Name: 라이브 이미징을 위한 피브린 혈전을 가진 드로소필라 조직의 정화 응용 프로그램 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 배우세요 피브린 혈전을 이용한 드로소필라 신경 조직 고정법으로 실시간 이미징 중 표본 이동을 최소화하고 시약 첨가 및 세척이 가능한 신경과학 연구 방법을 익히세요.

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야누슈케 연구소의 작업은 웰컴 트러스트 보조금 100031/Z/12/A 및 1000032/Z/12/A에 의해 지원됩니다. 조직 화상 진찰 시설은 웰컴에서 부여 WT101468에 의해 지원됩니다.

<ol><li>Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).</li>
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<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li>
<li>Sabado, V., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+fluorescence+live+imaging+of+Drosophila+circadian+clocks+in+larval+brain+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).</li>
<li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li>
<li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li>
<li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+drosophila+neuroblast+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages.</a> PloS One. 8 (11), 79588(2013).</li>
<li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%3A+An+iIternational+Journal+On+the+Molecular%2C+Supramolecular+and+Evolutionary+Aspects+of+Chromosome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).</li>
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<li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li>
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<li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li>
<li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745(2018).</li>
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전체 마운트 D. 멜라노가스터 애벌레 뇌의 라이브 이미징은 생리적 맥락에 가까운 조건에서 비대칭 신경 줄기 세포 분열을 관찰 할 수있는 기회를 제공합니다. 우리의 프로토콜의 첫 번째 부분은 애벌레 뇌의 해부에 우리의 접근 방식을 소개합니다. 이미 언급 된 바와 같이13,준비의 중요한 측면은 뇌를 손상시키지 않도록하는 것입니다. 이 것의 가장 어려운 측면은 뇌에 지나치게 당기지 않고 이웃 상상 디스크에서 뇌를 분리하는 것입니다. "당기지 않고 절단"하는 우리의 접근 방식은 한 쌍의 집게팁으로 연삭 운동을 수행하거나조직(그림 1A)사이의 연결을 유지하는 두 개의 다른 집게 팁을 따라 집게 팁을 밀어내는 반면, Lerit 등은 해부 핀으로 톱모양의 움직임을 설명하는 것입니다. 우리는 모든 접근 방식을 시도하고 자신에게 가장 적합한 것을 채택하는 실험자 조언. 또한 BSA 또는 FCS 코팅 파이펫 팁을 사용하여 절연 된 뇌를 전송하는 해부 도구보다는 권장됩니다. 코팅은 조직이 플라스틱에 달라붙는 것을 방지하고 조직이 안전하게 전달되는 동시에 항상 완전히 침지되는 동시에 전송 중에 해부 도구에 충실할 때 일시적인 변형을 적용하지 않고 완전히 침지할 수 있습니다. 코팅 된 팁은 한 번에 여러 뇌의 전송을 허용하는 다른 장점이 있습니다, 이는 특정 매체 내에서 샘플의 거주 시간을 제어하는 것이 중요 할 때 특히 유용합니다; 그들은 다른 조직의 전송에 적합, 심지어 깨지기 쉬운 것 들, 예를 들어, 지방 시체; 더 큰 팁을 사용하거나 팁의 극단을 절단하여 다양한 샘플 크기를 수용할 수 있습니다.
