Name: 신생아 쥐 기간에 줄기 세포의 내 치 통 주입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 27 s
Description: 배우세요 신생아 쥐에서 중간엽 기질세포(MSCs)를 기관내 주입하는 방법을. 이 기술은 폐 질환 치료 효과를 평가하는 비용 효율적인 연구 모델을 제공합니다.

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이 연구는 부분적으로 메리디겐 생명 공학 (주 타이페이, 대만)의 보조금에 의해 지원되었다 (A-109-008).

이 절차는 타이베이 의과 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
참고: 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 반딧불 루시파제 유전자 (Fluc)로 안정적으로 전감염된 인간 MSP는 상업 회사(재료의 표)로부터수득되었다.
1. 반딧불 루시파라제와 녹색 형광 단백질을 가진 인간 MSC의 특성화
<ol><li>완전한 매체에서 GFP와 Fluc로 감염된 인간 MSC를 유지(최소 필수 매체 독수리-알파 수정[αMEM], 10-15% 태아 소 혈청 [FBS], 2mM L-글루타민, 1 ng/mL 기본 FGF 및2PSF로 보충) 포화 습도가 있는 37°C에서 5% CO2. ~70-90% 합류에서 통과 세포.</li>
	<li>형광상 대비현미경(도 1A)하에서 MSC를 관찰하고 Fluc 및 GFP14의발현 수준을 분석한다.</li>
	<li>유동 세포측정(도1B)을이용하여 CD44, CD73, CD90, CD105를 포함한 CD 마커의 발현을 분석하여 MSC를 특성화한다. 줄기세포의 탈량 분화를 세포세포, 연골세포 및 골세포로 유도하고, 폰 코사, 오일 레드 O 및 알시안 블루 염색에 의한 삼중 분화(도1C)를상용프로토콜(15,16)에16따른 확인한다.</li>
</ol>2. 쥐 새끼의 마취
<ol><li>시간에 따라 임신 한 Sprague-Dawley 쥐가 기간에 질로 전달되도록 허용하십시오.</li>
	<li>산후 5일째에 케이지에서 쥐 새끼를 제거합니다.</li>
	<li>마취 챔버에서 가스 마취 (즉, 2 % 이소플루란)를 사용하여 쥐 새끼를 마취합니다.</li>
	<li>호흡과 반사 신경을 확인 하 여 적절 한 마취를 확인 합니다. 참고: 호흡은 얕아져야 하며 반사 신경은 감소해야 합니다. 쥐 새끼는 이 이소플루란 농도로 적어도 ~10분 동안 의식을 잃은 채로 남아 있습니다.</li>
</ol>3. 장내 주입
<ol><li>일단 마취되면, 쥐 새끼를 ~ 60°로 기울인 삽관 스탠드에 고정하고 네 개의 사지모두에 실험실 라벨 테이프로 새끼를 제자리에 고정시하십시오.</li>
	<li>코를 아래로 테이프를 바르고 머리를 고정하고 구멍을 뚫기 위해 목을 정확히 찾아보세요.</li>
	<li>75%의 알코올 준비 패드로 절개 부위(즉, 목)를 소독합니다.</li>
	<li>경동맥을 손상시키지 않도록 마이크로시저로 기관 위 0.3cm 수직 중간선 목 절개를 만듭니다.</li>
	<li>지방과 근육 층을 멀리 해부하여 후크없이 곡선 팁 테이퍼 핀셋으로 기관을 찾습니다.</li>
	<li>구부러진 팁 테이퍼 핀셋으로 기관치를 잡습니다.</li>
	<li>100 μL 주사기를 똑바로 잡고 30 μL 주사기를 똑바로 잡고 30 μL 주사기를 수직으로 잡고 30 μL 의 일반 식염수(즉, 제어) 또는 30 μL의 Fluc-GFP 라벨MSD(1 x 105 세포)를 30G 바늘 주사기를 통해 기관체에 천천히 주입한다.</li>
	<li>6-0 실크 스티치 1개로 절개를 닫고 매듭을 가능한 한 작게 묶고 끝을 가능한 한 짧게 자른다.</li>
	<li>쥐를 적외선 아래 또는 가열 패드에 두어 따뜻하게 유지하고 마취에서 회복할 수 있도록 하십시오.</li>
	<li>쥐가 따뜻하고 분홍색이며 쥐를 케이지로 되돌리기 전에 자발적으로 움직일 수 있는지 확인합니다.</li>
</ol>4. MSC의 폐 분포 모니터링
<ol><li>이식된 인간 MSC를 추적하기 위해, 인산염 완충식식염(PBS)에 루시페린 칼륨 소금을 함유한 쥐를 MSC 주입 후 15분 동안 125 mg/kg의 체중으로 주입한다.</li>
	<li>코 콘을 통해 2% 이소플루란을 사용하여 쥐를 마취시합니다.</li>
	<li>배지 비닝, 1f/스톱, 26cm 시야를 이용하여 루시페린 투여 후 10분 간격으로 순차적 이미지를획득한다(재료의 표).</li>
	<li>이미징소프트웨어(재료표)17을사용하여 관심의 자동 영역에 기초하여 폐로부터의 발광 활성을 정량화한다.</li>
</ol>

