Name: 고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 배우세요 고급 폐 유도 빛 시트 현미경을 활용한 알레르기 염증 마우스 모델에서 인간 림프구 이미징 방법을. 이 기술은 T 세포 폐 조직 유입 연구와 염증성 폐 질환 치료 표적 발굴에 활용됩니다.

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저자는 기꺼이 DFG 공동 연구 센터 SFB 1181 TRR 241에 의해 자금을 인정 합니다. 광학 이미징 센터 에를랑겐 (OICE) 특정 랄 프 사노, 필립 Tripal, 티 나 Fraaß (DFG CRC 1181의 프로젝트 Z2) 빛 시트 형광 현미경 이미징에 대 한 전문 기술 지원에 대 한 인정.

M.F. Neurath 펜탁스, 줄리아니, MSD, Abbvie, 얀 센, 다케다와 Boehringer 고문 역임 했다. 나머지 작가 팬 들은 어떤 충돌의 정보를 공개 하지 않습니다.

여기 설명된 실험 설정 제공 고전적인 vivo에서 염증 성 조건 및 그로 인하여 relevantly 보완 기본 인간의 면역 세포의 유도 폐 용량을 모니터링 하는 기회가 chemotaxis를 수행 하는 생체 접착 분석 실험입니다. 폐의 계정 특정 해부학 기관 특성 고려, 임상 관련성 및 수집 된 데이터의 양도 (를 포함 하 여 대상 기관 안에 chemotaxis 및 셀 유통) 귀환 하는 면역 세포의 중요 한 측면 우리 했다 3 기술적인 주요 기능: (1) 분석 murine 생명체; 내 기본 인간 세포의 (2) papain 중재 유도의 폐 염증; 그리고 삭제 된 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (3).
비록의 기능 연구는 adoptively 인간의 전송 살아있는 murine 유기 체 내의 면역 세포 상호 작용 수용 체 ligand-쥐와 남자, 일반적인 개념 사이에서 잠재적으로 관련 된 비 호환성으로 인해 몇 가지 측면에서 ...