다음으로, 이 프로토콜은 문화 접시의 표지 슬립에 애벌레 두뇌를 고정하기 위해 피브리노겐 응고의 사용을 설명합니다. 뇌는 배양 배지 + 피브리노겐의 한 방울 내에서 지향되며, 그 후 응고는 Thrombin의 첨가에 의해 유도됩니다. 피브린 형성은 점진적이며, 필요한 경우 시료의 방향을 미세 조정할 수 있는 시간 창을제공한다(도 2C). 우리가 애벌레 두뇌의 경우에 대하여 조언하는 견본의 약간 압축이 필요한 경우에 - 또한 단계 3.4.4 및 3.5.2 도중 견본에 더 많거나 더 가깝게 응고를 눌러 미세하게 조정될 수 있습니다. 이 피브리노겐응고의 주요 장점은 뇌가 가스 투과성 멤브레인과 커버슬립 사이에 장착된 Lerit 외.에 기술된 프로토콜을 통해 응고하는, 살아있는 화상 진찰 도중 배양 매체를 대체하는 기능입니다. 우리의 프로토콜을 통해 가스 투과성 멤브레인을 사용하는 가능한 장점은 뇌가 응고 및 일부 매체에 의해 공기에서 분리되기 때문에 우리의 접근 방식에 더 제한 될 수있는 샘플의 최적의 산소화를 제공한다는 것입니다. 이러한 이유로 문화접시 내 배양 배지의 양을 평가하지는 않았지만 혈전을 완전히 몰입시키면서 혈전 위에 배양 배지의 양을 제한하는 것이 좋습니다.
혈전조작이 실험적으로 어렵고 시간이 많이 소요될 수 있으므로 실험자가 샘플 없이 혈전을 조작하는 것이 좋습니다. 커버슬립에 배양 배지 + 피브리노겐의 방울의 양을 조절, 피브리노겐의 농도 또는 혈소르빈의 부피 및 농도는 준비를 쉽게 하는 데 도움이 될 수 있으며 다른 유형의 조직에 프로토콜을 조정할 때 중요할 수 있습니다. 혈전을 조작하는 충분한 경험을 가지고 있으면 방향을 미세 조정하는 것이 복잡하지만 필요한 경우 여러 뇌를 하나의 응고에 고정할 수 있습니다. 여러 혈전은 커버슬립상에 형성될 수 있으며, 예를 들어 상이한 유전자형의 이미지 샘플을 허용한다. 다른 혈전을 덮고 있는 배양 매체의 방울을 혼합하기 위해 절대로 복용해야 하지만 동일한 커버슬립에 다른 혈전을 다른 문화 매체에 노출시킬 수도 있습니다. 애벌레 뇌가 고정되고 라이브 이미징을 위한 준비가 되면, 과도한 광손상을 피하기 위해 Lerit 외13의 권고사항을 따르는 것이 좋습니다. 우리는 단지 단계 인큐베이터와 라이브 이미징 동안 25 °C에서 뇌를 유지하는 뿐만 아니라, 이미징의 시작 전에 적어도 30 분 동안이 단계를 예열하기 위해 이러한 권장 사항에 추가합니다. 우리의 손에, 체계적으로 그렇게하지 못하면 강한 초점 드리프트를 초래한다.
그것은 상호 연관된 현미경 검사법을 수행하고 살아있는 화상 진찰 후에 견본을 고치고 면역스테인을 능력을 발휘할 수 있다는 것을 몇몇 문맥에서 유리할 수 있습니다. 그러나, Fibrin 혈전을 사용 하 여 제한은 기계적으로 그것을 손상 하지 않고 혈전에서 뇌를 분리 하는 것은 거의 불가능하다. 이러한 한계를 극복하는 가능한 방법은 플라스민으로 피브린 혈전을 저하시키거나 피브린중합화를허용하는 손잡이를 모방한 펩타이드를 첨가하여 혈전 분해를 유도하는 방법을 개발하는 것이다. 우리는 일반적으로 단일 세포에서 200 μM 긴 조직에 이르기까지 샘플에 Fibrin 혈전을 사용하지만, 우리는 또한 성공적으로 3mm 폭 이상 성인 범블비에서 혈전및 이미지 뇌에 고정 할 수 있습니다. 혈전에서 고정할 수 있는 샘플 크기의 상한은 계속 결정되어야 한다. 마찬가지로, 우리는 일반적으로 4 5 시간 동안 시료를 이미지 고정하지만, 우리는 성공적으로 혈전이 적어도 장기 생존을 방해하지 않는다는 것을 나타내는, 최대 3 일 동안 기본 문화에서 신경 폭발을 이미지. 반대로, 혈전은 이러한 목적을 위해 연동 펌프와 같은 장치에 대한 필요 없이 장기간 이미징을 위한 요구 사항인 매체의 정기적인 교체를 용이하게 할 수 있다. 우리는 피브린 혈전의 투과성 매개 변수를 측정하지 않은 동안, 혈전의 섬유 질 젤 같은 특성은 세포 투과성 분자에 의해 침투 할 것으로 보인다. 우리는 세포 생물학에 사용되는 Latrunculin A, Colcemid 또는 1-NAPP1, HALO 태그 리간드 및 세포 생물학에 사용되는 다른 표준 염료가 아무문제없이 피브린 응고의 세포에 도달하고 지금까지 혈전에 의해 유지 될 분자를 발생하지 않은 것으로 나타났습니다, 그러나, 경험적으로 테스트 할 필요가 있는 가능성입니다.
