Name: 총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 배우세요 살아있는 HeLa 세포의 세포막 수용체 올리고머화 역학을 TIRF 현미경과 N&B 분석으로 실시간 관찰하는 방법을. 이 기법은 수용체 신호전달 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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CNIC는 시엔시아, 이노베이션 y 유니버시다데스 및 프로 CNIC 재단의 지원을 받으며, 세베로 오초아 우수 센터(SEV-2015-0505)입니다. 우리는 또한 유럽 지역 개발 기금 (FEDER) "우나 마네라 드 헤이서 유로파"에 의해 지원됩니다. UC는 아소시아지오네 이탈리아나 리카르카 술 칸크로, 국제 암 연구 협회(현재 전 세계 암 연구로 알려짐), 이탈리아 보건부의 지원을 인정합니다. A.T.는 2011-2012년 "프로게토 프로게토 프로페셔널이바노 베치"와 함께 자신의 작품을 부분적으로 지원한 것에 대해 "폰다지오네 방카 델 몬테 디 롬바르디아"를 인정합니다.

1. 견본 준비
<ol><li>1일차. 유리 바닥 접시에 100,000-200,000 세포 / mL의 농도에서 완전한 배지에 종자 HeLa 세포. 씨앗 6-8 접시를 복제합니다. 참고: 이 예에서, 배지는 10% 열 불활성화 된 태아 소 혈청 (FBS), 1 mM 나트륨 피루브, 100 U/ 100 μg 페니실린 / 스트렙토 마이신으로 보충됩니다. 여러 가지 복제 요리가 준비됩니다.</li>
	<li>2-3일차. 세포가 하위 합류에있을 때, 단백질 플라스미드와 요리의 절반을 트랜스 펙하고 두 번째 절반은 세럼이없는 배지에서 참조 플라스미드 (단량체 및 디머)를 사용합니다. 참고: 형질감염은 페놀 레드없이 항생제, 0.1% 소 혈청 알부민 및 25 mM HEPES 완충액으로 보충된 무혈청 배지로 만들어집니다.</li>
	<li>3-4일차. 형질 감염된 세포가 접시의 바닥에 부착되어 있고 세포막이 형광인지 확인하십시오. 자란 세포나 형광이 매우 낮은 접시를 버리십시오. 참고: 세포가 자라지 않도록하십시오. 세포는 잘 분포되어야하며 접시의 유리 영역에 부착해야합니다(그림 1A). 사전 코팅 된 유리 바닥 접시는 세포 접착을 선호하는 데 사용할 수 있습니다. 세포 배양은 어떤 실험든지 전에 mycoplasma 오염을 위해 시험됩니다. 이 예에서, 세포는 (A207K) mEGFP-FGFR1 플라스미드로 형질감염되고 기준 세포는 표준 프로토콜을 사용하여 GPI-(A207K) mEGFP 및 GPI-(A207K) mEGFP-(A207K)로 형질감염된다. 라이브 세포 현미경 검사의 경우, 표시기없는 매체가 권장됩니다. 25 mM HEPES 버퍼는 이미징 중에 pH 변화를 방지하기 위해 추가됩니다.</li>
</ol>2. TIRF 이미징 — 레이저 라인 정렬 및 TIRF 조명 최적화
<ol><li>실험 4시간 전에, 37°C에서 현미경의 온도 인큐베이터를 활성화한다.</li>
	<li>현미경, 컴퓨터 및 카메라를 켜고 카메라가 적절한 작동 온도에 도달할 때까지 기다립니다. 참고: 본 연구에 사용된 카메라의 작동 온도는 -75°C입니다.</li>
	<li>목표에 오일을 약간 떨어뜨립니다. 샘플 접시를 제자리에 놓습니다. 인큐베이터의 문을 닫고 접시의 온도가 평형 (~ 10 분)하자.</li>
	<li>에피소레전램프와 488nm 레이저를 켭니다.</li>
	<li>에피플루오레시콘트 모드를 선택하여 샘플을 탐색하고, 안구에서 초점을 맞출 세포를 검색합니다. 참고: 형광램프를 사용하여 안구를 수색하는 것은 필수가 아닙니다. 대신 적합한 레이저 라인을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>현미경 카메라(Band Pass Ex 490/20 (500) Band Pass Em 525/50 또는 이와 유사한 현미경 카메라를 통해 녹색 방출을 수집하기 위한 적절한 필터를 선택합니다.</li>
	<li>epifluoresccence 모드에서 안구에서 카메라 포트(그림 1의카메라 #1)로 전환하고 초점을 구체화하고 TIRF 모드로 변경합니다. 에피플루오레전및TIRF 모드는 현미경의 브랜드에 따라 다른 명명법의 이름을 지정할 수 있습니다. 참고: 커버슬립 인터페이스에 형광 마커가 없는 경우 레이저에 초점을 맞추거나 정렬하는 데 문제가 있을 수 있습니다. 레이저를 제대로 정렬하려면(좋은 TIRF에 필수적) 커버슬립에 초점을 맞춥니다. 커버슬립이 초점이 맞춰져 있는지 여부를 확인하는 것은 종종 매우 어렵습니다. 제안으로, 세포의 가장자리에 초점을 맞춥니다.</li>
	<li>TIRF 현미경의 지시에 따라 자동 정렬을 활성화합니다. 참고: 간단히, 2.4에서 2.8까지의 단계에 대해, 먼저 안구를 통해 세포를 찾아 서 그들에 초점을 맞춘 다음, TIRF 현미경의 카메라 포트에 방출을 보내, 현미경 컴퓨터 화면에 세포를 다시 초점을 맞추고 레이저 정렬 절차를 활성화. 정렬은 조명이 전도가 되는 임계 각도를 찾는 것으로구성됩니다(그림 3). 상용 현미경은 약간 다른 정렬 프로토콜을 가질 수 있으며 또한 완전히 자동화 될 수 있습니다. 다른 사람들은 임계 각도 조건의 시각화를 용이하게하기위한 작은 카메라가있을 수 있습니다.</li>
	<li>적합한 조명 깊이를 선택하고 에바네센트 필드의 방향을 최적화합니다(그림3). 참고: 침투 깊이는 모든 컨트롤 및 샘플에 대해 일정하게 유지됩니다.</li>
</ol>3. TIRF 이미징: 타임시리즈 캡처
<ol><li>256 x 256픽셀 이상의 ROI(관심 영역)를 정의합니다. 참고: 이 설정에서 캡처는 카메라만 직접 제어하는 소프트웨어에서 카메라 #2 수행됩니다(그림 1 범례 참조).</li>
	<li>노출을 1ms로 설정하고 EM 게인을 1,000으로 설정합니다(eq. 12 및 13의 G 계수입니다). 이러한 속도로, 조정하거나 레이저 전력을 증가시킬 필요가있을 수 있습니다. 여기서 레이저 파워는 0.5 mW입니다. 참고: 카메라의 종류와 단백질의 확산 계수에 의해 부과되는 한계, 형광 강도 및 배경에 따라 레이저 전력을 설정하는 일반적인 기준은 검출기를 포화시키고, 광표백을 최소화하고, 캡처하는 것이 아닙니다. 가능한 한 빠른 S/N에서 확인할 수 있습니다. EM 게인은 항상 카메라의 최대값으로 설정됩니다(소개 참조).</li>
	<li>초기 조건에서 첫 번째 평가판 시퀀스를 실행하고 S/N 값을 대략적으로 추정합니다. 조건은 첫 번째 시간계열의 첫 번째 프레임에서 측정된 S/N = 2-3 이상에서 허용됩니다.</li>
	<li>카메라 #2 연결하는 방출 분할 시스템의 슬라이더를 사용하여 이미지의 측면을 마스킹합니다(그림1B, 그림 4A-B). 참고: 이 설정에서 멀티 채널 이미징 커넥터는 동시에 두 개의 공간적으로 동일한 이미지를 수집 할 수 있도록 #2 카메라에 설치됩니다. 이 시스템에는 다양한 배기가스 배출 필터를 장착할 수 있는 슬라이드가 장착되어 있습니다. 슬라이더 중 하나는 이미지의 측면을 커버하기 위해 검은 색 마스크를 마운트합니다. 마스크된 영역은 각 열계의 내부 보정에 사용되어 카메라 파라미터(eq. 12 및 eq. 13)를 결정합니다. 이러한 방식으로 독립적인 교정 단계가 필요하지 않으며, 중요한 것은 각 타임시리즈의 캡처와 병행하여 교정이 수행된다는 것입니다. 이 시스템이 없는 경우, 카메라는 게시된프로토콜(33)을적용하여 보정될 수 있다.</li>