알레르기 천식 등 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐의 고전적인 염증 성 질환으로 폐 조직1,2활성화 된 림프 톨의 증가 채용에 의해 구동 잘 알려져 있습니다. 림프 구 출시 cytokines (예를 들어, 일리노이-4, IL-5, 일리노이-9, IL-13, TNF-α와 IFN-γ) 더 타고 난 및 적응형 면역 세포의 chemotaxis를 홍보, 거리 기도 개장을 유도 하거나 직접 폐 실질2손상. 지금까지, 폐 조직 내에서 세포의 병 적인 축적에 대 한 책임 기본 메커니즘은 아직 완전히 이해 되지. 조직 선택적 T 세포 각 인 그리고 피부 본질적인 유도 대 한 설명에 비유, 폐 모 수석 세포 (DCs)는 분명히에 적어도 분할 CCR4 식의 유도 통해 우선 폐 침투에 대 한 주변 T 세포를 수는 림프 톨3의 표면입니다. CCR4, 외 기도 침투 T 세포는 CCR5와 CXCR3 주변 혈액1,,45내의 T 세포에 비해 chemokine 수용 체의 증가 특히 식 또한 특징. 전반적으로, 기존 데이터 폐 유도 생리 또는 염증 성 조건에서 T 세포의 다른 chemokine 수용 체와 그들의 각각 ligands의 수를 포함 하 고 따라서 결정적으로 의존 개념와 일치 하는 밀접 하 게 타고 난 및 적응형 면역 세포1간의 협업을 제어. 특히, 병원 체 또는 알레르기에 노출의 초기 단계, 타고 난 면역 계통의 세포 응답 TLR 자극 또는 LTB4, CCL1, CCL17, 같은 다른 chemoattractants의 즉각적인 석방 cross-linking IgE 중재 PGD, CXCL10, CCL20, CCL2221,,67. 대표적인 사례로 PGD2 와 chemoattractant 수용 체 간의 상호 작용 CRTh2 Th2 세포의 chemotaxis에 대 한 특정 중요성의 것으로 알려져 있다 하 고 따라서 나타났다 천식의 임상 관리에 유망 치료 대상. 실제로, 온건한 천식 환자 증상의 개선 및 치료 후 1 초 (FEV1)에서 강제로 내쉬는 숨의 볼륨의 상당한 증가와 보여주었다 위약 그룹8 에 비해 선택적 CRTh2 길 항 9. 염증 반응의 더 진행된 상태에서 이미 채용된 T 세포 폐 림프 구 축적 발표를 통해 IL-4, IL-13의 강력한 자극으로 폐 Dc에 대 한 증폭 수 있습니다. 그 후, 이러한 골수성 파생 된 타고 난 셀 최대-규제 STAT6 종속 방식으로1,,1011CCL17 및 CCL22의 표현.  있지만 설명된 시나리오의 복잡성은 여전히 귀환 T 세포 폐의 완전 한 이해를 방해, 염증 또는 알레르기 성 폐 질환의 잠재적으로 최적화 된 치료 제어를 위한 분자 대상의 과다를 제공 합니다. 따라서, 기술의 혁신적인 실험, 더 깊게 T 셀 chemotaxis 및 폐 유도의 분야에서 우리의 지식을 보완 하는 긴급 한 필요가 있다.
사실은 폐 유도 인체 내에서 세포의 여러 세포, 체액 및 물리적 매개 변수1에 의해 영향을 받습니다, 대부분 기존 실험 방법의 면역학 프로세스의 전체 복잡성을 모델링 할 수 없습니다. 대신, 림프 구 매력, 접착, 마이그레이션 및 보존 캐스케이드에 관련 된 특정 측면에 초점을 선택적으로 귀환 하는 폐의 분석에 대 한 많은 표준 프로토콜. 주변 또는 폐에 침투 림프 톨에 integrins 및 chemokine 수용 체의 mRNA 나 단백질 식 패턴의 혈액, 각각 chemokine 수준 보완 측정의 순전히 설명 결정 외 bronchoalveolar 게 (발) 또는 폐 조직12,13,,1415, 잘 설립 체 외 세포 문화 분석 허용 림프 구 접착 또는 chemotaxis의 기능 특성 따라 실험 조건16,,1718정의. 원칙적으로, 정적 생체 접착 분석 표준 생체 외에서 하는 동안 교양된 세포는 내 피 단층 또는 재조합 형 내 피 접착 분자 (MAdCAM-1, VCAM-1), 코팅 유리 슬라이드의 바인딩 용량 모니터링 chemotaxis 분석 실험 수 세포의 chemokine 그라데이션 transwell 시스템19에 따라 마이그레이션할 계량 하기 위해 일반적으로 적용 됩니다. 둘 다 생체 외에서 설정을 제어 조정 및 실험 조건, 변조 있지만 비판적 vivo에서 chemotaxis와 세포의 접착에 미치는 영향에 알려진 중요 한 변수를 다른 한편으로 부족. 정적 셀 문화 분석 실험19 영구 혈액 흐름 의해 발생 하는 전단 세력의 영향을 무시 하 고 잠재적으로 면역 주변 환경 및 비 림프 구 면역 세포 상호 작용의 개입을 무시 하는 주로, 둘 다 살아있는 유기 체에. 이러한 한계를 극복 하기 위해 정적 생체 외에서 또는 준수 chemotaxis 분석 실험에서 얻은 결과의 해석 추가 동적 접착 실험 흐름 조건20,21 에서 고에 유효성 검사에 필요한 염증 성 장기 병 리19의 vivo 모델. 실제로, 중요 한 동물 연구에서 T 세포 폐 염증 또는 알레르기 성 조건 하에서 귀환의 규제에 관한 결론을 얻을 수 수 유전자 분석 수정 다른 폐 질환3, 의 정의 된 모델에서 마우스 22 , 23. 대 한 관심의 특정 유전자 나타냅니다 특정 세포의 영향을 정의 하기 위한 확고 하 고 광범위 하 게 사용 도구 wildtype 쥐와 쥐 결핍과 세포를 침투 하는 폐의 양적 비교 경로 또는 T 세포 분포의 질병 제어 패턴에 수용 체. 그러나, 달리 생체 외 세포 문화 분석, 논의 하기 전에 클래식 동물 모델에 따라 연구 설계 능력이 없다 분석 하 고 기본 인간 T 세포 혈액 또는 염증 성 폐에서 고통 받는 환자의 발에서 직접 파생 된 모니터링 질병입니다. 따라서, 그것은 여전히 기능 진단 지정 된 폐 질환은 우선 폐 차 있는 굴곡 운동 그리고 얼마나 멀리 임상 매개 변수 영향을 줄 수이 시나리오에 대 한 인간의 세포 간 기 수를 확인 하기 위해 도전 남아 있습니다. 최근, 매우 우아한 vivo에서 접근 대부분의 이러한 한계를 극복할 수 있었던 고 창 자 림프 톨 귀환24에 고급 변환 연구를 위한 새로운도 열 선 동적인 장 질병 (IBD)의 맥락에서 소개 되었다 . 용 매 기반 조직 비운 뒤에 강력한 이미징 도구로 횡단면 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 대 한 프로토콜을 이용 침투 및 adoptively 전송된 인간 T 세포의 분포를 시각화 가능 했다 colitic immunodeficient 마우스24의 소장. 특히,이 실험 설정 두 가지 주요 혁신 구현: 실험적으로 정의 된 vivo에서 조건; (1) 기본 인간의 면역 세포를 분석할 수 있습니다 (2) 병에 걸리는 기관의 오히려 큰 영역 (약 1.5 c m x 1.5 c m) 고해상도 품질, 3D 개조 뒤에 몇 군데 있습니다. 또한, 여러 최근 연구 성공적으로 설립 용 매 기반 조직 삭제 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 고급 폐25,26이미징에 대 한 중요 한 도구. 폐 면역학의 분야에서이 기술 진보에서 혜택, 우리는 지금 폐 유도의 분석을 위한 시스템을 채택 했다.
여기 제시 프로토콜 정화 방법과 붙일 레이블에 기본 인간 T 세포 유도 폐 염증와 쥐에 전송에 대 한, 또한, 빛 시트의 후속 과정 자세히 설명 단계별 소개를 제공 합니다. 기관 준비 및 이미지 처리를 포함 하 여 형광 현미경 이미지입니다. 전반적으로, 정교한 모니터링 vivo에서 조건에 따라 인간 림프 구 폐 유도 역시 가능한, 실험 모델만 도입 하 여 염증 또는 알레르기 성 폐 질환의 분야에서 미래의 변환 연구를 지원 하기 위해 노력 하겠습니다.

