분광학 그리고 스캐닝 전자 현미경 검사 법에 의해 섬유 소 혈전 구조에 β 아 밀 로이드 유도 비정상의 분석
2018년 11월 30일
여기에 제시 된 분석 섬유 소 혈전 구조에 베타-아 밀 로이드의 효과 개별적으로 또는 조합에서 사용할 수 있는 두 가지 방법이 있습니다. 생체 외에서 섬유 소 혈전, 만드는 뒤에 병 탁도 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법 방법 포함 된 프로토콜이입니다.
이 플레이트 기반 탁도 분석의 주요 장점은 빠르며 정교한 설정이나 요구 사항없이 여러 아밀로이드 베타 피브리노겐 상호 작용 억제제를 한 번에 선별 할 수 있다는 것입니다. 피브린 탁도 분석에 있는 헤드 화합물은 전자 현미경 검사를 스캔하여 분석된 피브린 혈전에서 A-베타 유도 된 구조적 이상을 복원하는 능력에 대해 더욱 평가될 수 있다. 전자 현미경 분석을 스캔하기 위한 혈전 제제의 시각적 데모는 제제의 모든 변화가 실험 결과 내의 변화에 기여할 수 있기 때문에 매우 중요합니다.
이 데모의 초점은 A-베타 피브리노겐 상호 작용에 있습니다. 이 프로토콜은 다른 단백질및 피브린 응고와의 화합물과의 다른 상호 작용을 분석하기 위해 쉽게 변형될 수 있다. 먼저 200마이크로리터의 응고 형성 버퍼에 갓 준비된 피브리노겐 1.5 마이크로몰라를 각 A-베타 네거티브(42)에 첨가하여 우물을 포함하고 제어하고 실온에서 회전 플랫폼에서 플레이트를 배양한다.
30분 후, 30분 동안 새로 준비된 트롬빈 용액 30마이크로리터를 피브리노겐 함유 의 중앙에 직접 추가하여 혈전 형성을 시작하고 즉시 350나노미터에서 체외 혈전의 흡수를 판독하여 10분 동안 30~60초마다 측정을 반복합니다. 피브린 응고 구조에 대한 A-베타 피브리노겐 상호 작용 억제제의 효과를 평가하기 위해 먼저 집게를 사용하여 12웰 플레이트의 개별 우물에 12mm 실리콘 유리 원 덮개 를 넣고 80 마이크로리터의 피브리노겐을 각 커버 슬립에 부드럽게 추가하여 용액을 균등하게 분산시합니다. 혈전 형성을 시작하기 위해 각 웰에 20 마이크로리터의 혈전 용액을 추가합니다.
실온에서 30~60분 동안 배양한 다음, 각 응고를 2밀리리터의 얼음냉나트륨 소염 버퍼에 2밀리리터로 부드럽게 담근 다음, 실온에서 두 번, 1밀리리터 파이펫을 사용하여 각 세척 후 버퍼를 조심스럽게 제거합니다. 마지막 세척 후, 커버 슬립에 응고 형성의 상태를 확인하고 30 분 동안 얼음에 얼음 차가운 2 % 글루타랄데히드의 2 ~ 3 밀리리터에 혈전을 수정합니다. 인큐베이션이 끝나면 각 우물에서 글루타랄데히드를 부드럽게 제거하고 얼음위에서 보여준 것처럼 신선한 나트륨 캐코디레이트 버퍼로 혈전을 씻습니다.
공기 노출로부터 응고를 보호하기 위해 워시 사이에 에탄올을 완전히 제거하지 않고 얼음 에탄올을 완전히 제거하지 않고 얼음에 5분 짜리 얼음 차가운 에탄올 의 등급 시리즈에서 고정 된 혈전을 수화한다. 마지막 100% 에탄올 세척 중에 커버 슬립을 임계 점 건조기 샘플 홀더로 옮기고 각 커버 슬립 사이에 적어도 1 개의 와셔를 배치하고 홀더를 에탄올로 채워진 임계 점 건조기 챔버에 놓습니다. 30분간의 건조 주기 후에는 카본 테이프를 사용하여 개별 스캐닝 전자 현미경 스텁에 커버 슬립을 장착하고 샘플을 진공 스퍼터 코팅 소터의 스퍼터 코팅 챔버로 옮기십시오.
그런 다음 초당 4개의 협스트롬에서 25초 동안 20나노미터 미만의 금 팔라듐 또는 기타 전도성 물질에 스퍼터 코트를 코팅하고 4킬로볼트에서 2형 이차 전자 검출기를 장착한 스캐닝 전자 현미경의 샘플을 이미지화한다. 피브린 응고 형성은 용액을 통과하는 빛의 산란을 일으켜 판독 기간이 끝날 때 고원도가 증가합니다. Fibrinogen이 A-베타(42)의 존재에서 배양되면 용액의 탁도가 감소하며 곡선은 피브리노겐의 약 절반높이에 도달한다.
