피부에 있는 유전으로 표를 붙인 기자 세포의 Vivo 2 색 2-광자 화상 진찰에서

우리의 프로토콜은 우리가 형광 태그 세포가 살아있는 동물의 염증성 말초 자극에 실시간으로 반응하는 방법을 시각화 할 수 있습니다. 2-Photon 이미징을 통해 살아있는 표본의 조직 깊숙이 시각화하여 세포와 미세 환경의 무결성을 보존하고 생물학적 시스템의 정확한 표현을 제공합니다. 호흡은 시간이 지남에 따라 발을 움직여 흐림과 초점 평면의 손실을 유발합니다.

이미징하기 전에 테이프로 발을 안정적으로 부착해야 합니다. 이점에서 당신은 관심의 적절한 평면을 찾을 수 있어야합니다, 그 목적은 만지지 않고 발에 가까운 있는지 확인하고 직접 주입 사이트 위에. 절차를 시작하기 전에 다중 광자 시스템을 켜고 주관적인 25X를 선택합니다.

다중 광자 현미경의 단계에 스테레오탁스 장치를 배치하고 마취 전달 기계에 장치를 연결합니다. 마우스 발의 연결 점으로 장치의 표면에 매트 한 검은 종이 조각을 놓습니다. 512 x 512 마이크로미터의 고정 스캔 영역으로 공명 스캐너를 설정합니다.

녹색 및 빨간색 형광 단백질 신호에 대한 930 및 1, 100 나노미터 흥분 파장에 흥분 레이저를 각각 조정합니다. 690 내지 1, 050 나노미터의 이색 거울을 사용하여 두 여기 레이저의 광 경로를 단일 목표로 전달하여 930 나노미터 조정된 여기 레이저가 메인 스캐너에 반영되고 1, 100 나노미터 조정 된 레이저가 메인 스캐너로 직접 전달될 수 있도록 합니다. 그런 다음 FITC의 레이저 전력을 5%로 설정하고 녹색 형광 단백질을 20%로 설정하고 오버헤드 라이트를 끕니다.

생체 내 이미징의 경우 마우스를 마취하고 텍스트 프로토콜에 설명합니다. 마취 된 마우스의 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인하고 코 콘에 액세스 할 수있는 스테레오 탁스 장치에 마우스를 배치합니다. 검은 테이프를 사용하여 뒷발발을 관심 지역에 근접및 단면 모두에 검은 종이 조각에 단단히 부착하여 발의 발바닥 표면이 방해받지 않고 목표를 향해 향하도록 하십시오.

발바닥 표면에 충분한 양의 수량의 윤활유를 놓습니다. 윤활유에 목표를 터치하여 발과 목표 사이에 액체 열을 만듭니다. FITC 여기 광을 사용하여 발의 진피 층에 초점을 맞추고 탠덤 디머 토마토 태그 섬유아세포가 시각화 될 수 있음을 확인합니다.

두 레이저와 뒷발의 발바닥 표면 바로 아래에 위치한 세포의 영역을 이미지. 슬라이스당 약 1마이크로미터에서 약 5~10개의 Z 슬라이스의 15분 의 시간 경과를 획득하여 환경의 기준선을 설정합니다. 기준선 이미징이 입수되면 PBS 의 20 마이크로리터당 FITC 컨쥬게이드 리포다이삭라이드 또는 LPS 5마이크로그램을 갖춘 25마이크로리터 유리 해밀턴 주사기를 적재합니다.

발 위치를 방해하지 않고 실험적인 뒷발에 인트라플라터 주입하여 용액을 관리한다. 그런 다음 두 레이저로 뒷발의 발바닥 표면 바로 아래에 위치한 셀 영역을 이미지화합니다. LPS FITC의 내측 소생을 식별하기 위해 슬라이스당 약 1마이크로미터에서 약 5~10개의 Z 슬라이스의 60~120분 의 시간 경과를 획득한다.

진피 층 내의 세포에 의한 내재형 형광이 없기 때문에, 뒷발의 진피 층에서 무수한 세포가 야생형 마우스에서 인트라플라터 주입 후 형광태그 LPS를 취하는 것을 관찰할 수 있다. LPS FITC 주입 후, 섬유아세포 특이단백질 1개만이 수용체 4개의 결합과 같은 통행료를 발현하고 이러한 세포에 의해 표현된 탠덤 디머 토마토 태그와 함께 높은 수준의 공동 국소화로 주입된 단백질을 섭취한다. 대조적으로, 수용체 같이 통행료가 있는 마우스는 주입 후에 LPS를 묶고 지워지지 않습니다.

실제로, 세포 실루엣은 LPS FITC 주입 후에 볼 수 있습니다 약물이 세포 주위의 중간 유체에서 분산되고 있음을 나타내는, 그러나 실제로 수용체에 의해 구속되지 않습니다. 이 프로토콜에서 기억해야 할 가장 중요한 것은 움직임이나 호흡으로 인해 비디오에 왜곡이 없도록 발이 고정되도록 하는 것입니다. 이 절차를 사용하여, 형광 태그 세포의 모집부상 후 영역에 및 시간이 지남에 자극에 세포의 반응에 형태학적 변화를 추적 할 수 있습니다.

따라서 2-Photon 이미징을 통해 연구자들은 유전 기자 마우스와 형광 태그가 지정된 화합물을 결합하여 주사 후 살아있는 동물에서 일어나는 일을 평가할 수 있습니다.