라이브 이미징을 위한 피브린 혈전을 가진 드로소필라 조직의 정화 응용 프로그램

이 프로토콜은 피브린 혈전을 사용한 샘플 고정을 설명했습니다. 샘플을 커버 슬립 표면의 배양 배지를 함유한 피브리노겐 한 방울로 옮긴 후 트롬빈을 첨가하여 중합을 유도합니다. 해부 현미경에서 브러시를 사용하여 L3 유충을 PBS가 포함된 9웰 붕규산 유리 접시로 옮깁니다.

유충에서 대부분의 파리 먹이를 분리하기 위해 저어주고 배양 배지가 들어 있는 다른 우물로 옮깁니다. 집게를 사용하여 몸 길이의 중간에 있는 전체 직경에 걸쳐 유충을 잡고 200마이크로리터의 신선한 배양 배지가 들어 있는 붕규산 플레이트의 다른 우물로 옮깁니다. 유충을 풀어주지 마십시오.

유충을 전체 직경에 걸쳐 반으로 자르려면 집게 끝의 측면 움직임으로 잡은 부분을 갈거나 유충을 잡고 있는 두 집게 끝 사이에 다른 집게 한 쌍의 한 끝을 밀어 넣습니다. 집게를 사용하여 유충의 표피를 잡고 다른 집게를 사용하여 뇌를 당기지 않고 표피를 떼어냅니다. 뇌에서 비롯된 신경이 보이고 뇌와 입 부분을 연결하는 기관에 접근할 수 있을 때까지 이 작업을 반복합니다.

뇌에서 비롯된 신경을 겸자로 잡고 다른 쌍의 집게로 뇌와 입 부분 사이의 연결을 끊고 뇌와 큐티클의 나머지 부분을 분리합니다. 복부 신경삭에서 나오는 축삭돌기를 잡고 주변 장기를 뇌에서 부드럽게 잡아당겨 뽑습니다. 그런 다음 다른 한 쌍의 집게로 눈, 상상 디스크, 뇌 사이의 연결을 잡고 뇌를 당기지 않고 이 연결을 끊습니다.

뇌에 다른 조직이 적절히 제거되어 있고 손상되지 않았는지 확인해야 합니다. 뇌가 손상의 징후를 보이면 폐기하십시오. P20으로 코팅 용액을 피펫으로 피펫 투입하여 피펫 팁을 코팅한 다음 코팅된 팁과 3마이크로리터의 배지로 뇌를 흡인하고 200마이크로리터의 청정 배양 배지를 포함하는 다른 웰에서 피펫으로 배출합니다.

충분한 뇌가 해부될 때까지 이 과정을 반복하고, 때때로 해부가 수행되는 우물의 배양 배지를 교체합니다. 코팅된 팁이 있는 P20 피펫을 사용하여 절개된 뇌를 200마이크로리터의 배양 배지와 피브리노겐이 들어 있는 붕규산 플레이트의 다른 웰로 옮깁니다. 9마이크로리터의 배양 배지 및 피브리노겐과 함께 하나의 뇌를 흡인합니다.

팁의 끝이 세포 배양 접시의 커버 유리 바닥에 거의 닿을 때까지 피펫 팁을 나온 직후 배양 배지가 커버 슬립에 닿도록 내용물을 피펫으로 배출합니다. 한 쌍의 집게의 한쪽 끝 또는 닫힌 집게를 사용하여 배양 배지와 피브리노겐 방울 내에서 뇌를 부드럽게 밀어 넣고 배치합니다. 뇌의 복부 부분을 영상화해야 하는 경우, 피브리노겐 응고를 유도하여 혈전 내에서 뇌의 방향을 적절하게 잡습니다.

뇌를 드롭의 한쪽으로 밀어 넣습니다. 피펫 팁으로 뇌의 반대쪽에 있는 방울의 가장자리를 만지고 1마이크로리터의 트롬빈을 추가합니다. 피브리노겐이 중합을 시작하여 방울의 한쪽에 탁한 침전물이 형성될 때까지 1-2분 동안 기다린 다음, 뇌를 부드럽게 밀어 넣고 피브린 응고에 밀어 넣어 뇌를 변형시키지 않고 복부 쪽이 커버 슬립에 최대한 가깝게 되도록 합니다.