결론적으로, Fibrin 혈전을 사용하면 살아있는 조직을 라이브 이미징을 위한 고정 장치를 구현하기가 안정적이고 비교적 쉽습니다. 측면 표류를 제한하는 그것의 유용성을 넘어, 살아있는 화상 진찰 도중 배양 매체를 변경하는 기능은 D. melanogaster 신경 폭발의 비대칭 세포 분열을 공부하는 우리의 화학 유전학 접근에 귀중한 입증되었습니다21. 우리는 이 기술이 화학 유전학을 관련시키는 경우에 특히, 다른 조직의 넓은 범위에서 연구 결과, 특히, 예를 들면, 단백질 자기 라벨링29에유익할 것이라는 점을 예상합니다.
우리의 MultiHyperStackReg 매크로는 터보 레그 이미지J 플러그인에 의존, 이는 연속 프레임 또는 스택의 조각을 정렬, 멀티 스택Reg ImageJ 플러그인, 이는 다른 스택에 변환을 적용 할 수 있습니다. MultiHyperStackReg는 단순히 하이퍼 스택 (적어도 4 차원스택 스택)에 이러한 변환을 적용 할 수 있습니다. MultiHyperStackReg의 사용으로, 우리가 설명하듯이, 많은 작업이 필요하고 꽤 많은 시간을 소비 할 수 있습니다, 우리는 또한 자동 하이퍼 스택Reg 매크로를 썼다, 이는 자동으로 단계 6.2 및 6.3에 설명 된 모든 단계를 수행. 그러나, 멀티 하이퍼 스택Reg와는 달리, AutoHyperStackReg는 현재이 스택의 하위 영역을 기반으로 스택의 정렬을 계산 할 수있는 가능성이 부족, 우리가 발견 한 옵션은 때때로 만족스러운 정렬에 대한 중요하다. AutoHyperStackReg의 또 다른 제한은 사용이 TurboReg 및 MultiStackReg에서 제안한 다른 변환이 아닌 번역으로 제한되는 반면, MultiHyperStackReg는 사용자가 필요로 하는 경우 하이퍼 스택에 적용할 수 있다는 것입니다. 향후 릴리스는 이러한 기능을 구현하며 GitHub30에서사용할 수 있습니다. 마지막으로, 당사의 회전 라인칸 매크로는 시간이 지남에 따라 피질이 위치 또는 방향을 변경하더라도 시간 경과시 피질 신호를 신속하게 측정할 수 있는 쉬운 방법을 제공합니다. 추적 모드또는 비추적 모드가 분석에 가장 적합한지 여부는 피질 신호의 품질과 일관성에 따라 달라집니다. 추적 모드는 사용자가 피질이 모든 시간 지점에 대해 어디에 있는지 고려할 필요가 없으며 시간이 지남에 따라 위치 및 방향의 큰 변화를 수용 할 수 있기 때문에 사용하기 쉽습니다. 그러나, 피질 신호가 전체 영화 동안 검출을 위해 충분히 강한 경우에만 적합하다: 피질(예를 들어, 피질에 가까운 밝은 세포질 구획)보다 다른 것을 검출하지 못하면 다음 의 모든 시간점에 대한 검출을 손상시킬 수 있습니다(예를 들어, 세포질 구획은 피질과 피질 선이 피질에서 멀리 이동하며 피질 선이 경과할 수 있습니다). 비추적 모드는 검출이 사용자가 원래 그려진 선으로 제한되기 때문에 이러한 함정을 갖지 못합니다(예를 들어, 밝은 세포질 구획은 몇 시간 시점에서 검출이 실패할 수 있지만, 세포질 구획이 검출 영역에서 멀어짐에 따라, 피질의 적절한 검출은 피질 위치 또는 방향 방향이 시간이 지남에 따라 많이 변하는 경우 잘 동작하지 않는다. 추적 모드에 대해 개발될 다음 기능(GitHub30에서사용할 수 있음)은 지정된 시간점을 분석하고 참조 타임포인트를 정의하는 옵션이 될 것이며, 그 이후에는 감지가 수행되므로 사용자가 문제가 있는 시간점을 최소한 피할 수 있습니다.