	<li>카메라 파일 자동 저장 옵션을 선택합니다.</li>
	<li>이미지 시리즈의 수집을 시작합니다. 최소 S/N 비율이 2인 700프레임을 획득합니다. 참고: 분석에 필요한 프레임 수는 광표백에 대한 샘플 안정성과 데이터의 분산에 따라 달라집니다. 따라서 N&amp;B 분석 중에 각 시간계의 품질이 평가됩니다.</li>
	<li>현미경에서 접시를 꺼내지 않고 리간드를 추가하십시오.</li>
	<li>밝은 형광 막이있는 세포를 선택하고 운동 실행의 첫 번째 연재를 신속하게 시작합니다. 참고: 리간드의 첨가가 신속하게 이루어지면, 이 첫 번째 캡처는 리간드 역학의 포인트 = 0시간을 설정한다. 이 소프트웨어는 캡처의 정확한 시간을 등록합니다.</li>
	<li>두 번째 셀을 검색하고 역학의 두 번째 시간 점을 획득합니다. 참고: 포인트 방문 루틴은 x, y, z 전동 단계가 장착 된 일부 현미경에서 사용할 수 있습니다. 이들은 세포 접시에 다중 위치의 암기를 허용하고, 다른 세포에 이미지 시리즈 사이 시간의 더 일정한 간격을 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다.</li>
	<li>운동 실행의 각 시간 지점에 대한 새 셀을 캡처합니다. 참고: 캡처 한 후 셀이 부분적으로 포토블리백화되어 다시 이미지화 할 수 없습니다. 그 때문에, 역학은 많은 세포의 타임시리즈를 결합하여 수득되며, 각각 다른 시점에서 포착된다.</li>
	<li>각 새 접시에 대해 2.3단계에서 3.9단계까지 프로토콜을 반복합니다. 참고: 참고 요리의 경우, 리간드에 사용되는 것과 동등한 차량(PBS+0.01% 소 혈청 알부민을 보충)을 추가합니다.</li>
</ol>4. 숫자 및 밝기 (N&amp;B): 타임 시리즈의 품질 확인
<ol><li>변환 및 로 저장합니다. 카메라 소프트웨어로 획득한 파일을 TIFF(이 예제의 .sif 파일).</li>
	<li>가져오기. N&amp;B 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) MATLAB을 활성화하여 분석 소프트웨어 루틴의 TIFF 파일. 참고: 맞춤형 Matlab 실행 가능한 N&amp;B 루틴이 여기에 사용됩니다(https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia N&amp;B 분석). 가져온 을 여는 것입니다. TIFF 파일, 루틴은 평균 강도 이미지, 평균 강도 프로파일을 생성하고 계열 프레임별 프레임별 검사할 수있다(보충 도 1). 다른 소프트웨어는 N&amp;B 분석(예: SimFCS 소프트웨어)에 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>평균 강도 프로파일이 10% 이상의 광표백을 보여주는 시리즈를 폐기하고, 획득 하는 동안 세포막 왜곡 또는 번역이 명백한 계열이 있었다.</li>
	<li>초점이 다른 자르기 프레임. 참고: 이미지 시리즈 내의 단일 또는 다중 프레임을 삭제하기 위해 자르기 도구가 루틴에 구현됩니다. 이 작업은 프레임 간 시간이 중요하지 않은 반면 픽셀 거주 시간(노출 시간)은 토론 참조이기 때문에 허용됩니다.</li>
	<li>500개 이상의 시간 프레임을 가진 해석 전용 계열에 대해 유지합니다.</li>
</ol>5. 숫자 및 밝기 (N&amp;B): 카메라 파라미터 결정(오프셋, σ 및 S)
<ol><li>일상적인 보정 카메라를 활성화합니다.</li>
	<li>검출기 노이즈 영역에서 20 x 50픽셀 이상의 영역을 선택합니다(그림4). 참고: 루틴은 값의 히스토그램 (또한 정의 된 디지털 수준, DL)에서 유래하고 디지털 수준 대 주파수의 로거 리헴 플롯을 반환합니다.</li>
	<li>로그 주파수 대 디지털 레벨 플롯에서 선형 빨간색 커서를 이동하여 가우시안 과 곡선의 선형 부분을 구분합니다. 참고: 빨간색 커서는 곡선의 두 섹션을 분할하고 카메라 응답의 가우시안 함수의 중심인 오프셋, 가우시안 맞춤의 σ 및 카메라 레스폰의 선형 부분의 경사인 S 팩터를 반환하는 루틴을 활성화합니다. e(그림 4C-D).</li>
</ol>6. 숫자 및 밝기 (N&amp;B): 선택한 관심 영역(ROI)에서 B 값 계산
<ol><li>B 키를 활성화합니다. 참고: 이 동작은 평균 강도이미지(도 5,제1 열)와 각 개별 B-값이 이미지의 관련 픽셀에 연관되는 B-이미지를 생성한다(보충도 1).</li>
	<li>최소 비닝(2 2)을 적용하여 데이터의 분산을 줄이고 B-I 히스토그램을생성한다(도 5,제2 컬럼). 참고: B-I 히스토그램은 이미지의 모든 픽셀과 픽셀 강도의 B-값의 분포를 나타냅니다. Y = B/S; X =<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq1.jpg"> ( - 오프셋)/S(보조그림 1 및 eq. 11 및 15).</li>
	<li>대화형 사각형 커서를 사용하여 B-I 히스토그램을 검사합니다.</li>
	<li>분석에 대한 정사각형 ROI를 선택합니다(그림5,세 번째 열). 참고: 커서는 평균 강도 이미지에서 모바일 마스크를 동기화하여 정사각형 커서 영역 내에서 선택된 픽셀을 강조 표시합니다(추가그림 1). 이 검사를 통해, 매우 낮은 강도의 배경 및 영역을 분석에서 제외할 수 있다.</li>
	<li>선택한 ROI의 B 맵을생성합니다(그림 5,네 번째 열).</li>
	<li>선택 영역에 연결된 B 값의 ASCII 파일을 저장합니다.</li>
	<li>그래픽 소프트웨어에서 ASCII 파일을 가져와 데이터의 주파수 분포를 계산하고 평균 B-값 ± S.E(그림5,다섯 번째 열)를 얻습니다. 참고: 데이터가 균일한 경우 B-값의 주파수 분포는 가우시안 분포와 근사합니다.</li>
	<li>eq. 15를 적용하여 <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq18.jpg"> 운동 <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq19.jpg"> 실행의 각 시점에서 각 셀에 대해 평균 밝기 = - 1 [(개수/분자)]을 도출합니다. 다음에 따라 데이터를 정규화합니다. <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq17.jpg"> 여기서 <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq20.jpg"> 리간드 첨가 후 시간 "t"로 측정된 <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq21.jpg"> 평균 B-값이며, 시간 t=0에서 측정된 평균 B-값(리간드 첨가 후 10-20s)이다. 참고: 결과의 정상화는 다른 일에 수행되는 실험의 직접 비교를 할 수 있습니다. 레이저 전력 및 기술적 변동으로 인해 측정된 밝기의 차이를 보정합니다.</li>
	<li>정규화된 평균 밝기와 획득 시간을 플롯하여 운동 실행을 빌드합니다(그림6).</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