<table><tbody><tr><td>Agarose NEEO Ultra</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>2267.4</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFlour594 anti-human CD45</td><td>antibody BioLegend, San Diego, USA</td><td>304060</td><td></td></tr><tr><td>염화암모늄</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>K2981</td><td></td></tr><tr><td>Cannula 21 G</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>세포 증식 염료 eflour670</td><td>eBioscience Inc., San Diego, USA</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>CD4 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium-EDTA 혈액 수집 튜브, 9 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, 독일</td><td>21066001</td><td></td></tr><tr><td>Ethly cinnamate (ECi)</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td><td>112372-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol &ge; 99.5% (EtOH)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>5054.3</td><td></td></tr><tr><td>FBS (fetal bovine serum) Good Forte</td><td>PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany</td><td>P40-47500</td><td></td></tr><tr><td>Filter 100 &micro; 엠&nbsp;</td><td>VWR International Germany GmbH, 다름슈타트, 독일</td><td>732-2758</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Image Analysis Software 9.0.2</td><td>Bitplane AG, Zurich, Switzerland</td><td>n.a.ImspectorPro</td><td></td></tr> <tr><td>software</td><td>Abberior Instruments GmbH, G&ouml; 팅겐, 독일</td><td>n.a.Ketamin</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany</td><td>3617KET-V</td><td></td></tr><tr><td>LaVision UltraMicroscope II</td><td>LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany</td><td>n.a.MACS</td><td></td></tr> <tr><td>MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>멀티플라이 캐뉼라 20 G</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, 독일</td><td>851638035</td><td></td></tr><tr><td>30G 바늘</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td><td>9161502</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer counting chamber</td><td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td><td>C-1003</td><td></td></tr><tr><td>Pattex Glue</td><td>Henkel AG & 공동, D&uuml; 독일 셀도르프</td><td>PSK1C</td><td></td></tr><tr><td>LS column</td><td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>림프구 분리 배지 (밀도 1,077 g/mL)</td><td>anprotec</td><td>AC-AF-0018</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Merck</td><td>1,071,440,025</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)</td><td>Biochrom GmbH, Berlin, Germany</td><td>L182-10</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 anti-human CD4</td><td>BioLegend, 샌디에이고, 미국</td><td>317428</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 마우스 IgG2b, &kappa; isotype Ctrl</td><td>BioLegend, 샌디에이고, 미국</td><td>400337</td><td></td></tr><tr><td>PFA (파라포름알데히드)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>0335.1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydrogen carbonate</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>P7481</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 피펫 10 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, 독일</td><td>86.1254.001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>주사기 1 mL</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>주사기 5 mL</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td><td>260067</td><td></td></tr><tr><td>주사기 20 mL</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td><td>260069</td><td></td></tr><tr><td>튜브 1.5 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, 독일</td><td>72,706,400</td><td></td></tr><tr><td>튜브 2 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, 독일</td><td>72.695.400&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>튜브 2mL, 갈색</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, 독일</td><td>72,695,001</td><td></td></tr><tr><td>튜브 15 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, 독일</td><td>62.554.502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>튜브 50 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, 독일</td><td>62.547.254&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin (Rompun 2%)</td><td>Bayer Vital GmbH, 레버쿠젠, 독일</td><td>KPOBD32</td><td></td></tr></tbody></table>