Drosophila는 생물학 질문의 광대 한 범위를 연구 하는 중요 한 모델 시스템 계속 하 고 수십 년 동안 많은 분야에서 지식을 발전에 탁월 한. 특히 눈에 띄는 한 가지 특징은 라이브 이미징에 특히 적합하다는 것입니다. 세포 외 과정 또는 세포 및 조직의 행동을 실시간으로 모니터링 하는 능력은 세포 및 발달 생물학에 관련 된 주요 개념을 생성에 기여 하는 데 계속. 많은 성공적인 프로토콜은 살아있는 견본및 형광 분자의 행동을 연구하기 위하여 살아 있고 건강한 Drosophila 견본을 유지하기 위하여 다른 단에 의해 개발되었습니다. 가상 디스크1,2,애벌레 뇌3,4,5,6,또는 성인 여성의 계란 챔버7,8,9,또는 성인장(10)과 같은 비행으로부터의 장기 및 조직은 예를 들어 시간 경과 현미경으로 이미징을 위한 배양에 보관될 수 있다. 라이브 이미징의 주요 과제는 시편이 기계적 충격에 민감할 수 있는 샘플 무결성을 손상시키지 않으면서 최적의 해상도와 움직이지 않도록 이미징 표면에 가깝게 유지되도록 하는 것입니다. Drosophila 애벌레 두뇌에 있는 신경 폭발 또는 뉴런에게 불린 신경 줄기 세포를 공부하기 위하여는, 예를 들면, 화상 진찰 표면에 가까운 견본을 지키는 것은 밀봉한 화상 진찰실11,12,13에서배양 매체로 그(것)들을 커버해서 달성될 수 있습니다. 그러나 이러한 접근 방식은 미디어 교환을 쉽게 허용하지 않으므로 기동을 위한 실험 공간을 제한합니다. 대안적으로, 샘플은 세포의 접착력을 증가시키고 잠재적으로 미디어 교환을 허용하는 개방형 배양 접시에서 다점 방문 현미경 및 확장 된 라이브 셀 이미징을 허용하기 위해 치료 된 커버립에 배치 할 수 있지만 미디어 교환14,15동안 샘플 드리프트 또는 손실을 방지하기위한 쉬운 수단을 제공하지 않는다.