N&B는 셀 모델 및 라벨링 전략의 선택에 몇 가지 예방 조치가 필요합니다. 이미지 캡처 시간 동안 안정적으로 부착된 상태로 유지되는 라이브 셀에만 적용할 수 있습니다. 전체 셀 강성 변위로 인한 추가 변동은 적절한 이미지 복원 접근법38로처리될 수 있습니다. 그러나, 일반적으로 세포가 움직일 때, 세포막은 또한 변형되고, 구조 변형, 큰 추가 편광을 일으키, 막 단백질의 분석에 심각한 한계를 소개합니다. 이 작업에서, 형광 구조체는 구성FGFR1이 무시할 수 있기 때문에 HeLa 세포주에서 발현된다. 구성 단백질의 존재는 피하는 조건, 그렇지 않으면 형광 및 비 형광 수용체 올리고머의 혼합 인구는 가능성이 형성 할 것이다. 결과적으로, 형광태그가 붙은 단백질 집단의 밝기만을 기반으로 하는 N&B 분석은 평균 올리고머 상태에 대한 신뢰할 수 없는 추정치를 반환합니다. 이러한 양상은 FGF2 리간드의 존재 시 FGFR1 이광과 같은 밝기가 2의 인자에 의해서만 증가하는 수용체 이광 이벤트...

