독실성 신경절 뉴런의 고립과 문화

닭 섬모 신경절은, 코로이드 균열의 시신경에 인접한 눈의 후방 부분에 국한된 구조이다. 그리고 주실 신경절 신경절 뉴런은 부교감 신경계에 속하며, 콜린성 뉴런이므로 콜린성 시냅스를 설정할 수 있습니다. 섬모 신경절은 구조적으로 그리고 기능적으로 구별되는 섬모 성 신경 및 choroidal 뉴런의 거대한 인구로 구성됩니다.

그래서 섬모 뉴런은 내면의 안구 근육, 그리고 choroidal 뉴런은 눈의 기분 근육을 내면으로 바침합니다. 그리고 문화의 첫 날에 는, 섬모 성 신경절 신경절 뉴런은 다극성 형태를 제시하고, 그 후에, 그들은 중성염 중 하나가 확장되고 축을 형성하는 단극성 상태로 전환하기 시작합니다. 섬광 신경절 뉴런을 사용하여 가장 일반적인 연구 중 하나는, 신경 질주 시냅스의 연구입니다, 이는 콜린성 시냅스이며, 섬모 신경절 뉴런의 사용은 이전 모델에 비해 좋은 대안이되었다, 이전 모델에 비해, 때문에 뉴런 인구가 얻은, 모든 뉴런은 조랑말과 함께 할 수 있습니다, 이러한 식으로 그들은 기능성. , 우리가 신경 인구와 함께 작업 할 때 발생하지 않습니다, 그 완전히 콜린성 아니다.

섬모 신경절의 식별 및 해부는 처음으로 그것을하는 누군가를 위해 아주 도전적일 수 있습니다, 그래서 여기에서 우리는 섬모 신경절의 적당한 식별 그리고 해부, 뿐만 아니라 이 뉴런의 성공적인 문화에 대한 지침에 대한 단계 프로토콜에 의해 단계를 제공합니다. 커버립의 준비를 위해, 당신은 13 밀리미터 유리 커버립, 산성 내성 용기, 65 % 질산, 핀셋, 밀리 -Q 물, 75 %에탄올 및 궤도 셰이커가 필요합니다. 기본 문화에 대한 커버립의 준비는 절차 이틀 전에 수행해야합니다.

원하는 수의 유리 커버립을 산성 내성 용기 안에 넣고 모든 커버립이 덮일 때까지 65%의 질산을 추가합니다. 컨테이너를 궤도 셰이커에 넣고 동요가 있는 실온에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 조심스럽게 질산을 제거하고 재사용에 대한 별.

커버립을 씻고 용기에 밀리큐 물을 넣습니다. 다시 한번, 30 분 동안 교반을 배치, 세척 용액을 폐기하고,이 과정을 다섯 번 반복. 75%에탄올을 사용하여 커버립을 두 번 헹구습니다.

알루미늄 호일로 덮인 금속 랙에 개별 커버립을 조심스럽게 분리하고 놓고 50도에서 10-15분 동안 또는 완전히 건조할 때까지 배양합니다. UV 광의 커버립을 10-15분 동안 살균합니다. 커버립을 코팅하려면 멸균 유리 커버립, 멸균 유리 커버립, 24웰 플레이트, 멸균 핀셋, 밀리리터 PDL 용액 당 0.1 밀리그램, 멸균 수, 밀리리터 라미닌 솔루션 당 10 마이크로그램, 일반 신경물질 배지 및 섬광 신경절 이퍼퍼가 필요합니다.

커버립의 코팅은 시술 전날 수행해야합니다. 멸균 트위저를 사용하여 24-Well 플레이트의 각 웰에 하나의 커버슬립을 넣고, 밀리리터당 0.1 밀리그램의 농도로 500 마이크로리터의 폴리 투석 용액을 추가하고, 하룻밤 사이에 37도에서 배양합니다. 다음 날, 커버립을 멸균물로 세 번 씻고, 물을 버리고, 각 웰에 밀리리터당 10 마이크로그램의 농도로 라미닌 용액의 350 마이크로리터를 추가합니다.