원래 살아있는 크레인 플라이 정자 세포16에서 meiosis를 연구하기 위해 개발 된 피브린 응고 방법은 이러한 문제를 극복하기위해 특별히 적합하다. 피브리노겐은 관련 배양 배지에 용해되고, 혈소판이 첨가되기 전에 적절한 유리 표면 이미징 챔버에 이 용액의 한 방울에 배치되고 지향되며, 그 결과 용해성 피브린 응고, 유리 표면 및 시료에 부착되는 끈적끈적한 섬유질 메쉬는 배양 배지에 대한 샘플의 접근을 보장한다. 그런 다음 배지는 응고 또는 샘플 위치를 왜곡하지 않고 교환할 수 있습니다. 이미징 중 배양 배지 교환은, 예를 들어, 억제제가 본래의 방법에서와 같이 추가되거나 세척 또는 펄스 추적 실험에 추가되거나 세포와 조직을 제자리에 유지하면서 살아있는 세포 이미징 중에 형광염료를 첨가해야 할 때 바람직하다. 피브린 혈전은 Drosophila 조직의 화상 진찰뿐만 아니라 개별 세포(13,17)에적합합니다. Fibrin 응고는 더 오리엔트 샘플을 돕기 위해 사용될 수 있으며, 그 모양이나 다른 특성으로 인해 일반적으로 피브린 응고 내의 샘플 위치와 응고 자체의 모양을 조절하여 원하는 방식으로 방향을 지정하지 않을 것입니다.
여기에서 우리는 우리의 현재 Fibrin 응고 기지를 둔 화상 진찰 방법에 대한 업데이트를 제공하고 세분화 기반 의 이미지 분석을위한 도구를 제공하고 개발 비행 뇌에서 신경 폭발 부문을 연구하는이 방법의 사용에 초점을 맞추고 있습니다. 우리는 정기적으로 같은 문화 접시에 다른 혈전에서 여러 샘플을 따라 피브린 응고 방법을 사용합니다. 이를 통해 i) 중척추행동 또는 mRNA 국소화와 같은 세포형 의 이미징라이브18,19,ii) 다중점 방문 마이크로를 사용하여 동일한 이미징 설정하에서 상이한 유전자형의 약리학적 치료에 시료의 동작을 모니터링할 수 있습니다. scopy20,iii) 효소의 급성 억제의 효과를연구21 및 iv) 표적 레이저 절제시에 따라 자신의 생리환경 내 세포의 세포 분열방향의 방향을 연구하기 위해 표류를최소화(22) 트롬빈과 피브리노겐과 피브린 응고의 원치 않는 효과는 각 샘플에 대해 경험적으로 테스트해야 하지만, 본 방법은 원칙적으로 살아있는 세포 영상에 의해 분석되어야 하는 임의의 유형의 시료를 고정하기 에 적합하며 드로소필라에서 신경폭발 생물학5,19,20의여러 측면을 성공적으로 연구하는 데 사용되었지만, 또한 여성 세균선 줄기세포(23)의 세포센서 투영의 역학과 급성 aPKC 억제에 따른 극성 변화및목막세포의 급성 aPKC 억제에 따른 극성 변화.
시간 경과 형광 화상 진찰은 이 정량적인 정보를 추출하는 방법을 필요로 하는 복잡한 시간 해결된 3D 데이터 세트의 생성을 초래합니다. 여기에서 우리는 Drosophila 애벌레 두뇌 또는 개별 신경 아세포의 신경 폭발에 있는 피질 단백질을 정량화하기 위하여 개발된 세포 피질에서 다중 채널 형광의 반 자동화된 정량화를 허용하는 하이퍼 스택 및 사용자 정의 만든 ImageJ 매크로에서 표류를 위해 이용될 수 있는 ImageJ 기지를 둔24개의 매크로의 추가 발달을 기술합니다.