우리는 살아있는 세포의 혈장 막에 수용체 분자의 평균 올리고메상태를 결정하기 위한 총 내부 반사 형광 수 및 밝기(TIRF-N&amp;B) 이미징 접근법을 설명하며, 수용체 어셈블리를 연결하는 것을 목표로 합니다. 단백질의 생물학적 기능에 역학(그림 1).
세포외 리간드 결합시, 수용체는 그들의 형태, 올리고머화, 잠재적인 공동 수용체 및 막 조성에 따라 세포내 신호 변환을 개시한다. 수용체 올리고머화의 중요성과 보편성에도 불구하고, 세포 신호의 주요 사건으로 인식1,2,3,4,5,6, 7,몇 가지 방법은 클러스터링 이벤트를 감지하고 실험적으로 클러스터링의 정도를 측정 할 수 있습니다8,9. 공초점 부피(x,y, y , 300 nm, z □900 nm)는 이미지 복원알고리즘(10)에의해 최적화된 후에도 분자 상호작용 및 점양내측정을 입증하기 위해 충분히 해결된다. 단백질 올리고머의 하위 단위 조성은 손바닥11,STORM12및 STED13과같은 20-70 nm의 초고해상도 방법에서도 순수한 공간적 기준으로 해결할 수 없다. 또한 시간해상도(이미지당 분 순)는 초 범위에서 역학을 따를 수 없습니다. 단 하나 분자 단계 표백은 단백질 올리고머의 stoichiometry를 움직이지 않는 경우에만 해결합니다 14.
단일 이미지 내에서 형광 태그가 지정된 단백질의 밀도와 올리고머화를 측정하는 가장 다양한 방법 중 하나는 공간 샘플링에 의존하는 공간 강도 분포 분석(SpIDA)입니다. 화학적으로 고정된 세포와 살아있는 세포 모두에 적용가능하며, 표준 형광 현미경검사법 15를사용하여 세포의 관심 있는 여러 영역의 분석을 동시에 허용한다. 또는 형광 상관 분광법(FCS)16,광자 계수 히스토그램(PCH)17및 수 및 밝기(N&amp;B)18,19,양적 올리고머에 적합한 모멘트 방법 측정. 이러한 방법은 형광이 조명 부피안팎으로 확산될 때 관찰할 수 있는 형광 강도 변동을 분석합니다. 강도 변동의 진폭은 조명부피 17(도 2)내에서 형광포(θ)의 분자 밝기 및 평균 형광포(n)에 의해 고유하게 설명될 수 있다. 전형적으로, 불소의 확산 계수 및 조명 부피 내의 평균 분자 수(G(0) 값과 반비례)는 FCS20에의해 수득될 수 있다. 그러나, 확산 시간은 질량의 입방 루트로만 스케일링되기 때문에, FCS는 분자질량(21)의변화를 검출하기에 충분히 민감하지 않다. 실제로, 단색 FCS는 막 수용체의 이각을 검출할 수 없습니다. PCH는 다른 올리고머의 혼합물을 정확하게 해결합니다. 진폭 분포의 두 개 이상의 순간을 사용하여 동일한 조명 볼륨을 차지하는 서로 다른 밝기의 분자를 감지합니다. 스캐닝 FCS22 및 분자 밝기(pCOMB) 접근법(23)의 흥미로운 쌍 상관관계접근법(23)과같은 개발, 생물학적 시스템에서 형광 상관 방법의 적용 범위를 확장하기 위해도입된 24 , 셀의 넓은 영역에서 빠른 측정 기능이 부족한 단일 지점 방법을 유지하므로 각 픽셀에서 많은 연속 관찰이 필요하고 몇 초 안에 데이터 수집이 필요합니다.
N&amp;B는 형광 분포의 진폭의 첫 번째 및 두 번째 모멘트, 즉 평균 강도, , 및 분산,σ2 (그림 2)18,19를 고려하는 PCH의 단순화된 버전입니다. 그리고, 그 때문에, 혼합물에서 알 수없는 올리고머의 어금니 분율을 결정할 수 없지만 혼합물의 평균 올리고머화 상태를 추정할 뿐입니다. 그럼에도 불구하고 N&amp;B는 형광 강도의 시간 변동을 모니터링하기만 하면 PCH보다 상대적으로 작은 라이브 셀 이미지로 작업할 수 있는 장점이 있습니다. N&amp;B는 픽셀당 시간을 몇 마이크로초로 줄여주므로 넓은 세포 영역에 걸쳐 빠른 올리고머화 역학을 따를 수 있으므로 래스터 스캐닝 현미경 검사법(예: 공초점, 2광자) 및 밀리초에서 시간 배율로 이미지를 수집할 수 있습니다. 카메라 기반 현미경 검사법(예: TIRFM)에서
몇몇 보고는 확장한 세포 지구를 화상 진찰에 의하여 단백질 클러스터에 있는 소단위의 수를 정량화하는 N&amp;B의 기능을 설명했습니다. Paxillin-EGFP 클러스터는 CHO-K1세포(25)의접착 부위에서 검출되었고, 병원성 Httex1p 펩티드의 세포내 응집은 COS-7 세포26에서기재되었다. N&amp;B는 ErbB수용체(27)의리간드 구동 올리고머화, 및헬라세포(28)에서KLB(KLB) 및 FGFR1c상에서의 리간드 FGF21의 효과를 따르기 위해 적용되었다. TIRF 이미징과 N&amp;B 분석의 조합은 다이너민-2가 전체세포막(29)에걸쳐 주로 테트라메어임을 보여주기 위해 사용되었다. 우리는 uPAR 및 FGFR1 세포막 수용체30,31의리간드 구동 이각을 증명하기 위해 래스터 스캐닝 및 TIRF 이미지 모두에 N&amp;B를 적용했습니다.
N&amp;B, FCS 및 PCH와 같은 형광 상관 방법은 개방 부피에서 파티클의 점령 수가 푸아송 분포를 따른다는 개념을 기반으로 합니다. 형광단이 방출하는 광자만 검출할 수 있기 때문에, 측정된 형광 강도에 대한 평균 값은 이미지의 <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq1.jpg"> 픽셀에서 시간 대, 조명 부피, n 및 이들의 평균 형광피의 수의 산물이다. 분자 밝기, θ17:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq2.jpg">
여기서 θ는 분자가 조명 부피의 중심에 있을 때 분자당 시간 단위(종래로 초당 초당)로 방출되는 광자의 수로 표현된다.
밝기는 주어진 획득 설정에서 각 형광포의 속성이며 강도는 모든 형광단의 모든 기여도의 합계입니다. 생물학적 경연 대회에서, 밝기는 함께 변동하는 형광단의 수의 증가와 함께 증가하여 형광 태그가 지정된 단백질의 올리고머화 상태에 대한 정보를 제공합니다. 주어진 픽셀에서의 변동 진폭은 형광 신호의 분산으로부터 측정되며,σ2:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq3.jpg">
여기서 강도의 제곱 및 <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq4.jpg"> 강도 <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq5.jpg"> 평균의 제곱은 각 프레임의 각 픽셀의 개별 강도 값에서 계산됩니다.
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq6.jpg">
여기서 K는 타임계의 총 프레임 수입니다. 실험적으로, 전체 이미지 계열에 대해 평균 강도 값을 중심으로 단일 이미지의 각 픽셀에서 개별 강도 값의 분산을 설명하는 분산을 계산할 필요가 있다. 분산에는 서로 다른 기원의 모든 변동이 포함됩니다. 제1 근사치에서, 배루 볼륨에서 확산 입자로 인한 분산,σ20,검출기 샷 노이즈,σ2d에의한 분산으로부터 분리될 수 있다. 두 분산은 독립적입니다. 따라서 총 분산은 합계로 지정됩니다.
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq7.jpg">
검출 량안팎의 분자 변동으로 인한 차이는 분자 밝기 및 강도에 선형적으로 의존합니다.
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq8.jpg">
eq. 1에 따라 eq. 6 재배치:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq9.jpg">
형광 상관 분광법의 일반적인 개념에 따르면, 방정식 7은 변동수에 의한 차이가 입자 밝기의 제곱에 따라 달라지도록 합니다.
그런 다음 검출기 변동에 의한 분산은 검출된 강도의 선형 함수이며, 검출기가 포화 한계19이하로 작동한다는 가정 하에 :
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq10.jpg">
광자 계수 검출기의 경우 =1및 c=0이므로 검출기 분산은 평균 강도와 같습니다.
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq11.jpg">
라이브 셀의 실제 측정에 이러한 개념을 적용하기 위해 Gratton 및동료(18)는 각 픽셀에 대해 평균 강도에 대한 분산의 비율로 명백한 밝기 B를 정의합니다.
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq12a.jpg">
B는 실험적으로 측정되는 파라미터입니다. 이 작품에서, HeLa 세포의 혈장 막에 있는 FGFR1 수용체의 시계열 심상 심자는 TIRF 현미경 검사법에 의해 포착되고 평균 명백한 밝기, B는, N&amp;B 분석에 의해 결정됩니다. 이어서, FGF2를 첨가한 후, 연속적인 타임시리즈는 정준 리간드로 수용체의 자극 후 막 표면에서 수용체 분자의 자가 조립의 변화를 따르도록 포획된다.
그러나 TIRF 현미경의 검출기는 EMCCD 카메라이므로 명백한 밝기에 대한 발현은19로수정해야합니다.
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq13a.jpg">
여기서 오프셋은 검출기 설정의 특성인 검출 전자의 강도 오프셋입니다. 아날로그 검출기의 분산 및 평균 강도는 각각 다음을 통해 제공됩니다.
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq14a.jpg">
여기서 G는 디지털 레벨(DL/광자)의 아날로그 이득인 경우, S는광자19당디지털 레벨이 일정한 강도(시간적 변동 없음)를 가진 광원에 대한 강도 대 분산 플롯의 경사에 의해 주어집니다. γ 계수는 픽셀 검출 볼륨의 형상과 관련이 있다. Hassleret al. 32에따르면, γ 계수는 검출카메라(19)의최대 이득에서 작동하는 TIRF 이미징에 대해 0.3과 동일하다. 오프셋, S 및 G 매개 변수는 카메라와 현미경의 특성입니다. 명백한 밝기 B는 eq. 12 및 13에 따라 eq. 11을 재배열하여 얻어집니다.
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq15.jpg">
실험적으로, θ는 레이저 강도와 시스템의 검출 효율의 복잡한 기능이다. 그럼에도 불구하고 B/S는 θ에 선형적으로 종속되므로 지정된 감지 모드에 대한 θ의 상대값을 결정하는 것만 중요합니다.
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq16.jpg">
여기서 θ'는 θ에 비례합니다. 그러나 내부 참조를 사용하여 보정이 수행됩니다.