<ol><li>Ramanathan, R., Bhatia, J. J., Sekar, K., Ernst, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+in+preterm+infants+with+respiratory+distress+syndrome+treated+with+poractant+alfa%2C+calfactant+or+beractant%3A+a+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Mortality in preterm infants with respiratory distress syndrome treated with poractant alfa, calfactant or beractant: a retrospective study.</a> Journal of Perinatology. 33, 119-125 (2013).</li>
<li>Gien, J., Kinsella, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+treatment+of+bronchopulmonary+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and treatment of bronchopulmonary dysplasia.</a> Current Opinion in Pediatrics. 23, 305-313 (2011).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

호흡 곤란을 가진 신생아는 일반적으로 내추럴 계면활성제 및/또는 코르티코스테로이드 치료가필요합니다 19. 인간 상 I 임상 시험은 조산유아에서 내막 MSC의안전성(8)을입증했다. 이러한 연구는 약물의 장내 투여가 호흡 곤란을 가진 신생아에게 중요한 선택이라는 것을 시사합니다. 모델 기능이 인간과 직접 관련이 있는 경우 동물 모델 연구가 가장 유용합니다. 용어 신생아 쥐는 조산 폐 부상 및 개발 연구에 대 한 유용한 모델. 그러나, 신생아 쥐의 상부 기도는 성인쥐20에서수행된 것과 같이 직접 기관 삽관을 허용하기에는 너무 작습니다. 기관 절제술을 통한 장내 주입은 신생아 쥐 폐에 줄기 세포 또는 약물의 장내 투여를 위한 실행 가능한 대체 기술이다.
생체 내 생물 발광 화상 진찰은 이식된 줄기 세포의 운명에 대한 ...

보충 산소는 종종 호흡 곤란으로 신생아를 치료하는 데 필요합니다1. 그러나, 유아에 있는 hyperoxia 치료는 불리한 장기 효력이 있습니다. 산소의 고농도에 장기간 노출은 염증과 급성 폐 손상으로 이어지며, 이는 인간 기관지 폐 이형성증(BPD)2와유사하다. BPD는 조기 계면활성제 치료, 최적의 환기 절차 및 미숙아의 비침습적 양압 환기 의 사용 증가에도 불구하고 발생할 수있는 hyperoxia 치료의 주요 합병증입니다. 많은 치료 전략이 BPD3에대해 보고되었지만 알려진 치료법은 이 합병증을 줄일 수 없습니다.
코르티코 스테로이드 사용은 BPD를 방지 하기 위해 하나의 잠재적인 치료, 폐 염증 그것의 병 인에 중요 한 역할을 하기 때문에. 그러나, 전신 코르티코 스테로이드 치료는 일반적으로 장기 부작용으로인해 조산 유아에 대 한 권장 하지 않습니다4,5.
중간엽 기질 세포(MSC)는 만능 특성을 가지며 뼈, 연골, 지방 조직, 근육 및 힘줄을 포함한 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있다6. MSP는 면역 조절, 항염증 및 재생 효과7을가지며, 동물 연구는 설치류8,,9에서과옥시아 유발 폐 손상에 대한 암조 및 분비 성분의 치료 이점을 보여준다. 내과 호흡 및 정맥 MSC 이식은 신생아 과옥성 폐 손상으로부터 보호하는 것으로 나타났습니다. 따라서, 줄기 세포의 내과 실체 투여및 결합된 계면활성제 및 코르티코 스테로이드 치료는 호흡기 질환으로 신생아를 치료하는 잠재적인 치료 전략일 수 있다. 전임상 연구는 신생아 쥐10,,11, 12에서줄기 세포 및 아데노 관련 바이러스의 장내투여를사용하였다. 그러나, 이식된 줄기세포의 기술 및 생체 내 추적의 단계별 프리젠테이션은 유효하지 않다. 신생아 쥐는 출생 시 쥐 폐의 낭반 단계가 임신13의26-28 주에 인간 폐의 것과 동일하기 때문에 호흡 곤란을 가진 조산유아에 대한 내내 투여의 효과를 연구하는 데 적합합니다. 쥐 기관으로 투여하는 효과적인 방법은 성공적인 폐 분포에 매우 중요합니다. 여기에 제시된 기술은 인간을 위한 모형으로 쥐를 사용하여 신생아 폐 질병의 처리를 위한 세포 및/또는 약의 장내 투여의 연구를 허용합니다.