인큐베이터에 2시간 동안 37도에 놓습니다. 이 시간 후, 그리고 세포 도금 전에, 라미닌 용액을 제거하고, 일반 신경 물질 매체의 300 마이크로 리터로 두 번 세척. 300 마이크로리터의 완전한 매체를 추가하고, 세포를 플레이트 할 준비가 될 때까지 37도 및 5 % CO2에서 인큐베이터에 놓습니다.

해부 절차의 경우, 배아 7일째에 닭알, 75%에탄올, 해부 집게 번호 545 및 번호 55, 가위, 숟가락, 검은 바닥과 얼음 차가운 HBSS 용액을 가진 해부 페트리 접시가 필요합니다. 75%에탄올로 모든 해부 도구를 소독해야 합니다. 계란은 달걀 인큐베이터에서 7 일 동안 37.7도또는 다른 원하는 배아 단계에서 배양되기 전에 16도에서 보관해야합니다.

시술 당일, 인큐베이터에서 계란을 제거하고 75 %의 에탄올로 계란을 스프레이하십시오. 가위를 사용하여 계란의 상단을 얻고 조심스럽게 숟가락을 사용하여 엠브로이를 꺼내. 배아를 얼음 차가운 HBSS 용액을 가진 페트리 접시에 놓고 목 부위를 절단하여 머리를 몸과 즉시 분리합니다.

그런 다음 깨끗한 얼음 차가운 HBSS 솔루션으로 새로운 페트리 접시에 머리를 옮춥시게 합니다. 배아가 계란에서 제거되자마자 세포 사멸을 담당하는 프로테아이를 생성할 수 있습니다. 따라서 배아가 세포 사멸을 최소화하기 위해 알 바깥에 있으면 가능한 한 빨리 몸에서 머리를 분리하는 것이 중요합니다.

또한 얼음 차가운 HBSS 용액에서 배아의 머리를 유지하는 것이 매우 중요합니다. 배아 머리를 들고 병아리의 부리에 고정한 다음 눈 주위의 얇은 피부 층을 제거하기 시작합니다. 조심스럽게 머리에서 부드럽게 회전하여 눈을 제거합니다.

그리고 병아리의 머리에서 눈을 분리하는 동안, 시신경이 절제되는 것을 주목하십시오. 후방 측에서 눈을 떼지 못하고, 센서 시신경과 코로이드 균열에 인접한 섬광 신경절을 주목한다. 사전 신경은 여전히 섬모 신경절에 부착 될 수 있습니다, 그것의 식별을 촉진.

각 눈에서 섬모 신경절을 해부하고 과도한 조직을 제거하여 아주 잘 청소하십시오. 해부된 담관을 얼음 위에 HBSS 용액을 장착한 페트리 접시에 옮기. 밀리리터 당 약 100만 개의 세포의 수율을 갖기 위해서는 약 70개의 신경질량을 해부해야 하며, 또한 세포 집단이 얻어지고, 비신경세포도 있고, 비신경세포의 수를 감소시키고, 또한 중성구 집단의 순도를 높이기 위해서는 매우 잘 청결하는 것이 중요하다. , 모든 초과 조직을 제거합니다.

조직 해리를 위해 24-Well 플레이트, 0.1% tripsin 용액, 불완전한 섬모 신경질 매체, 화재 광택 유리 파스퇴르 파이펫 및 플라스틱 파스퇴르 파이펫이 필요합니다. 멸균 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 미리 적재하고, 모든 섬모 신경을 15 ML 튜브로 수집하고, 200 Gs.신중히 2분 동안 원심분리기를 수집하여, 저온 살균기 파이펫을 사용하여 모든 HBSS 매체를 제거한 다음, 펠릿에 가까울 때 마이크로 파이펫을 사용합니다. 0.1%의 트립신 용액 1밀리리터를 넣고 수조에서 37도에서 20분 동안 배양합니다.

2분 동안 원심분리기는 200 Gs.즉시 트립신 용액을 제거하고 불완전한 매체의 1밀리리터를 추가합니다. 불완전한 매체의 혈청은 트립신의 활동을 즉시 중단합니다. 200 Gs에서 2 분 동안 원심 분리기를 제거하고 모든 매체를 제거합니다.