<table><tbody><tr><td>3색 고속 TIRF Leica AM TIRF MC 도립 현미경, SMI 자동 TIRF 정렬. 현미경에는 다이오드 488nm 레이저, 100x 1.46 오일 TIRF 대물렌즈, 490/20 및 525/50의 Ex/Em 대역통과 필터, 온도/CO2 인큐베이터 및 Andor DU 8285 VP EMCCD 카메라가 장착되어 있습니다. 현미경은 라이카 LIF 소프트웨어로 작동됩니다.</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청의 알부민 98% 미니먼</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 페놀 레드 25 mM HEPES</td><td>GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>21063029</td><td>현미경 검사에 무함유</td></tr><tr><td>세럼 DMEM 고포도당 글루타MAX I</td><td>GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>10566-016</td><td>완전 배지에 사용</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td><td>Biowest, Nuaill&eacute;, France</td><td>X0515-500</td><td></td></tr><tr><td>Emission splitting system Photometrics DV2</td><td>TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, 적격, 브라질</td><td>GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>10270106</td><td>완전 배지에 대한 10% 불활성화 보충제</td></tr><tr><td>유리 바닥 35mm 멸균 1.5 접시</td><td>MatTek, Ashland, MA, USA</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>비코팅, 유리 두께 0.17 미크론</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간 자궁 경부 암종(HeLa), 무혈청 동물 성분(AC) 세포</td><td>Millipore-Sigma ECACC, 다름슈타트, 독일</td><td>CB_08011102</td><td></td></tr><tr><td>iXonEM+ 897 EMCCD(이면조사형) ANDOR Solis 소프트웨어</td><td>Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK</td><td></td>에 의해 제어되는 <td>ANDOR 카메라 현미경의 추가 포트에 설치된 이 카메라는 N&를 획득하는 데 사용됩니다. B 시계열</td></tr><tr><td>Matlab 실행 파일 N& B routine</td><td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, 마드리드, 스페인</td><td></td><td>https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia</td></tr><tr><td>MatLab v.2018b</td><td>The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA</td><td></td>에서 다운로드<<td>a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">https://www.mathworks.com/products/matlab.html</a></td></tr><tr><td>Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x</td><td>Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA</td><td>LONZA 17-602E</td><td>보충제 페니실린/스트렙토마이신 100 U/100&micro;g.</td></tr><tr><td>pN1-mEGFP-FGFR1 발현 벡터</td><td>Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy</td><td></td><td>Zamai et al., 2019</td></tr><tr><td>pN1-N-Gly-mEGFP-GPI 발현 벡터</td><td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td><td></td><td>Hellriegel et al., 2011</td></tr><tr><td>pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector</td><td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, 마드리드, 스페인</td><td></td><td>Hellriegel et al., 2011</td></tr><tr><td>Recombinant FGF2</td><td>PeproTech EC, Ltd., London, UK</td><td></td><td>리간드 용액: 0.01%BSA가 보충된 PBS의 FGF2 20ng/mL.</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨 GIBCO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td> 매체 TransIt-LT1 형질 주입 시약<td>용 1mM 보충제</td></tr><tr><td></td><td>MirusBio LLC, Madison, WI, USA MIR</td><td>2300</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드</td><td>GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Type F Immersion liquid 10 mL</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>11513 859</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure BSA (50 mg/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2618</td><td>0.1% 보충제, 트랜스펙션에 사용되는 페놀 레드가 없는 배지</td></tr></tbody></table>

