization of axon regeneration.
Distinctive trajectories and identifiable distal axon ends of regenerated axons were documented.
EGFP plasmids enabled tracking and imaging of dorsal column axons in the spinal cord.
The study provides a detailed methodology reaffirming the potential of this technique in regenerative research.

Conclusions

The study effectively demonstrates the viability of electroporation for gene manipulation in sensory neurons.
This method opens avenues for exploring gene functions relevant to peripheral nervous system regeneration.
Overall, the findings contribute valuable insights into neuronal regeneration processes and potential targets for therapeutic interventions.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of using electroporation for gene delivery?

Electroporation allows for efficient gene delivery with reduced time and labor compared to traditional methods, enabling simultaneous manipulation of gene expression.

How is the DRG model implemented in this study?

The DRG model is established through surgical exposure of the L4 and L5 ganglia, followed by direct electroporation and injection of DNA or RNA solutions.

What types of outcomes can be observed with this method?

The method yields fluorescence imaging data that allows tracking of axon regeneration and identification of changes in neuronal structure and function.

How can this technique be adapted for other studies?

The electroporation method can be adapted to other neuronal targets or gene constructs, expanding its utility in various regenerative and functional studies.

What are the key limitations of this study?

The complexity of surgical procedures and variability in individual mice responses may pose challenges in replicability and standardization of results.

Electroporation 셀에 관심사의 유전자를 전달 하는 효과적인 접근 이다. 적용 하 여이 접근에서 vivo에서 성인 마우스 지 루트 신경 절 (DRG)의 신경에, 축 삭 재생 비보를 공부 하는 모델을 설명 합니다.

이 방법은 포유류 외계 재생에 대한 향후 연구를 위해 성체 마우스 감각 뉴런의 유전자 발현을 조작하기 위한 생체 내 유전자 형질주입 기술을 제공합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 노동력과 시간이 덜 소요되고 표적 유전자를 동시에 개별적으로 과발현하고 녹다운할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 마취된 마우스의 장골능 양쪽에 미세한 마커를 표시합니다.

L5 DRG 위치를 쉽게 식별할 수 있도록 장골 능선의 두 점을 연결하는 선을 그립니다. 그런 다음 마이크로 가위로 허리 정중선을 따라 3cm 절개합니다. 그 후, L3에서 S1 가시돌기에서 근근 다열근(musculus multifidus) 및 근장 요추(musculus longissimus lumborum)와 같은 척추 주위 근육을 분리하고 L4-5 및 L5-6의 근막 관절을 노출시킵니다.

그런 다음 마이크로 룽거를 사용하여 L4-5 및 L5-6의 근막 관절을 제거합니다. 그런 다음 L4 및 L5의 왼쪽 신경궁을 제거하여 DRG의 등쪽을 노출시킵니다. DRG 주입의 경우 DNA 플라스미드 또는 RNA 올리고를 유리 모세관 피펫에 로드합니다.

그런 다음 모세관 유리 피펫의 끝을 DRG에 조심스럽게 삽입하고 세포 내 마이크로 주입 디스펜싱 시스템을 사용하여 DNA 플라스미드 또는 RNA 올리고 용액 1마이크로리터를 점차적으로 주입합니다. electroporation를 위해, 전극을 가진 표적 DRG를 온화하게 꼬집고, electroporation 체계로 5개의 정연한 전기 펄스를 적용하십시오. 그런 다음 근육을 닫은 다음 나일론 봉합사로 피부 층을 닫습니다.

DRG 전기천공술 2-3일 후 마우스를 복강내로 마취하고 코르크 보드에 팔다리를 테이프로 붙인 다음 정중선을 따라 왼쪽으로 0.5cm 떨어진 곳에 1cm 절개를 만듭니다. 다음으로 대둔근, 이상근 등의 근육을 세로로 자릅니다. 그런 다음 더 큰 좌골 구멍과 좌골 노치 사이의 좌골 신경 분절을 노출시킵니다.

미세 수술 겸자로 12초 동안 신경을 부수고 나일론 표피 신경 봉합사로 으깬 부위를 표시합니다. 그 후, 나일론 봉합사로 근육과 피부층을 닫는다. 풍부 한 후에는 해부 현미경 아래에서 마이크로 가위와 마이크로 집게를 사용하여 신경근 및 좌골 신경과 함께 DRG를 조심스럽게 분리합니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 4% PFA로 좌골 신경을 직접 전달합니다. 해부 현미경으로 형광 표지된 감각 축삭을 이미지화하고 측정하려면 미세 가위와 마이크로 집게로 고정된 좌골 신경에 부착된 조직과 막을 조심스럽게 벗겨냅니다. 그런 다음 PVS로 신경을 세 번 씻는다.

다음으로, 좌골 신경을 슬라이드에 놓고 똑바로 유지한다. 신경 주위에 80마이크로리터의 퇴색 방지 용액을 추가한 다음 그 위에 커버 슬립을 놓습니다. 장착된 조직 전체를 압력으로 평평하게 만듭니다.

그런 다음 편평한 조직을 모자이크 획득 및 이미지 처리를 위한 액세서리가 장착된 도립 형광 현미경 아래에 놓습니다. 재생된 축삭돌기의 길이를 측정할 때, 분쇄 부위에서 원위 축삭 말단까지 좌골 신경에서 식별 가능한 모든 형광 표지된 축삭돌기를 추적합니다. 축삭 재생을 연구하기 위해 현재의 생체 내 전기천공법(in-vivo electroporation)을 적용할 때 좌골 신경을 평평하게 하고 이미지화했습니다.

독특한 궤적과 알아볼 수 있는 원위 축삭 끝을 가진 모든 재생된 축삭돌기는 봉합사 매듭으로 표시된 분쇄 부위에서 추적할 수 있습니다. 흰색 화살촉, 화살표 및 별은 세 개의 독특한 축삭 끝을 나타내며 모두 분쇄 부위에서 확장됩니다. 또한, DRG는 EGFP 플라스미드로 전기천공되고 척수를 적출했습니다.

척수에 있는 EGFP로 표지된 등쪽 기둥 축삭돌기는 세로 및 시상 돌출 이미지 모두에서 이미지화되고 식별되었습니다. 다음은 등쪽 기둥의 축삭돌기에 대한 자세한 보기이고 다음은 등쪽 뿌리 진입 영역의 축삭돌기에 대한 자세한 보기입니다. 이 이미지는 등쪽 기둥 내에서 EGFP 표지된 축삭돌기의 시상 투영을 보여줍니다.

또는 현미경 시각화 소프트웨어로 컨포칼 이미지를 처리하여 3D 이미지를 재구성할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 L4 및 L5 DRG를 올바르게 배치하고, 좌골 신경을 찌르지 않고 경막막에 매듭을 짓고, 크러시 부위에 봉합사 매듭을 붙이는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 축삭 재생 분야의 연구자들이 PNS, 자연 축삭 재생에 필요한 유전자 또는 성체 마우스의 생체 내 재생을 더욱 촉진할 수 있는 유전자를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

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