완전한 배지의 500 마이크로리터를 추가하고 P1000 마이크로 파이프를 사용하여 조직 해리를 시작합니다. 위아래로 파이펫팅으로 시작하여 10~15회, 불을 연마한 유리 저구부 파이펫으로 전환한 다음, 파이펫을 10~15회 위아래로 바꿉을 피펫으로 전환합니다. 세포 현탁액은 성공적인 조직 해리의 표시로 흐리게되어야한다.

세포를 해리시키는 데 필요한 부피는 이쪽에서 얻은 섬모 간리아의 수와 펠릿 크기에 따라 달라집니다. 조직을 해리하기 위해 위아래로 파이프를 할 때, 형성 기포를 피하는 것이 중요하며, 이것은 세포 손실을 최소화할 것이다. 세포를 다시 중단한 후 도금될 때까지 세포 현탁액을 얼음 위에 둘 수 있습니다.

노이바우어 챔버에서 트라이판 블루 용액을 사용하여 세포 밀도를 결정합니다. 5FTU를 가진 완전한 매체에서 세포 현탁액을 납으로, 원하는 밀도및 플레이트당 500 마이크로리터의 세포. 37도 및 5 %의 CO2에서 세포를 배양합니다.

매일 우리의 문화를 확인하고 세포의 발달을 따라야합니다. Ciliary 신경리아 세포는 체외에서 아주 빨리 개발하고, 하루 후에, 우리는 이미 세포 바디에서 연장하는 몇몇 중성염을 볼 수 있습니다. 시험관내 7~8일 후에, 신경망은 아주 잘 확립되고, 세포는 적어도 15 일 동안 유지될 수 있다.

시험관에서 하루 후, 섬모 신경절 뉴런은 다극성 신화를 보여줍니다. 그러나, 뉴라이트 확장은 뉴런에서 급속하게 발생하여 이미 24시간 후에 뉴런 네트워크를 확립했다. 체외에서, 섬모 신경절 뉴런은 눈에 있는 근육의 내분화를 책임집니다.

그래서, 이러한 신경 배양, 신경 근육 시 냅 스의 연구에 대 한 매우 적합. 이를 위해, 섬모 신경절 신경세포는 근육 세포의 상단에 도금될 수 있습니다. 여기서, 우리는 눈 V7 병아리 펙트랄 근육 뉴런 위에, 눈 유리체, CG 뉴런의 성공적인 문화를 보여줍니다.

시냅스 소포 마커, SV2는 CG 뉴런 축슨과 근육 섬유 사이에 확립된 활성 시냅스를 나타내며, 다중 핵에 의해 용이하게 식별된다. 이 프로토콜로 얻은 Ciliary 신경절 뉴런은 면역 세포 화학, 전기 생리학 및 생존 에세이에 적합합니다. 이 해부 프로토콜은 매우 적은 수의 뉴런을 생성하지만 제대로 수행하면 해신경 뉴런의 순수한 인구를 제공 할 것입니다.

각 중추는 매우 잘 청소되고 과잉 조직이 제거되는 것이 매우 중요합니다. 이를 위해, 고품질 의 기구를 사용 해야 합니다., 그래서이 조직은 비 신경 세포에 의해 오염을 방지 하기 위해 제거 될 수 있습니다. 배아의 나이는 우리의 프로토콜의 성공을 결정합니다.

이상적으로, 해부는 E7과 E8 사이에서 수행되어야 합니다. 이 시점에서, 시험관 내에서 일반적으로 발생하는 발달 세포 사멸은 아직 발생하지 않았기 때문에 이 시점은 매우 중요합니다. 이러한 비신경 세포의 오염을 최소화하기 위해 배양 배지에서 5FTU를 사용하여 신경교 세포와 섬유아세포의 성장을 최소화합니다. 이 세포 모형은 nueromusclar 질병을 공부하기 위한 훌륭한 대안을 제공합니다.

이 프로토콜에 기초하여, 추가 과학적 질문은, 예를 들어, 특정 탄산염및 특정 단백질의 하위 세포 국소화가 시냅스 형성 및 기능을 조절하는 방법 등을 다룰 수 있다. 또한 신경 근육 질환의 연구와 같은 추가 질문을 해결하기 위해 신경 근육 공동 문화를 확립하는 것은 매우 쉽습니다.