총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

수용체 올리고머화의 중요성과 보편성에도 불구하고, 클러스터링 이벤트를 검출하고 군집의 정도를 측정하는 몇 가지 방법이 적용 가능하다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포의 막에 있는 mEGFP 꼬리표 수용체 동종 복합체의 평균 올리고메릭 상태를 결정하기 위하여 화상 진찰 접근을 기술합니다. 이 프로토콜은 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사법과 숫자 및 밝기(N&B) 분석을 기반으로 합니다. N&B는 형광 상관분광법(FCS) 및 광자 계수 히스토그램(PCH)과 유사한 방법으로, 형광의 형광 강도의 변동에 대한 통계적 분석을 기반으로 조명 안팎으로 확산되는 형광 의 강도에 대한 통계적 분석을 기반으로 합니다. 관찰 시간 동안 볼륨을 볼 수 있습니다. 특히, N&B는 올리고머 혼합물에서 평균 단백질 수에 대한 정보를 얻기 위해 PCH를 단순화한다. 강도 변동 진폭은 불소의 분자 밝기와 조명 부피 내의 평균 형광부 수에 의해 설명됩니다. 따라서 N&B는 진폭 분포의 첫 번째 및 두 번째 모멘트, 즉 평균 강도와 분산만 고려합니다. 이것은, 동시에, 방법의 강도와 약점이다. 두 순간만 고려되기 때문에 N&B는 혼합물에서 알 수 없는 올리고머의 어금니 분율을 확인할 수 없지만 혼합물의 평균 올리고머화 상태만 추정합니다. 그럼에도 불구하고, 단순히 형광 강도의 시간 변동을 모니터링함으로써, 픽셀 단위로 라이브 셀의 이미지의 상대적으로 작은 시간계 (다른 모멘트 방법에 비해)에 적용 될 수있다. 픽셀당 유효 시간을 몇 마이크로초로 줄여 초 단위로 수집할 수 있으므로 빠른 올리고머화 역학에 필요합니다. 마지막으로, 넓은 세포 지역 뿐만 아니라 하위 세포 구획을 탐구할 수 있습니다.

동일한 배양 접시에 시드된 두 개의 대표적인 HeLa-mEGFP-FGFR1 세포에 대한 결과는 도 5 및 보충표 1에나타내었다. 두 세포를 FGF2 리간드를 첨가한 후 0분(도5A,위) 및 7분(도5A,하단)에 포획하였다.
도 5는 또한 순수한 단량체, GPI-mEGFP(도5B,상단) 또는 공유 연결된 디메릭 플루오로폴레, GPI-mEGFP-mEGFP(그림<strong class=...

우리는 살아있는 세포의 혈장 막에서 리간드 결합에 의해 유도된 mEGFP 태그-수용체 올리고머의 평균 올리고머 상태의 측정을 위한 이미징 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사법과 숫자 및 밝기(N&B) 분석을 기반으로 합니다.