A-베타 42 상호 작용 차단제의 존재에서 베타 아밀로이드의 효과는 개량되고 탁도는 혼자 A-베타와 그보다 높다. 차단기의 효과는 A-베타가 없을 때 화합물이 피브린 응고 탁도를 변경하지 않기 때문에 배경 탁도로 인해 나타나지 않습니다. 또한, 피브린 중합화를 방해하는 것으로 알려진 펩티드인 GPRP의 존재내 응고 형성은 억제제의 부재 시 피브린 응고 형성에 비해 현저히 감소된 탁도를 나타낸다.
혈전과 염화칼슘이 존재하여 생성된 피브리노겐은 피브린의 길쭉하고 상호 연관된 실과 더 큰 번들로만 피브린 메쉬를 형성합니다. A-베타가 존재할 때, 피브린 스레드는 골재에 여러 끈적끈적한 덩어리로 얇아졌고, 이는 A-베타 유도된 구조적 이상을 나타냅니다. 탁도 분석 결과와 일치하여, A-베타 피브리노겐 상호 작용 차단제의 존재내 응고 형성은 이 치료법으로 더 적은 덩어리가 관찰됨에 따라 A-베타 유도 된 변화로부터 피브린 응고의 구조를 부분적으로 복원한다.
응고 탁도 분석 및 스캐닝 전자 현미경 분석 프로토콜은 여러 A-베타 피브리노겐 상호 작용 억제제를 빠르고 재현 가능한 방식으로 평가하기 위해 최적화되었습니다. 그리고 곧 데이터는 시험관 내 및 생체 내 의 추가 연구에 적용 될 수있는 피브린 응고 형성에 대한 귀중한 정보를 제공 할 것입니다.
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개요
본 논문은 in vitro 피브린 응고 프로토콜과 응고 탁도 및 주사 전자 현미경 분석법을 포함하여, 베타-아밀로이드가 피브린 응고 구조에 미치는 영향을 분석하는 방법을 제시합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생화학
- 세포생물학
배경
- 베타-아밀로이드는 신경퇴행성 질환과 관련이 있습니다.
- 피브린 응고물은 다양한 생물학적 과정에서 역할을 합니다.
- 피브린 응고물 구조를 이해하면 질병 기전에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
- 이전 연구들은 A-beta로 인한 피브린 응고물의 구조적 이상을 보여주었습니다.
연구 목적
- 베타-아밀로이드가 피브린 혈전 구조에 미치는 영향을 평가합니다.
- 아밀로이드-베타와 피브리노겐 상호작용의 억제제를 스크리닝합니다.
- 주사 전자 현미경 분석을 위한 혈전 표본 준비 과정을 시연합니다.
사용된 방법
- 빠른 스크리닝을 위한 플레이트 기반 탁도 분석법.
- 피브리노겐을 이용한 인 비트로(in vitro) 피브린 응고물 제조.
- 응고물 구조 분석을 위한 주사 전자 현미경 관찰.
- 다른 단백질 상호작용 연구를 위한 프로토콜 수정.
주요 결과
- 구조적 무결성을 회복시키는 헤드 화합물의 식별.
- 일관성을 위해 혈전 준비 과정의 시각적 시연이 매우 중요함.
- 준비 과정의 차이가 실험 결과에 영향을 줄 수 있음.
- 단백질 상호작용 연구에서의 광범위한 응용 가능성.
결론
- 제시된 방법들은 피브린 응고물 구조를 분석하는 데 효과적입니다.
- 억제제 스크리닝은 치료 전략에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.
- 추후 연구를 통해 다른 단백질 간의 상호작용을 확장하여 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
본 프로토콜은 플레이트 기반의 탁도 측정법(turbidity assay)을 사용하여 아밀로이드-베타-피브리노겐 상호작용 억제제를 신속하고 재현성 있게 스크리닝할 수 있게 하며, 이는 알츠하이머병 치료제 개발의 초기 단계 타겟 검증을 지원합니다. 이 방법은 정량적인 혈전 형성 데이터와 주사 전자 현미경(SEM)을 통한 구조적 확인을 제공하여, A-beta 유도 피브린 혈전 이상을 개선하는 화합물의 hit-to-lead 진행을 촉진합니다. 탁도 판독 결과와 SEM 이미징을 통합함으로써, 이 접근 방식은 신경혈관 타겟 발굴 프로그램에 대해 기전적 리스크 감소와 예측 신뢰도를 제공합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: A-beta-피브리노겐 상호작용이 알츠하이머병의 병리적 혈전 형성을 유도한다는 치료 가설을 검증합니다.