<table><tbody><tr><td>6-0 실크</td><td>Ethicon</td><td>1916G</td><td></td></tr><tr><td>알코올 준비 패드</td><td>CSD</td><td>3032</td><td></td></tr><tr><td>BD Stemflow hMSC 분석 키트</td><td>BD Biosciences</td><td>562245</td><td>CD 마커</td></tr><tr><td>CMV-Luciferase-EF1&alpha;-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging,</td><td>SBI</td><td>BLIV511PA-1</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor10</td><td>BioLife Solutions</td><td>640222</td><td></td></tr><tr><td>Human MSCs</td><td>Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>적외선</td><td>JING SHANG</td><td>JS300T</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>할로카본</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>IVIS-200 소동물 이미징 시스템</td><td>캘리퍼스 LifeSciences, Hopkinton, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>루시페린 칼륨 염</td><td>Promega, Madison, WI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 가위, 스트레이트</td><td>Vannas</td><td>H4240</td><td></td></tr><tr><td>생리식염수</td><td>TAIWAN BIOTECH CO., LTD.</td><td>113531</td><td>이소토닉 염화나트륨 용액</td></tr><tr><td>스몰 허브 RN 니들, 30 게이지</td><td>Hamilton Company, Reno, NV</td><td>7799-06</td><td></td></tr><tr><td>주사기 (100 &micro; l)</td> <td>Hamilton Company, Reno, NV</td><td>81065</td><td></td></tr><tr><td>Xenogen Living Image 2.5 소프트웨어</td><td>캘리퍼스 LifeSciences, Hopkinton, MA</td><td>N / A</td><td></td></tr></tbody></table>

신생아 쥐 기간에 줄기 세포의 내 치 통 주입

Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats

산소의 고농도에 장기간 노출은 염증과 급성 폐 손상으로 이어질, 이는 인간의 기관지 폐 이형성증과 유사 (BPD). 미숙아에서 BPD는 계면 활성제 치료, 최적의 환기 전략 및 비침습적 양압 환기를 조기에 사용했음에도 불구하고 주요 합병증입니다. 폐 염증은 BPD의 발병기유발에 중요한 역할을 하기 때문에, 코르티코 스테로이드 사용은 이를 예방하기 위한 하나의 잠재적 치료법이다. 그럼에도 불구 하 고, 전신 코르 티 코 스테로이드 치료는 일반적으로 장기 부작용으로 인해 조영아에 대 한 권장 되지 않습니다. 전임상 연구와 인간 단계 I 임상 시험은 hyperoxia 유도폐 상해및 조산유아에 있는 중간엽 기질 세포 (MSC)의 사용이 안전하고 가능하다는 것을 보여주었습니다. 내과 호흡 및 정맥 MSC 이식은 신생아 과옥성 폐 손상으로부터 보호하는 것으로 나타났습니다. 따라서, 줄기 세포의 장내 투여및 결합계면활성제 및 글루코코르티코이드 치료는 호흡기 질환으로 신생아를 치료하는 새로운 전략으로 부상하고 있다. 출생시 쥐 폐의 발달 단계는 임신의 26-28 주에 인간 폐에 있는 것과 동일합니다. 따라서 신생아 쥐는 호흡 곤란을 가진 조산아에게 그 효능을 평가하기 위해 장내 투여를 연구하는 데 적합합니다. 이 장내 주입 기술은 줄기 세포와 약물을 폐로 전달하기위한 임상적으로 실행 가능한 옵션입니다.