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

매우 활성화 된 면역 세포의 조직 축적 압도적인 다양 한 만성 염증 성 질환의 특징을 대표 하 고 영향을 받는 환자의 임상 관리에 매력적인 치료 대상으로 등장. 프로-염증 성 면역 세포의 병 적 불균형 조직 침투의 치료 규제를 목표로 하는 전략을 더욱 최적화 하기 위해서는 그것은 향상 된 통찰력으로 질병 및 기관 관련을 달성 하기 위해 특별 한 중요성의 될 것입니다. 주변 세포의 속성을 추적 합니다. 여기 설명된 실험 프로토콜 papain 유도 폐 염증의 맥락에 놓여있는지 레이블 및 adoptively 전송 인간 림프 톨의 폐 축적을 모니터링할 수 있습니다. 면역 세포 이동과 chemotaxis 분석을 위해 자주 사용 표준 생체 외 분석 실험, 달리 지금 소개 vivo에서 설정 계정 폐 관련 조직 조직 및 복잡 한 염증의 영향으로 걸립니다. 시나리오 murine 생명체에서 일어나입니다. 또한, 3 차원 횡단면 빛 시트 형광 현미경 이미징만 양적 데이터, 면역 세포를 침투에 제공 하지 않습니다 하지만 또한 염증이 폐 내에서 면역 세포 지역화의 패턴을 보여 줍니다. 전반적으로, 우리는 제공 된 단계별 프로토콜에 따라 쉽게 적용 될 수 있는 만성 염증 성 폐 질환의 분야에서 면역학 연구에 대 한 높은 값의 혁신적인 기술을 소개 수 있습니다.

제시 프로토콜 모니터링 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 통해 폐에 adoptively 전송된 인간 T 림프 톨의 축적을 측정 하는 실험 마우스 모델을 설명 합니다. 그림 1 A 생체 조건 실험 일정 단계의 도식 개요를 제공 합니다. 신뢰할 수 있는 결과 보장 하기 위하여 그것은 좋은 품질은 절연 및 붙일 수 있도록 상당한 중요성의 표시 인간의 CD4+ T 세포, 이후에 쥐로 전송 됩니다. 그림 1B, C, microbead 기반 셀 농축 및 후속 형광-라벨 일반적으로 위의 설명된 절차에 대표적으로 묘사 된 흐름 cytometrically에서 결과 결정 CD4+ T 셀 순도 &gt; 95% 그리고 성공적인 형광 모든 CD4의 라벨+ T 세포. 빛-시트 형광 현미경의 품질과 침투 깊이 비판적으로 조직 비운...

여기 소개 된 프로토콜 vivo에서 염증 성 조건 하에서 기본 인간 림프 톨의 폐 유도 용량 특성을 수 있습니다. 알레르기 염증의 마우스 모델에서 adoptively 전송된 인간의 면역 세포의 폐 침투 몇 군데 하 고 화학적으로 허가 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 의해 측정할 수 있습니다.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

