배아 마우스 소뇌에서 분리된 뉴런의 1차 배양

생체 내 조건을 가능한 한 적절하게 반영하기 위해 체외 실험을 수행하는 것은 쉬운 일이 아닙니다. 일차 세포 배양의 사용은 전체 유기체의 세포 생물학을 이해하기 위한 중요한 단계입니다. 제공된 프로토콜은 배아 마우스 소뇌 뉴런을 성공적으로 성장시키고 배양하는 방법을 설명합니다.

1차 신경세포 배양은 해리된 뉴런 in vitro 배양을 연구하기 위한 이상적인 모델 시스템입니다. 이 방법을 사용하는 장점은 메커니즘, 기능 및 형태와 같은 해리된 세포의 세포적 특징을 시험관 내 조건에서 몇 주 동안 가능한 한 생체 내 상태에 가깝게 유지할 수 있다는 것입니다. 원형 덮개 슬립을 생물 안전 캐비닛 아래의 24웰 플레이트에 넣습니다.

각 커버 슬립에 90마이크로리터의 폴리-L-오르니틴을 추가합니다. 캡을 닫고 플레이트를 37도 인큐베이터에 이틀 동안 부드럽게 넣습니다. 배양 배지와 파종 배지를 준비하고 섭씨 4도로 유지합니다.

DMEM/F12에서 작동 중인 트립신 용액을 준비하고 4도로 유지합니다. 배양 배지와 파종 배지를 37도의 인큐베이터에 놓습니다. 인큐베이터에서 24웰 플레이트를 꺼냅니다.

이중 증류수로 커버 슬립을 세 번 씻으십시오. 덮개가 완전히 건조될 때까지 최소 2시간 동안 그대로 두십시오. 얼음 위에 차가운 PBS로 채워진 페트리 접시 3개, 차가운 HBSS로 채워진 페트리 접시 3개, 차가운 해부 매체로 채워진 페트리 접시 5개를 준비합니다.

자궁 뿔을 절제하고 얼음 위에서 차가운 PBS로 세 번 씻습니다. 여기서부터 조직 손상을 최소화하기 위해 모든 단계를 얼음 위에서 수행해야 합니다. 마지막 세척 단계 후 HBSS에서 자궁에서 새끼를 분리하여 냉박부 매체로 옮깁니다.

해부 매체에서 가위로 새끼의 목을 베십시오. foramen magnum에서 orbital cavity의 아래쪽 경계까지 calvarium을 엽니다. 한 쌍의 가는 집게를 사용하여 두개골 기저부를 제거하고 두개골을 뇌에서 떼어냅니다.

중간 소뇌 꽃자루와 폰의 측면 표면에서 시작하여 소뇌의 수막을 조심스럽게 제거합니다. 양쪽 소뇌 꽃자루를 잘라내고 소뇌를 뇌의 나머지 부분과 분리한다. 수집된 소뇌를 DMEM/F12로 채워진 멸균 15mL 원뿔형 튜브에 얼음 위에 즉시 놓습니다.

DMEM/F12에 있는 1 분동안 4개의 도에 1, 000 g에 관을 원심분리기. 이 작업을 세 번 반복하며, 매번 피펫으로 상층액을 부드럽게 제거하고 펠릿을 새로운 DMEM/F12에 다시 현탁시킵니다. 예열된 트립신 2ml를 넣고 부드럽게 피펫으로 섞습니다.

튜브를 37도 수조에 12분 동안 넣습니다. 배양 후 튜브를 안전 캐비닛으로 가져오고 10mL의 DMEM/F12를 첨가하여 트립신을 비활성화합니다. 혼합물을 1, 200g에서 5분 동안 원심분리합니다.

상등액을 버리고 새로운 배지에 재현탁시킨 다음 원심분리를 3회 합니다. 멸균 플라스틱 피펫을 DMEM/F2로 사전 적십니다. 동일한 튜브에 3.5ml의 DNAse 작업 용액을 추가합니다.

액체가 균일한 유백색을 얻을 때까지 피펫으로 조직을 여러 번 삼중화합니다. 혼합물에 차가운 DMEM/F12 10mL를 넣고 원심분리기를 진행합니다. 1, 200g에서 4도에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다.

펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 제거하십시오. 인큐베이터에서 시딩 배지를 제거합니다. 예열된 파종 배지 500마이크로리터를 넣고 피펫을 사용하여 잘 섞습니다.

혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 세포 현탁액을 파종 배지로 500, 밀리리터당 000개의 세포의 밀도로 희석합니다. 90마이크로리터의 혼합물을 커버슬립 중앙의 각 웰에 추가합니다.

플레이트를 37도의 인큐베이터에 3-4시간 동안 놓습니다. 배양 후 각 웰에 500마이크로리터의 예열된 배양 배지를 추가합니다. 플레이트를 37도의 인큐베이터에 다시 넣습니다.

7 일 후, 오래된 배지를 신선한 배양 배지 II로 교체하십시오.해당 숫자 조직이있는 별도의 24 웰 플레이트를 준비하고 각 웰에 100 마이크로 리터의 PFA 4 %를 첨가하십시오. 원하는 배양 기간이 지난 후 원래 배양 플레이트의 웰에서 커버 슬립을 부드럽게 제거하고 이전 단계에서 설명한 PFA 플레이트의 해당 웰에 넣습니다. 웰에 PFA를 추가하여 커버 슬립을 완전히 잠깁니다.

PFA 플레이트를 30분에서 120분 동안 4도로 유지합니다. 배양 후 플레이트를 실온으로 복원합니다. 커버를 부드럽게 씻고 PBS로 5 분 동안 3 회 미끄러집니다.

텍스트의 그림 2는 E18에서 시작하는 소뇌 세포 배양을 보여줍니다. 칼빈딘에 대한 면역형광은 시험관에서 3일 동안 축삭이 확장된 Purkinje 뉴런을 보여줍니다. 체외에서 7일에서 10일이 지나면 수지상 과정이 분명해집니다.

21일에는 복잡한 수지상 가지가 존재합니다. 본문의 그림 3은 다양한 배아 일수에서 시작되는 소뇌 세포 배양을 보여줍니다. calbindin의 면역형광 검출은 시험관에서 18일 후에만 초기 축삭을 가진 Purkinje 뉴런을 보여줍니다.

E14 및 E15에서 시작된 Purkinje 뉴런 배양은 수상돌기를 발달시키지만 E18이 시작점일 때 발생하는 것만큼 복잡하지는 않습니다. 텍스트의 그림 4는 in vitro 21일 후 E18 배양에서 다양한 세포 유형이 발달하는 것을 보여줍니다. Calbindin 녹색 면역 형광은 Purkinje 뉴런을 보여줍니다.

B와 C의 파브알부민에 대한 적색 면역형광은 억제성 중간뉴런을 보여줍니다. E와 F의 나트륨 전압 의존성 채널에 대한 적색 면역형광은 과립 뉴런을 보여줍니다. 현재 프로토콜은 비용 효율적이고 수행하기 쉽습니다.

이 동영상이 끝나면 소뇌 뉴런을 수집 및 배양하고 원하는 DIV로 고정할 수 있습니다.