재현할 수 dsRNA Microinjection 및 산란 검정 집 파리 모기에

이 프로토콜 우리가 표준화 하 고 몇 년 동안 모기와 집 파리의 hemolymph를 직접 핵 산의 특정 수량을 제공 하는 데 사용 하는 microinjection 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 최소 주입 죽음 귀착되 고 통치의 복용량 상관 측정을 허용 한다.

이 방법은 이중 가닥 RNA의 충격 유전자 발현, 성인 디프테리언의 fecundity와 같은 생체 농약 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이중 가닥 RNA의 정량화 가능한 용량이 모기 또는 비행으로 전달되고, 그 결과 다세대 치사에 대한 결과적인 영향을 평가할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 모기, aedes aegypti, 그리고 집 비행, musca 국도에 대 한 제시, 그것은 또한 모기와 파리의 다른 종에 적용할 수 있습니다.

일반적으로, 이 방법에 새로운 개인 투쟁 할 것 이다, 주입 절차 자체를 마스터 하는 것은 시간 투자 이기 때문에. 최적의 바늘 팁 크기로 각 곤충을 주입하는 것은 부상과 사망률을 최소화하면서 전달을 보장하는 데 중요합니다. 시작하려면 집게를 사용하여 모기를 조심스럽게 무대에 올리기 위해 결국 현미경 슬라이드에 약 반 센티미터 떨어져 노출됩니다.

슬라이드 핸들링을 돕기 위해 슬라이드의 왼쪽 또는 오른쪽 끝에 1센티미터 반 센티미터 의 공간을 둡니다. 그런 다음 준비된 곤충의 슬라이드를 섭씨 4도에 큰 페트리 접시에 놓습니다. 냉각 테이블에 해부 현미경 및 현미경 주입기를 설정합니다.

유리 모세 혈관을 미세 한 팁으로 당긴 후 모세 혈관 바늘을 마이크로 인젝터에 넣고 집게로 바늘 끝을 부러 놓습니다. 그런 다음 뉴클레아제 자유 수를 세 번 끌어올려 추방하여 바늘을 헹구는 다. 유리 바늘 개구부 크기는 모기와 집 파리마다 다릅니다.

다음으로, 모기에 대한 적절한 농도로 주사 용액을 준비합니다. 로다민 B의 밀리리터당 3마이크로그램을 솔루션에 추가하여 시각화를 돕습니다. 파이펫을 사용하여 3~4개의 마이크로리터의 용액을 깨끗한 표면으로 옮기고 공기를 마시지 않고 유리 바늘에 그립니다.

액체가 바늘에서 분배되기 시작할 때까지 주입 버튼을 반복적으로 누를 수 있습니다. 액체 반월 상 연골에서 바늘 생크에 이르기까지 약 1 밀리미터 떨어져 해시 마크를 그릴 수있는 초미세 포인트 마커를 사용합니다. 바늘 아래에 모기의 슬라이드를 설정하고 시야가 바늘의 용액 반월 상 연골을 볼 수있을만큼 넓다는 것을 확인합니다.

바늘을 중견수 흉골의 1/3에 바늘을 정렬합니다. 모기의 반대편에 집게를 놓고 바늘에 모기를 중괄호하고 바늘 끝으로 큐티클을 부드럽게 뚫습니다. 팁이 미드라인을 통과할 때까지 바늘을 모기에 부드럽게 밀어 넣습니다.

원하는 양의 액체가 주입될 때까지 주입 버튼을 누르세요. 반월 상 연골이 움직이지 않으면 모기를 천천히 밀어 내거나 반월 상 연골 운동을 보면서 바늘을 날아 갑니다. 주입된 용액의 일부가 바늘 제거 시 큐티클에서 구슬을 꺼내거나 반월상연상 연골이 움직이지 못하는 경우, 주사가 성공하지 못함에 따라 곤충을 폐기한다.

집 비행에, 메소 플러론에 바늘을 정렬합니다. 플라이의 반대편에 집게를 놓고 바늘에 대고 날아다니는 중괄호를 부드럽게 바늘 끝으로 구멍을 뚫습니다. 주입된 곤충을 10~15개의 그룹으로 3.5온스의 보유 컵을 치우도록 이송합니다.