1마이크로리터의 트롬빈 용액을 피브린 응고에 끼워 넣지 않고 뇌 측면에 가깝게 피펫으로 배출합니다. 두 번째 피브린 혈전이 굳을 때까지 2-3분 동안 기다린 다음 혈전의 가장자리를 눌러 뇌가 변형되지 않도록 주의하면서 커버 슬립에 더 강하게 부착되도록 합니다. 뇌가 커버 슬립에서 너무 멀리 떨어져 있는 것 같으면 피브린 혈전을 뇌에 더 가깝게 눌러 더 가까이 가져옵니다.

뇌의 등쪽 부분을 영상화하기 위해 피브린 응고를 유도하려면 뇌를 방울의 중앙에 위치시키고 등쪽 부분이 커버 슬립을 향하도록 합니다. P2 피펫을 사용하여 피펫 팁으로 뇌의 반대쪽에 있는 방울의 가장자리를 만지고 1마이크로리터의 트롬빈을 피펫으로 빼냅니다. 피브리노겐이 중합을 시작하여 탁한 섬유질 침전물이 형성될 때까지 2-3분 동안 기다린 다음 혈전의 가장자리를 눌러 뇌가 변형되지 않도록 주의하면서 커버 슬립에 더 강하게 부착되도록 합니다.

팁의 끝부분을 응고에서 약 0.5cm 위에 놓고 피브리노겐이 없는 배양 배지 390마이크로리터를 혈전 위에 부드럽게 떨어뜨립니다. 응고 측면에 배양 배지를 추가하면 커버 슬립에서 분리될 수 있으므로 첨가하지 마십시오. 여분의 트롬빈을 씻어내려면 접시에서 300마이크로리터를 제거한 다음 300마이크로리터의 깨끗한 배양 배지를 추가하여 혈전이 완전히 잠긴 상태로 유지되도록 합니다.

초점 변화를 일으키는 온도 변화를 방지하려면 시약이 포함된 용액을 배양 접시와 동일한 온도로 유지하십시오. 접시 자체를 옮기지 않고 배양 접시의 뚜껑을 제거하십시오. 쉽게 제거할 수 있도록 이미징하기 전에 35mm 접시의 뚜껑을 접시 위에 거꾸로 놓습니다.

P1000 피펫 팁을 배양 접시 내부의 배지 표면 가까이에 놓고 응고를 분리할 수 있는 강한 플럭스를 생성하지 않고 적절한 양의 시약 용액을 그 위에 부드럽게 방출합니다. 배양 접시 내에서 용액을 균질화하려면 P200 피펫을 사용하여 소량의 용액을 5회 천천히 피펫팅합니다. 배양 접시를 옮기지 않고 뚜껑을 교체하고 이미징을 재개합니다.

GFP 태그가 지정된 바주카포를 발현하는 피브린 고정 유충 뇌에 NAPP1 하나를 추가했을 때, aPKC의 아날로그 민감성 돌연변이를 가진 뇌는 신경 상피의 수축과 신경아세포와 그 자손에서 Baz의 밝은 클러스터를 보여주었습니다. 신경아세포는 타임랩스 내내 계속 분열했는데, 이는 조직이 건강하게 유지되고 있음을 나타냅니다. 그리고 뇌는 문화 매체의 변화에도 불구하고 거의 변동을 보이지 않았다.

유사하게, GFP-표지된 바주카포를 발현하는 난소에 하나의 NAPP1을 적용하면 아날로그 민감성 aPKC 돌연변이 여포 세포의 수축을 유도했지만 대조군의 수축은 유도하지 않았습니다. 측면 드리프트와 포커스 드리프트를 모두 표시하는 하이퍼 스택은 먼저 측면 드리프트에 대해 수정된 다음 포커스 드리프트를 수정하여 원래 하이퍼 스택에서 관찰된 움직임을 크게 줄였습니다. 이 프로토콜을 시도할 때, 혈전이 여전히 가단성이 있지만 뇌를 안정적으로 유지할 수 있을 만큼 충분히 단단한 상태에서 부분적으로 중합된 피브린 응고에 뇌를 밀어 넣는 것이 중요합니다.

빈 혈전을 조작하는 실험을 하고 중합하는 동안 혈전을 부드럽게 검사하여 얼마나 견고한지 확인합니다.