신생아 쥐라는 용어에서 줄기 세포의 내막 주입의 폐 분포는 반딧불 루시파라기(Fluc)-표지된 줄기 세포에 의해 결정되었다. MSP는 Fluc로 표지되고 렌즈피바이러스 변환을 통해 녹색 형광 단백질로 태그되었습니다. 도 1A는 인간 MSC에서 높은 수준의 GFP 발현을 나타내며, 인구의 93.7%가 유동 세포측정에 의해 검출된 GFP 양성 표현을 보였다. MSC는 CD 마커(즉, CD 44, CD73, CD90 및 CD105)의 발현과 골세포, 연골세포 및 아디포사이클로 의 분화의 세분화 기능을 분석하는 것이 특징이었다(도1B,C). 생체 내에서 이식된 인간 MSC를 추적하기 위해, 쥐의 발광 화상 진찰은 작은 동물 화상 진찰 시스템을 사용하여 수행되었다. 측정은 통풍이 잘 되었습니다. 쥐는 접착 테이프로 고정되었고, 그 후 PBS에서 루시페린 칼륨 소금 30 mg/mL의 인트라회 론 주사를 ...

설명된 것은 기간 신생아 쥐의 장내 주사를 통해 중간기질 기질 세포(MSC)의 장내 이식을 수행하기 위한 프로토콜이다. 이 기술은 그들의 효험을 평가하기 위하여 신생아 쥐 폐로 줄기 세포 및 약의 납품을 위한 임상적으로 실행 가능한 선택권입니다.

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia ...

장내 주입은 Chilman의 효능을 평가하기 위해 줄기 세포와 약물을 신생아 폐에 전달하기위한 임상 생체 기술입니다. 이 기술은 신생아 쥐에서 다양한 1 차 적인 응용 프로그램과 함께 사용하기위한 선의일 수 있으며 폐 질환 치료를위한 상대적이고 비용 효율적인 측정입니다. 산후 5일째, 마취된 스프라그-Dawley 쥐 새끼를 60도 각도의 삽관 스탠드에 제지합니다.그리고 실험실 라벨 링 테이프를 각 강아지의 네 개의 사지모두에 부착하여 제자리에 고정합니다. 각 코 아래에 테이프를 바르면 머리를 고정합니다. 그리고 천자 기관 절제술에 대한 첫 번째 목을 정확히 찾아.75%의 알코올 준비 패드를 사용하여 절개 부위를 소독합니다. 그리고 경동맥을 손상시키지 않도록 기관 위의 수직 3센티미터 중간선 절개를 합니다. 후크없이 곡선 테이퍼 핀셋을 사용하여 지방과 근육 층을 분리하여 기관지 위치를 찾으십니다.기관체를 관찰할 수 있을 때, 핀셋을 사용하여 기관지를 파악하고 30 게이지 바늘을 장착한 100 마이크로리터 주사기를 사용하여 제5 반딧불 루시파라기 GFP의 10배를 기관지상에 식염수 기질 세포 30마이크로리터에 주입한다. 모든 세포가 주입되면 매듭을 가능한 한 단단히 묶는 160 실크 스티치로 절개를 닫습니다. 그리고 봉합사의 끝을 가능한 한 짧게 절단합니다.그런 다음 새끼가 마취에서 회복하여 동물을 케이지로 되돌리기 전에 따뜻하고 분홍색이며 자발적인 움직임이 가능할 때까지 모니터링할 수 있는 따뜻한 장소에서 회복할 수 있습니다. 쥐가 수술에서 회복된 후 15분 후에 이식된 인간 중간엽 기질 세포를 추적하기 위해 PBS에서 루시페리아 칼륨 소금 1kg당 125밀리그램으로 재 마취 새끼를 재마취한 새끼를 주사합니다. 주입 후 10분 후, 작은 동물 이미징 시스템을 사용하여 5-15초 간격으로 중간 비닝, 1f-stop 및 26센티미터 시야필드로 순차적인 이미지를 수집합니다.그런 다음 이미징 소프트웨어를 사용하여 관심의 자동 영역에 기초하여 폐에서 발광 활성을 정량화합니다. GFP 발현의 높은 수준은 인간 중간엽 줄기 세포로 표지된 루시파 반딧불이에서 관찰된다. 중간엽 줄기 세포는 그들의 세포 표면 마커 발현 및 골세포, 연골 세포 및 백혈구로 분화하는 그들의 능력에 의해 추가적인 특징이 될 수 있다.VIVO에서 이식된 인간 중간엽 세포의 발광 화상 진찰은 정상 식염수로 취급된 쥐의 폐 지구에 있는 발광 신호의 부재를

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줄기 세포 식별에 중요한 돌파구가 계속 만들어지고있다. 이러한 발견을 번역하기 위해, 그러나, 세포 전달을위한 새로운 방법을 고안해야합니다. 난 여기기도는 줄기 세포 이식을위한 폐에 안전한 경로를 제공하는보고합니다.