우리의 기술은 T 세포 폐 호밍의 과정에 흥미 진진한 통찰력을 제공하는 생체 내 염증 조건에서 폐 축적 된 인간 면역 세포의 정확한 이미징을 허용합니다. 이 프로토콜은 T 세포 폐 호밍에 대한 번역 연구를 지원하고 염증성 또는 알레르기 성 폐 질환의 최적화 된 치료를위한 새로운 표적의 식별에 도움이 될 수 있습니다. 특히, T세포 폐호밍에 대한 질병특이적 면역세포 특성, 폐조직 조직 및 염증성 밀리우의 영향을 고려하는 능력은 이 방법을 매우 유리하게 만든다.전반적으로, 우리의 기술은 수시로 활성화된 면역 세포의 압도적인 조직 축적에 의해 구동되는 만성 선동적인 폐 질병의 필드에 있는 면역학 연구를 위한 높은 가치입니다. 적어도 16그램, 6주 된 마취 C57 블랙 6J 마우스에서 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 마이크로 파이프를 사용하여 갓 준비된 파파인 10 마이크로리터를 3일 연속으로 마우스의 한 콧구멍으로 천천히 전달한다. 마지막 papain 행정 다음 날, 10 층 건강한 자원 봉사자로부터 인간의 말초 혈액 아래 Ficoll 배지의 층 10 밀리리터는 원심 분리에 의한 밀도 그라데이션 분리를 위해 PBS에서 1 대 2 비율로 미리 희석됩니다.말초 단일핵 혈전 또는 PBMC 상 간 층을 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 다음으로, 제조업체의 프로토콜에 따라 CD4 양성 세포의 자기 미생물 절연을 수행한다. 비드 절연 CD4 양성 T 세포를 PBS 농도의 최소 500 마이크로리터당 7번째 T 세포에서 10배까지 최대 10배까지 재중단한다.적절한 적색광 흥분 세포 증식 염료로 세포에 37도에서 10 분 동안 라벨을 지정하십시오. 인큐베이션이 끝나면 5권의 RPMI 배지로 라벨링 반응을 5분 동안 10%의 FBS로 보충한 다음 중간 크기의 세 개의 세차재를 검게 합니다. 인간 CD4 양성 T 세포를 파팡 노출 받는 마우스로 양용 이송하는 경우, 형광으로 표시된 T 세포를 PBS에서 밀리리터 농도당 10배에서 7번째 세포로 10배로 재일시 중단하고 100마이크로리터의 셀을 1밀리리터 주사기로 하였고, 1인자 동물당 30게이지 바늘을 장착한 1밀리리터 주사기에 적재한 다음, 한 주사기에서 부터 세포의 전체 부피를 꼬리 정맥 에 추가적으로 주입하여 테인을 추가적으로 치료한 동물에 대한 테인을 유지한다. 세포 전달 후 5초 후 세포 현탁액의 배출을 방지합니다.입양 세포 전달 후 3 시간, 카테터에 연결된 21 게이지 캐뉼라와 각 안락사 마우스의 오른쪽 심실을 펑크하고 왼쪽 심실에 절개를합니다. 얼음차가운 PBS 20밀리리터로 폐를 천천히 견딜 수 있으며, 5밀리미터 EDTA로 보충한 다음 얼음냉이 4%의 파라포름알데히드 2밀리리터가 그 뒤를 따릅니다. 모든 고정제가 조직을 통해 플러시되었을 때, 타액샘을 제거하고 흉골 하이드 근육을 잘라 서 집게가 기관 아래에 미끄러져 공기관 조직을 노출할 수 있도록 한다.바늘을 무딘 30 게이지 카테터로 교체하기 전에 30 게이지 바늘로 노출된 기관체의 초기 천자를 수행하여 조직에 대한 추가 손상을 방지합니다. 바늘 홀더를 사용하여 삽입 된 카테터와 기관 사이의 접합을 밀봉하고 폐가 완전히 전개 될 때까지 약 섭씨 0.75 %의 아가로즈로 기도를 조심스럽게 채웁니다. 카테터와 기관 사이의 단단한 접합은 폐를 생리적 크기로 확장하고 이미징을위한 조직 아키텍처를 유지하는 데 중요합니다.아가로즈가 완전히 굳어지면 카테터를 제거하고 폐를 4%의 파라포름데디로 채워진 어둡고 2밀리리터 튜브로 조심스럽게 옮겨 넣습니다. 다음으로, 분당 31회전과 4°C로 연속 회전하에서 순차적인 에탄올 인큐베이션으로 조직을 탈수하여 배양당 4시간 동안 표시한다. 