그런 다음 컵을 그물로 덮고 실온에서 회복할 수 있도록 합니다. 곤충이 회복된 후, 10% 자당용에 담근 면공 위에 들고 있는 컵을 반전시다. 먼저 12인치 인공 멤브레인을 신선한 피로 채우고 온수 욕조에서 섭씨 60도까지 가열합니다.

종이 타월로 멤브레인을 말리고, 들고 있는 컵의 그물 뚜껑을 가로질러 놓습니다. 모기가 먹이를 주고 면공을 교체하고 모기가 24시간 동안 쉬도록 합니다. 다음으로, 약 30밀리미터의 탈온수로 3.5 온스의 바이오 아세테이트 컵을 채우면 oviposition 컵을 시공하십시오.

그런 다음 컵 바닥에 씨앗 발아 용지 조각을 놓습니다. 컵을 그물로 덮고 그물 뚜껑에 작은 슬릿을 자른다. 먹이기 24시간 후, 홀딩 컵의 캡에 작은 슬릿을 자르고 성공적으로 oviposition 컵에 공급 된 여성을 전송합니다.

그런 다음 10 % 자당 포화 면 공으로 oviposition 캡에 작은 슬릿을 밀봉합니다. 모기를 모니터링하고 매일 사망률을 추적합니다. 모기가 5~7일 동안 배란을 허용한 후, 해부 현미경으로 계란을 세게 한다.

절차를 보여주는 것은 박사 크리스토퍼 게덴, USDA ARS 연구 곤충학자가 될 것입니다. 주입 후 3 일, 이산화탄소로 파리를 마취. 그런 다음 파리를 물과 준비된 플라이 다이어트로 깨끗한 케이지로 옮기습니다.

사망률 데이터를 기록하고 매일 죽은 파리를 제거합니다. 다음으로, 75%의 밀 밀 밀기울과 25%의 펠트 라이브 스톡 피드를 무게별로 혼합하여 애벌레 사육 매체를 준비합니다. 62%의 수분이 달성될 때까지 혼합물에 물을 넣습니다.

촉촉한 밀 밀 밀 기울기를 검은 천 사각형에 넣고 공에 굴려 넣습니다. 고무 밴드를 사용하여 천을 제자리에 고정하고 액체 매체가 스며들어나갈 때까지 부드럽게 짜냅니다. 공을 60 밀리리터 컵에 넣고 5시간 동안 플라이 케이지에 놓습니다.

그 후, 공에서 계란을 헹구어 천의 주름 아래에서 계란을 제거합니다. 계란을 흔들어 클러스터를 방해하고 졸업 한 20 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮습니다. 계란이 정착하도록 허용하고 튜브에 정착 한 계란의 양을 주의하십시오.

그런 다음 충분한 물을 추가하여 정착된 계란의 20배에 달하는 부피를 가져옵니다. 다음으로 마그네틱 스터드 바를 사용하여 물과 달걀 서스펜션을 혼합합니다. 마지막으로 수정된 파이펫 팁을 사용하여 서스펜션의 0.5 밀리리터를 일련의 선으로 미리 촉촉한 검은 천 조각에 분배합니다.

이 프로토콜에서, 여성 모기는 유전자 발현을 평가하기 위하여 마이크로 주입되었습니다. 이중 가닥 RNA를 가진 암컷을 주입하는 것은 다중 oviposition 주기에 걸쳐 상대적인 발현에 있는 유의한 감소를 보여주었습니다. 첫 번째 고노트로픽 사이클에서 모기의 평균 클러치 크기는 dsRPS6 및 dsRPL26 치료 그룹 모두에 대해 크게 감소하였다.

명백한 복용량 효과 dsRPS6를 1 마이크로 그램에서 50 여성 모기에 나노 그램을 주입 할 때 클러치 크기에서 관찰 되었다. 집 파리는 또한 이중 가닥 RNA 구조물의 5 마이크로그램으로 주입되었습니다. 모기 관찰과 유사하게, 특정 성적증명서 발현과 클러치 크기 모두에서 현저한 감소가 지적되었다.

이 절차를 시도하는 동안 성공적으로 주입되지 않은 곤충을 버리는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차를 사용하여, 임의의 이중 가닥 RNA 구조 또는 기타 생물학적 이성적인 모기 또는 파리에 전달될 수 있다. 유리 바늘로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 항상 적절한 날카로운 폐기물 용기에 폐기되어야한다는 것을 잊지 마십시오.