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

수용체 클러스터링은 유비쿼터스이며 종종 캐스케이드 활성화를 신호하는 데 필요합니다. 그러나 클러스터링 정도를 측정하는 방법은 거의 없습니다. 우리는 살아있는 세포의 혈장 막에 있는 FGFR1-mEGFP 분자의 확산을 따르기 위하여 총 내부 반사 형광, TIRF 현미경 검사를 이용합니다.그런 다음 자극된 수용체 클러스터링의 역학을 설명하기 위해 수 밝기, N&B 분석을 적용합니다. TIRF는 세포 표면 근처에서 발생하는 분자 이벤트의 빠른 시간적 이미징에 이상적이며, N&B는 현미경의 조명 부피 안팎에 확산되는 곳을 기반으로 형광 분자의 평균 올리고머 상태를 결정합니다. 실제로, 이것은 그들이 신호하는 세포 표면에 수용체의 공간 측두조직을 연결하는 도구입니다.N&B는 빠른 획득 모듈을 갖춘 현미경에 대한 액세스만 필요합니다. 형광 변동 방법에 대한 기본적인 지식을 갖는 살아있는 세포의 넓은 영역을 분석 할 수 있습니다. 이 방법은 희미또는 군집을 형성하는 단백질에 적용될 수 있고 형광염으로 표지될 수 있습니다.단백질이 세포내 구획에 있는 경우에, 현미경의 그밖 모형은 심상을 취득하기 위해 이용됩니다. 실험 조건하에서 측정하기 위한 형광의 단황 형태를 표현하는 구조를 준비하여 순수한 단황 밝기를 대조군으로 준비하는 것이 중요하다. 첫날, 1.5 밀리리터의 완전한 배지에 있는 종자 HeLa 세포는 유리 바닥 접시에 있는 밀리리터 당 100, 000 에서 200, 000 세포의 농도에서 완전 배지의.6~8개의 복제 요리를 씨앗으로 만들고, 섭씨 37도에서 인큐베이터로 배양합니다. 둘째 또는 셋째 날에 세포는 종속성에 도달했습니다. 단백질 플라스미드를 첨가하여 접시의 절반에 추가하고, 모노머와 이량으로 레퍼런스 플라스미드를 요리의 후반부에 추가하여 세포를 변형시합니다.하루 후, 전염된 세포가 접시의 바닥에 부착되어 있고 세포막이 형광인지 확인하십시오. 자란 세포가 있거나 형광이 매우 낮은 요리를 버리십시오. 실험 4시간 전에 현미경의 온도 인큐베이터를 섭씨 37도에서 활성화합니다.현미경, 컴퓨터 및 카메라를 켜고 카메라가 섭씨 영하 75도의 적절한 작동 온도에 도달할 때까지 기다립니다. 목표 렌즈에 약간의 오일 한 방울을 놓습니다. 샘플 접시를 현미경의 인큐베이터에 넣고 인큐베이터의 문을 닫아 접시의 온도가 10 분 동안 평형화할 수 있도록하십시오.피성 광등과 488 나노미터 레이저를 켭니다. 피불화 콘트라스트 모드를 선택하여 샘플을 탐색하고 안구 렌즈에서 초점을 맞출 세포를 검색합니다. 밴드패스 Ex 490/20 500 및 밴드패스 Em 525/50 또는 이와 유사한 현미경 카메라를 통해 녹색 방출을 수집하기 위한 적절한 필터를 선택합니다.피성 형광 모드에서 캠 보고서로 안구에서 전환합니다. 초점을 구체화하고 TIRF 모드로 변경합니다. 그런 다음 TIRF 현미경의 지시에 따라 자동 정렬을 활성화합니다.적절한 조명 깊이를 선택하고 에반센트 필드의 방향을 최적화합니다. 두 번째 카메라로 전환합니다. 256x256픽셀 이상의 관심 영역을 정의합니다.노출을 1밀리초로 설정하고 EM 게인을 1, 000으로 설정합니다. 레이저 전력을 0.5 밀리와트로 조정합니다. 노출 시간이 발광 된 부피에서 형광 분자에 의해 소요된 평균 시간보다 짧아야하기 때문에 단백질의 확산 계수에 대한 몇 가지 정보가 필요합니다.초기 조건에서 첫 번째 평가판 시퀀스를 실행하고 신호 대 잡음 값을 대략 추정합니다. 조건은 첫 번째 계열에서 측정된 바와 같이 2~3개 이상과 동일한 신호-투-노이즈에서 허용됩니다. 그런 다음 카메라 번호 2를 현미경으로 연결하는 배출 분할 시스템의 슬라이더를 사용하여 이미지의 측면을 마스킹합니다.카메라 파일 자동 저장 옵션을 선택합니다. 최소 신호 대 노이즈 비율이 2개로 최소 700프레임의 이미지 계열 획득을 시작합니다. 현미경에서 접시를 꺼내지 않고, 리간드를 추가합니다.밝은 형광막을 가진 세포를 선택하고 운동 실행의 첫 번째 시리즈를 빠르게 시작합니다. 두 번째 셀을 검색하고 운동학의 두 번째 시간 지점을 획득합니다. 운동 실행의 각 시간 지점에 대해 새 셀을 캡처합니다.각 새 접시에 대해 레이저 라인의 정렬과 TIRF 조명의 최적화를 반복합니다. 이제 카메라 소프트웨어로 획득한 이미지 파일을 tif 파일로 변환하고 저장합니다. N&B 그래픽 사용자 MATLAB을 활성화하여 분석 소프트웨어 루틴에서 TIF 파일을 가져옵니다.평균 강도 프로파일이 10% 이상의 광표백 및 획득 중에 명백한 세포막 왜곡 또는 번역이 있는 시리즈를 표시하는 계열을 폐기하십시오. 분명히 초점이 없는 프레임을 자르는 것입니다. 최소 500개의 기간으로 해석 만 계열에 대해 보관하십시오.먼저 카메라 매개 변수를 결정합니다. 일상적인 교정 카메라를 활성화합니다. 검출기 노이즈 영역에서 최소 20x 50픽셀의 영역을 선택합니다.로그 주파수 대 디지털 레벨 플롯에서 선형 빨간색 커서를 이동하여 곡선의 선형 부분에서 가우시안을 구분합니다. B 키를 활성화합니다. 데이터의 분산을 줄이고 B-I 히스토그램을 생성하기 위해 최소 2.2의 비닝을 적용합니다.반복성 사각형 커서를 사용하여 B-I 히스토그램을 검사합니다. 분석을 위해 사각형 ROI를 선택하고 선택한 ROI의 B 맵을 생성합니다. 그런 다음 선택 영역과 연결된 B 값의 ASCII 파일을 저장합니다.그래픽 소프트웨어에서 ASCII를 가져와 데이터의 주파수 분포를 계산하고 평균 B-값 플러스 또는 마이너스 S.E.는 운동 실행의 각 시점에서 각 셀의 평균 밝기를 도출하기 위해 epsilon 방정식을 적용합니다. 정규화 방정식에 따라 데이터를 정규화하여, B't는 리간드 첨가 후 시간에 측정된 평균 B값이며 B'0은 리간드 첨가시노 후 10~20초인 0과 같을 때 측정된 평균 B값이다. 정규화된 평균 밝기와 획득 시간을 플롯하여 운동 실행을 빌드합니다.본 연구에서는, FGF2의 밀리리터당 20나노그램을 첨가한 후, 0및 7시에 포획된 mEGFP-FGR1을 발현하는 동일한 접시에 있는 2개의 HeLa 세포로부터의 대표적인 결과가 여기에 도시된다. 참조 구조, GPI-mEGFP 및 GPI-mEGFP-mEGFP 이머와 비교하여 전체 분석 서열은 타임 시리즈의 평균 강도를 나타낸다. 모든 B 값의 플롯입니다.B-I 히스토그램. 선택한 ROI의 B 맵. 그리고 관련 B 분포 히스토그램.FGF2의 밀리리터 당 20 나노그램으로 자극 한 후, 시간의 함수로 평균 밝기를 보여주는 대표적인 운동 실행은 세포 표면에서 몇 분 동안 지속되는 이머티어화의 느린 과정을 설명합니다. NCAM-Fc의 밀리리터 당 50 마이크로그램으로 자극될 때, 운동 프로파일은 올리고머 혼합물에서 수용체의 빠르고 순환적인 전이를 드러내며, 이는 또한 이량제보다 높은 밝기 값에 도달합니다. 정규화된 평균 값 3개가 반복적으로 관찰됩니다.분자 변동과 표백없이 인해 추가 변이체를 최소화하는 것이 중요합니다. 그리고 세포는 자란 것이 아니라 유리 바닥 접시에 잘 부착되어야하며 쌓이지 않아야합니다. 세포내 구획 내부에 더 빠르게 확산되는 단백질에 관심이 있다면, 0시간을 더 빠르게 적용하고 초점 또는 다광 현미경에서 스캔을 사용하여 세포 내부의 이미지에 사용할 수 있습니다.우리의 접근 방식을 통해, 우리는 우리가 이질과 같은 이벤트의 역학을 탐구 할 때 표백의 해로운 효과를 최소화. 이러한 이벤트는 다양한 세포 반응을 제어하며 다른 기술로 살아있는 세포에서 증명하기가 매우 어렵습니다.