완전한 탈수 후에, 조직이 반투명으로 나타날 때까지 실온에서 하룻밤 잠복을 위해 에틸 신나메이트로 샘플을 옮기.광시트 형광 현미경검사의 경우, 소량의 유기 용매 안정 접착제를 사용하여 폐를 현미경의 샘플 홀더에 고정하고 폐 엽을 똑바로 세워 홀더에 놓습니다. 샘플 홀더를 챔버에 넣고 계측기 소프트웨어의 실험에 적합한 레이저를 선택합니다. 그런 다음 광학 아래의 슬라이더를 사용하여 전체 기관 또는 특정 관심 부분을 균일하게 드러내는 숫자 조리개 시트 너비를 설정합니다.슬라이더를 사용하여 선택한 각 레이저에 대한 레이저 전송 제어 하에 레이저 강도를 설정하고 적용을 클릭합니다. 고급 측정 설정을 사용하여 왼쪽 및 오른쪽 라이트 시트를 병합하여 균일하게 조명된 이미지를 만듭니다. 스캔 범위에서 측정할 Z 스택의 시작 및 끝 위치를 정의하고 단계 크기를 5 마이크로미터로 설정한 다음 자동 저장을 선택하여 파일을 자동으로 저장하고 측정을 시작하여 이미지를 캡처합니다.모든 이미지를 획득하면 3D 이미징 분석 소프트웨어에서 능가 버튼을 활성화하고 선택한 Z 스택의 다른 모든 이미지의 개구부 및 자동 3D 재구성을 시작하기 위해 하나의 Z 스택에서 첫 번째 이미지를 로드한 다음 디스플레이 조정하에 각 채널에 대한 강도, 검은색 수준 및 대비를 조정합니다. 다른 견본에 걸쳐 폐 조직 내의 인간 세포의 축적을 비교하려면, 특정 부피로 폐 큐브를 정의하기 위하여 편집 및 자르기 3D를 선택합니다. 정의된 폐 큐브 내에서 표지된 셀을 정량화하려면 도구 모음에서 새 스팟 추가를 열고 자동 생성 건너뛰기를 클릭하고 수동으로 편집하고 640 나노미터 채널을 선택합니다.반지름 스케일을 10.00 미크론으로 설정하고, 선택(Select)을 클릭하고 편집 할 때, 시프트는 왼쪽 마우스 버튼을 클릭하여 각 형광 셀을 개별적으로 점으로 표시합니다. 계산된 셀의 전체 수가 통계에 표시됩니다. 이미지를 캡처하려면 스냅샷 도구를 사용하거나 애니메이션 도구를 사용하여 비디오를 캡처합니다.미생물 기반 세포 농축 및 후속 형광 라벨링은 전형적으로 CD4 양성 순도가 적어도 95%의 양순도및 유동 세포측정에 의해 결정된 바와 같이 이들 세포의 성공적인 라벨링을 초래한다. 에틸 신나마트 계 조직 클리어링은 성공적인 굴절률 매칭을 나타내는 높은 수준의 기관 투명성을 달성합니다. 폐 조직의 자동 형광 신호는 평균 강도 투영 또는 표면 모드로 표시될 수 있는 광시트 현미경검사법에 의해 폐의 해부학 구조를 이미지화하는 유용한 도구를 제공한다.종래의 현미경 검사법에 비해, 광시트 현미경 검사는 전체 장기 영상 및 후속 3D 재구성의 이점을 제공하여 증식 염료 표지의 식별 및 시각화를 허용하고, 또한, 파팡 노출 동물의 염증폐 조직 내선택적 축적을 위한 인간 T 세포의 선호는 인간 CD4 양성 세포로부터 더 지원된다는 사실에 의해 더 지원된다. 상이한 조건 들 사이의 인간 CD4 양성 T 세포의 폐 축적의 정량화 및 비교를 위해, 표지된 세포는 또한 입증된 바와 같이 정의된 부피의 몇몇 폐 큐브에서 계산될 수 있다. 폐 관류, 인플레이션 및 조직 정리를 포함한 신중한 조직 준비는 고해상도 광시트 현미경 이미지의 최적화된 생성에 매우 중요합니다.이송된 인간 림프구의 성공적인 다이파이드를 추가로 확인하기 위해, 이 프로토콜은 뮤린 기관지알벨라 라베이지 내의 인간 림프구의 유동 세포정량화와 쉽게 결합될 수 있다. 생체 내의 개별 환자로부터 유래된 면역 세포를 모니터링하는 능력은 특정 질환 또는 치료에 의해 각인된 면역 세포에서 기능적 변화의 식별을 지원합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