기관 절개술 : 폐에 줄기 세포의 이식을위한 방법

Intratracheal instillations 직접 폐에 solutes을 제공합니다. 이 절차는 폐암의 말초 지역에 instillate의 전달을 대상으로하고, 따라서 종종 폐포를 공부하기위한 연구에 통합됩니다. 우리는 생쥐에서 intratracheal instillations을 수행하기위한 세부적인 생존 프로토콜을 제공합니다.

마우스 폐에 Solutes 직접 Tracheal 떨어뜨림

우리는 마우스 태아에 bioactive 대리인의 intratracheal 관리에 대한 새로운 수술 방법을 개발했습니다. 배달 경로는 일반적으로 사용되는 내부 - 양수 주입보다 태아 마우스 폐를 타겟으로 더 효율적입니다. 이 절차는 마우스 모델에서 설명되지 않은 날짜로되어 있습니다.

태아 마우스 모델에서 Bioactive 에이전트의 Intratracheal 관리를위한 소설 외과 접근

이 비디오는 삽관 및 폐엽에 박테리아 현탁액 설치를 통해 면역 능력이 있는 설치류 모델에서 폐 감염이 확립되는 것을 보여줍니다. 이 모델은 면역 능력이 있는 동물에서 항균 효능 연구를 가능하게 합니다.

면역 역량이 있는 설치류 모델에서 폐렴 연쇄상구균의 기관지 내 주입

신경 줄기 세포를 전달하는 방법, 용액 또는 현탁액을 주입하기 위한 적응성, 일반적인 경동맥을 통해 (마우스) 또는 외부 경동맥 (쥐) 허혈성 뇌졸중 후보고된다. 주입된 세포는 뇌 의 자당종 전체에 광범위하게 분포되며 전달 후 최대 30d까지 검출될 수 있다.

쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램

신생아 설치류의 기관에 약물을 직접 주입하는이 기술은 국소 투여 약물 또는 생물학이 신생아 폐 질환에 미치는 영향을 연구하는 데 중요합니다. 추가적으로, 이 방법은 또한 동물 모델에서 폐 손상을 유도하는데 사용될 수 있다.

폐 질환을 치료하기 위해 신생아 설치류에 약물을 기관 내 점적하는 최소 침습적 방법

이 방법은 세포 현탁액에 의해 야기된 세포 주입 도중 어떤 중요한 침습도 삭제한다.

침습을 최소화하는 새로운 세포 주입 방법

살아있는 쥐의 뇌에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하는 방법이 여기에 실험적으로 자세히 제시되어 있습니다. 그것은 그들의 웰빙을 손상시키지 않고 동일한 동물로부터 이러한 세포를 여러 번 수집할 수 있습니다.

살아있는 쥐에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하기 위한 "뇌 착유" 방법

이 연구는 중증 대동맥 협착증 또는 저형성 좌심 증후군과 같은 선천성 심장 결함에서 볼 수 있는 내피에서 중간엽으로의 전이 유도 섬유증의 동물 모델을 제시하여 상세한 조직학적 조직 평가, 조절 신호 경로 식별 및 치료 옵션 테스트를 가능하게 합니다.

내피에서 중간엽으로의 전환 연구를 위한 신생아 이종성 쥐 심장 이식 모델

세포 요법은 전구 세포를 사용하여 손상된 조직을 복구하고 폐 기능을 개선함으로써 폐 섬유증에 대한 유망한 중재를 제공합니다. 이미징이 세포 통합을 추적하는 데 중추적인 역할을 하기 때문에 여기에서는 마우스 모델에서 폐 섬유증에 대한 세포 요법의 자기 입자 이미징 유도 생체 내 추적에 대해 설명합니다.

자기 입자 이미징을 사용한 폐 섬유증에 대한 이식된 원위 폐 상피 전구 세포의 이미지 유도 생체 내 추적

배우세요 신생아 쥐에서 중간엽 기질세포(MSCs)를 기관내 주입하는 방법을. 이 기술은 폐 질환 치료 효과를 평가하는 비용 효율적인 연구 모델을 제공합니다.

신생아 쥐 기간에 줄기 세포의 내 치 통 주입

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