oligomerization-dynamics-cell-surface-receptors-living-cells-total

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 기능성 분자 단지가 추적 및 계량, 감지 있도록 박테리아 세포를 생활에 단일 분자 형광 현미경을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다.

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 가까이 높은 콘트라스트와 시간적 해상도의 세포 표면 구조를 관찰하기위한 강력한 방법입니다. 우리는 TIRF은 세포 벽 - 동봉된 세균과 곰팡이 세포의 피질에서 단백질 역학을 공부 고용 수있는 방법을 보여줍니다.

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

출처: Winkle, CC, et al. 축삭 분지 및 신경 형태 형성 동안 원형질막 전달의 역할을 정의하기 위해 결합된 방법론을 활용합니다. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 피질 뉴런의 엑소 사이크 이벤트를 시각화하기 위한 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 보여줍니다. pH에 민감한 녹색 형광 단백질(GFP) 마커는 소포 융합 시 형광을 발하며, 선택적 TIRF 여기는 타임랩스 이미징에서 막-근위 엑소사이토시스를 포착합니다.

엑소 세포 사건의 시각화를 위한 전반사 형광 현미경 

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

원형질막 단백질과 지질의 공간 분포와 시간 역학은 생물학에서 뜨거운 주제입니다. 여기서 이 문제는 개념적으로 동일한 단일 입자 추적의 물리량을 제공하지만 작은 분자 레이블과 표준 현미경 설정을 사용하는 시공간 이미지 변동 분석을 통해 해결됩니다.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

생체 내 생체 분자에 대한 연구는 생물학적 맥락에서 분자 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기에서는 DNA 또는 단백질과 같은 형광 생체 분자를 살아있는 미생물로 내재화할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 형광 현미경 검사로 기록된 생체 내 데이터 분석도 제시되고 논의됩니다.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

단백질 기능화 평면 유리 지지 지질 이중층의 준비, 내 단백질 이동성 측정 및 단백질 밀도 측정이 여기에 나와 있습니다. 노이즈를 줄인 내부 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 구축하기 위한 로드맵이 요약되어 있으며, 이를 통해 높은 시공간 해상도로 단일 이중층 상주 형광 색소를 시각화할 수 있습니다.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

바인딩할 대상 수용 체 세포 표면에 항 체 구조와 클러스터링 변경 부여 수 있습니다. 이러한 동적 변경 내용이 대상 셀에 약물 개발 특성화에 대 한 영향을 미칠. 이 프로토콜 confocal 현미경 검사 법 및 이미지 상호 관계 분광학 ImageJ/피지 수용 체 세포 표면에 클러스터링의 척도를 통해 활용 합니다.

Confocal 현미경 검사 법 밝혀 세포 표면 수용 체 이미지 상관 분광학을 통해 집계

이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 즉 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

여기, 우리는 확산 계수, 형광 현미경 검사 법에 의해 감지 하는 단일 입자의 모션 및 클러스터 크기의 종류의 정량적 인 평가 허용 하는 이미지 분석을 추적 하는 단일 입자에 대 한 프로토콜을 제시.

확산의 분석 및 형광 현미경 검사 법에 의해 수용 체 막의 클러스터 크기에 대 한 프로토콜을 처리 하는 이미지

이 연구는 비천연 아미노산(UAA) 통합을 통한 부위 특이적 표지를 사용하여 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에 대한 단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET) 실험을 수행하는 자세한 절차를 제시합니다. 이 프로토콜은 smFRET 샘플 준비, 실험 및 데이터 분석을 위한 단계별 가이드를 제공합니다.

단일 분자 FRET를 사용한 막 수용체의 구조적 역학 시각화

배우세요 살아있는 HeLa 세포의 세포막 수용체 올리고머화 역학을 TIRF 현미경과 N&B 분석으로 실시간 관찰하는 방법을. 이 기법은 수용체 신호전달 메커니즘 연구에 활용됩니다.

총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다

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