두 광자 영상은 기저 조건에서 림프절 이내에 면역 반응 한 중 림프구 세포 운동성 및 상호 작용을 밝혀있다. 여기, 우리는 T 세포, 림프절의 고립, 그리고 CD4의 영상 운동성 + explanted 림프절의 T 세포의 입양 전송을 보여줍니다.

해부와 마우스에서 주변 림프절의 2 광자 이미징

여기, 우리는 마우스 노상 강도의 백혈구가 추적 연구 비침습 두 개의 광자 (2P) 현미경의 접근 방식을 설명합니다. 우리는 조직 이미징 준비의 기술적 측면을 논의하고 실행 및 데이터를 수집하도록 설정 초기의 전형적인 실험을 통해 독자를 걸어보세요.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

2 - 광자 현미경의 최근 발전은 실시간으로...

마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징

성체 마우스의 림프절에서 120 ㎛의 깊이까지의 향상된 콘트라스트와 높은 해상도의 intravital 촬상 공간적 다중 초점 이광자 현미경의 여기 패턴을 변조함으로써 달성된다. 100 μm의 깊이에서 우리는 따라서 산란 및 회절 한계를 우회, 487 ㎚의 해상도 (측면) 및 551 nm의 (축 방향)을 측정 하였다.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

여기, 우리는 CD11c.DTR 마우스의 기관 내 디프테리아 독소 치료에 의해 유도되는 무균 성 심근염의 쥐 모델에서 심장 CD45 + 백혈구 침윤을 시각화하기위한 가벼운 시트 현미경 접근법을 설명한다.

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

우리는 정밀 컷 폐 조각 (PCLS)를 생성하고, 폐에 다양한 면역 세포 유형의 현지화를 시각화하도록 면역 염색하는 방법을 설명합니다. 우리의 프로토콜은 다양한 조건 하에서 위치와 다양한 세포 유형의 기능을 시각화 할 수 있도록 확장 할 수 있습니다.

정밀 절단 라이브 폐 수지상 세포를 시각화하기 위해 마우스 폐 슬라이스

이 프로토콜에서는 이미지 거주 종양 침투 CD8 T 세포 인간 폐 종양 조각 내 붙일 결합 된 항 체와 함께 표시 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 CD8 T 세포 이동의 실시간 분석을 허용 한다.

전 비보 인간의 폐 종양에 거주 CD8 T 림프 톨의 이미징 조각 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법

여기, 선물이 빛 시트 현미경을 사용 하 여 3 차원 (3D) 콜라겐 매트릭스에 포함 된 면역 세포를 시각화 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 또한 3d에서 셀 이동 추적 하는 방법 elaborates. 다른 유형의 3D 매트릭스에 현 탁 액 셀이이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

인간의 면역 세포의 3 차원 시각화를 위한 빛 시트 현미경

생체 내 형광 현미경 검사는 백혈구 - 내피 상호 작용 및 모세관 관류를 실시간으로 연구하는 데 활용 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 진공-안정화된 폐 영상화 시스템을 사용하여 폐 미세순환에서 이러한 파라미터를 영상화하고 정량화하는 방법을 기술한다.

진공 안정화 이미징 시스템을 이용한 실험적 급성 폐 손상에서의 폐 미세순환의 생체내 광역 형광 현미경 검사

여기에서는 이광자 현미경을 사용하여 이식된 쥐의 왼쪽 폐를 생체 내 이미징하는 프로토콜을 제시합니다. 이는 쥐 폐 이식 후 실시간으로 세포 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 유용한 도구입니다.

이식된 마우스 폐의 생체 내 2광자 현미경

재관류 급성 심근경색증(repAMI)에서 심장 손상의 3차원(3D) 재구성은 관련 질병에 영향을 미치는 패턴의 충실한 정량화 및 공동 국소화를 가능하게 합니다. 여기에서는 심장 손상, 위험 영역 및 면역 세포 반응의 동시 측정을 위해 자동화 가능한 라이트 시트 유도 이미징 접근 방식이 제공됩니다.

라이트 시트 형광 현미경을 이용한 재관류 급성 심근경색증의 심장 손상 및 면역 반응의 동시 3D 분석

배우세요 고급 폐 유도 빛 시트 현미경을 활용한 알레르기 염증 마우스 모델에서 인간 림프구 이미징 방법을. 이 기술은 T 세포 폐 조직 유입 연구와 염증성 폐 질환 치료 표적 발굴에 활용됩니다.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

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