디지털 PCR을 사용하여 마우스 조직에서 인간 T 세포의 Xegeneic Murine 모델 및 정량화에서 이식편 대 숙주 질환의 유도 및 채점

이 프로토콜은 xenograft 대 숙주 질병, 또는 xenoGVHD를 유도하는 방법과 일관된 결과를 보장하기 위해 임상 점수를 장님및 표준화하는 방법을 설명합니다. xenoGVHD 모델은 뮤린 T 세포가 아닌 인간에 대한 면역 억제 요법을 테스트하여 이러한 연구의 번역을 클리닉으로 개선하는 생체 내 방법을 제공합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 아마라 셍 (Amara Seng)이 될 것입니다.

주사 하루 전에, 8-12 주 된, 비 비만 당뇨병 성 공상 장마, 또는 NSG, 살균 된 파이 케이지에 마우스를 배치하고, 150 센티미터의 총 용량으로 세슘-137 소스에서 마우스를 조사, 심지어 조사를 보장하기 위해 느린 회전. 그런 다음 생쥐를 멸균 생물 안전 캐비닛에 밤새 깨끗한 케이지에 넣습니다. 다음 날 아침, 마우스당 7개의 말초 혈액 단핵세포 또는 PBMC에 1.1배 10배 를 분리하고, PBS에서 2%의 태아 소 혈청 또는 FBS의 동등한 부피로 고분리된 혈액을 희석시키기 위하여 충분한 건강한 인간 혈액을 수집합니다.

밀도 그라데이션 원심분리를 위한 50밀리리터 원내 튜브에서 15밀리리터의 림프구 분리 밀도 그라데이션 배지에 희석된 혈액의 최대 25밀리리터를 조심스럽게 오버레이합니다. 분리의 끝에서, 인터페이스에서 PBMC를 수확하고, 새로운 50 밀리리터 원추형 튜브에서 PBS의 10 밀리리터에서 세포를 세척. 수퍼내티를 흡인하고 튜브를 쓸어 당겨 펠릿을 풀어냅니다.

또 다른 원심분리를 위해 신선한 PBS의 10 밀리리터에서 PBMC를 다시 중단하고, 계산을 위한 신선한 PBS의 5밀리리터에 재서스펜션이 뒤따랐습니다. 이어서, 최종 원심분리를 가진 세포를 수집하고, PBS 농도의 밀리리터당 8개의 PBMC에 10회 10회에서 펠릿을 재연한다. 격리된 인간 PBMC를 마우스 눈으로 레트로 궤도 전달하기 위해 100마이크로리터의 셀이 장착된 28게이지 바늘을 장착한 1밀리리터 주사기를 적재한다.

발가락 핀치에 대한 응답의 부족을 확인하고 엄지 손가락과 가운데 손가락으로 마우스를 부드럽게 억제합니다. 바늘 배꼽 측을 아래로 삽입하고, 측면 캔투스에, 눈의 뒤쪽에 도달할 때까지 결막막을 통해 삽입한다. 바늘을 약간 후퇴시키고 세포의 전체 부피를 천천히 주입하십시오.

그런 다음 주사기와 바늘을 적절히 처리하기 위해 바늘을 완전히 철회합니다. 눈꺼풀을 닫고 거즈 스폰지로 주사 부위에 가벼운 압력을 가하십시오. 그런 다음, 붓기 또는 다른 눈에 보이는 외상에 대한 주입 부위를 검사하고, 마우스가 집 케이지로 동물을 이동하기 전에 종이 타월과 모니터링줄이 있는 멸균 케이지에서 의식을 되찾을 수 있도록 합니다.

GVHD 점수를 측정하려면 케이지를 라미나르 플로우 후드에 넣고 케이지에서 음식과 물을 제거합니다. 활성을 점수하려면 마우스의 동작을 5분 동안 관찰한다. 체중 감량 점수를 얻으려면 유리 비커에 각 마우스의 무게를 측정합니다.

마우스가 여전히 비커에 있는 동안, 자세, 모피 질감 및 피부 무결성에 대 한 동물을 검사. 관심있는 조직을 수확 한 후, 기관에서 조직의 약 3 ~ 0.5 밀리미터 조각을 잘라, 균형에 샘플을 무게. 가중 조직을 멸균 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고, 영하 80도에서 밤새 보관하기 위해 액체 질소로 샘플을 스냅 동결한다.

다음 아침, 유전체 DNA 격리 키트의 지침에 따라 용해 전에 샘플을 해동하십시오. 디지털 폴리머라제 연쇄 반응 또는 PCR에 의한 인간 T 세포 정량화를 위해, 사용되고 있는 디지털 PCR 기계에 대한 DNA 결합 염료에 대한 프로토콜에 따라 디지털 PCR 반응을 준비하고 인간 CD3 엡실론 게놈 DNA에 적합한 프라이머를 사용한다. 이어서, 적절한 반응 조건하에서 디지털 PCR 반응을 수행한다.

인간 PBMC를 수신하는 두 남녀의 8-12주 된 NSG 마우스를 초심하게 조사하여 PBS로만 치료된 부정적인 대조군 마우스에 비해 10일 전후 GVHD의 임상 징후를 표시하기 시작한다. 제노GVHD 마우스는 23.5일의 중간 생존을 가지고 있다. 디지털 PCR을 사용하여, CD3 epsilon 양성 인간 T 세포는 인간 PBMC를 수신하는 마우스의 폐 및 간 견본에서 검출될 수 있습니다.

점수가 일관되게 수행되고 마우스를 채점하는 연구원이 치료에 눈이 멀어지는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 혈청은 말초 사이토카인 발현 분석을 위해 안락사 마우스로부터 수집될 수 있으며, 면역 세포는 유동 세포분석을 통해 분석을 위해 비장으로부터 수집될 수 있다.