- 운영적 가치: A-beta-피브리노겐 결합 억제의 직접적인 판독값으로 혈전 혼탁도를 측정함으로써 기능적 타겟 검증을 가능하게 합니다.
- 예측적 가치: 정상적인 피브린 혈전 구조를 복원하는 화합물을 식별하여 타겟 결합 및 생물학적 리스크 감소를 나타냄으로써 포트폴리오 우선순위 결정을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 최적화된 탁도 분석법은 신속하고 재현성이 높으며, 대규모 화합물 라이브러리 스크리닝을 위한 멀티웰 플레이트 형식과 호환됩니다.
- 정량적 결과: 시간에 따른 350 nm에서의 흡광도를 측정하여, 억제제의 효능을 배경 효과와 구분할 수 있는 혈전 형성 동역학 데이터를 제공합니다.
- 구조적 확인: 탁도 스크리닝에서 도출된 히트 화합물은 SEM을 사용하여 피브린 혈전 구조의 복원 여부를 시각화함으로써 검증하며, 이를 통해 히트 화합물이 분석상의 아티팩트가 아님을 보장합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련성: A-beta를 미세경색 및 뇌 아밀로이드 혈관병증과 관련된 피브린 혈전 이상과 연결함으로써 알츠하이머 병리의 뇌혈관 메커니즘을 모델링합니다.
- 중개 연구의 연속성: 인 비트로(in vitro) 표적 결합(탁도)을 표현형 혈전 구조(SEM)와 연결하여, 인 비보(in vivo) 검증 전 기전적 리스크 감소를 지원합니다.
- 위험 조정 추진: 혈전 형성 지연 억제와 구조적 이상 역전이라는 두 가지 기준을 바탕으로 go/no-go 결정을 가능하게 합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 방법은 초기 발굴 단계의 연속 과정에 적합하며, 약물 표적이 될 수 있는 A-beta-fibrinogen 상호작용에 대한 가설 검증을 가능하게 하여, 그 결과가 선도물질 도출 및 전임상 검증 워크플로우로 이어지도록 합니다.
- 발견 생물학: A-beta가 피브린 혈전의 탁도와 구조를 어떻게 변화시키는지 정량화하여 가설 검증을 지원하며, 신경혈관 기능 장애의 경로 관여도를 명확히 합니다.
- 스크리닝: 96-웰 플레이트 형식에서 A-beta-피브리노겐 상호작용 억제제를 고속 대량으로 평가할 수 있도록 분석 준비도와 재현성을 제공합니다.
- 분석: 화합물이 혈전 형성 및 구조에 미치는 영향에 대해 비교 분석이 가능하도록 탁도 역학 및 SEM 기반의 구조적 지표를 제공합니다.
- 중개 연구: 표적 억제와 표현형적 혈전 복구를 연결하여, 신경혈관 알츠하이머 모델의 전임상 연속성과 일치시킵니다.
- 기업적 재사용: 탁도-SEM 워크플로우는 A-beta 외의 다른 단백질-피브리노겐 상호작용에도 적용 가능한 재사용 가능한 플랫폼으로, 광범위한 표적 검증 노력을 지원합니다.
운영 및 기업적 영향
- 과학적 가치: 생화학적 억제와 구조적 혈전 회복을 연계함으로써 예측 신뢰도를 제공하며, 표적 검증 시의 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 최적화된 혈전 준비, 세척, 고정 및 이미징 프로토콜을 통해 표준화와 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 기능적(탁도) 검증과 구조적(SEM) 검증을 모두 요구함으로써 go/no-go 결정의 질을 향상시키고, 후기 단계의 생물학적 리스크를 감소시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 혈전 형성 지연과 구조적 병변의 이중 교정을 입증하는 억제제에 대해 리스크 조정 우선순위 설정이 가능해집니다.
실행 시 고려 사항
- 단백질 준비, 혈전 형성 분석 및 주사전자현미경(SEM) 시료 준비에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 350 nm에서 Kinetic 흡광도 측정이 가능한 플레이트 리더와 SEM 이미징 기능이 있는 진공 스퍼터 코터의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- SEM 해석을 방해할 수 있는 구조적 아티팩트를 방지하기 위해 혈전 고정, 탈수 및 건조 단계의 표준화가 필수적입니다.
- 본 프로토콜을 다른 단백질-피브리노겐 상호작용으로 확장할 때, 특히 완충액 조성과 배양 시간 등의 적응 고려 사항이 포함됩니다.
- 신선한 시약 준비의 필요성과 공기 노출 또는 불일치한 세척으로 인한 혈전 가변성을 방지하기 위한 세심한 취급과 같은 실질적인 제한 사항이 포함됩니다.