<table><tbody><tr><td>알부민 소 혈청, BSA</td><td>Merck</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-포도</td>당 <td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>태아 Bovie 혈청, 인간</td> 혈장 <td></td><td></td> 에서 세포 배양 Sigma F7524 <td></td></tr><tr><td>피브리노겐</td>에 적합 <td>Sigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish 세포 배양 접시 - 35mm, 23mm 웰</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>PP1 아날로그 (1NA-PP1)</td><td>Merck Millipore</td><td>529579</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 스폿 플레이트, 9개의 함몰부</td><td>Sigma</td><td>CLS722085-18EA</td><td></td></tr><tr><td>슈나이더의 곤충 매체</td><td>시그마</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>소 플라즈마에서 추출한 트롬빈</td><td>머크</td><td>T4648</td><td></td></tr></tbody></table>

라이브 이미징을 위한 피브린 혈전을 가진 드로소필라 조직의 정화 응용 프로그램

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila는 생물학적 질문의 광대 한 범위를 연구 하는 중요 한 모델 시스템. 상상 디스크, 성여성의 애벌레 뇌 또는 계란 챔버 또는 성인 장의 알방과 같은 비행의 다른 발달 단계에서 다양한 장기와 조직은 추출 및 시간 경과 현미경으로 이미징을위한 문화에서 보관 할 수 있습니다, 세포 및 발달 생물학에 귀중한 통찰력을 제공. 여기에서, 우리는 Drosophila 애벌레 두뇌의 해부에 대한 우리의 현재 프로토콜을 자세히 설명하고, Fibrin 혈전을 사용하여 유리 커버 슬립에 애벌레 두뇌 및 기타 조직을 고정하고 방향을 지정하기위한 현재의 접근 법을 제시합니다. 이 고정 방법은 배양 매체에 피브리노겐과 트롬빈을 첨가해야만 한다. 동일한 배양 접시에 여러 샘플의 반전 된 현미경에 고해상도 시간 경과 이미징에 적합하며, 다점 방문 현미경의 현미경 단계의 움직임으로 자주 발생하는 측면 표류를 최소화하고 이미징 과정에서 시약의 추가 및 제거를 허용합니다. 또한 당사는 표류를 위해 일상적으로 사용하고 시간 경과 분석에서 특정 정량 정보를 추출하고 처리하는 데 일상적으로 사용하는 맞춤형 매크로를 제시합니다.

라이브 이미징 중 피브린 혈전 및 문화 매체 교환을 통해 드로소필라 조직의 고정. 2단계(도1)에제시된 절차에 따라 해부되고 3단계(그림2)에제시된 절차에 따라 피브린 혈전에서 고정화된 후, GFP 태그바주카(Baz:GFP)를 발현하는 애벌레 뇌, 극성 단백질 파-3의 플라이 직교로, 30분 동안 포심형 을 이미지화하였다. Baz:GFP는 작은 ATP 아날로그 1-NAPP120을추가하여 비정형 단백질 키나아제 C(aPKC)의 급성 억제를 허용하는 알렐인 APKCas4와결합된다. 따라서 1-NAPP1은 4단계에서 제시된 절차에 따라 배양 배지에 첨가되었고, 2.5h를 위해 라이브 이미징이 재개되었다. 키나아제 aPKC의 야생형 버전을 운반하는 제어 뇌는 ATP 아날로그에 반응하지 않았고, APKC(apkcas4)의 아날로그 민감 돌연변이를 추가로 운반하는 뇌는 신경폭발과 자손에서 바즈의 신경상피성 및 밝은 클러스터의 수축을 나타냈다(그림6, 비디오 1). 신경 폭발은 조직이 건강하게 남아 있음을 나타내는 시간 경과를 통해 분할에 계속, 뇌는 문화 매체 변화에도 불구하고 약간의 드리프트를 보여, 그들은 잘 고정되어 있음을 나타내는. 유사하게,27년에제시된 절차에 따라 해부된 후, 바즈를 표현하는 오바리오레::GFP는 피브린 혈전에서 동일한 커버슬립에 고정되어 8분 동안 이미지되었으며, 그 후 1-NAPP1의 적용으로 APkc의 수축을 유도했지만 대조군(그림7, 비디오 2).
멀티하이퍼스택레를 사용하여 측면 및 초점 드리프트를 보정합니다. 횡및 초점 드리프트(비디오3,왼쪽 패널)를 모두 표시하는 하이퍼스택은 먼저 측면 드리프트(6.2, 도 3, 비디오 3,중간 패널)에 대해 먼저 수정한 다음, 멀티스택레그 플러그인과 멀티하이퍼스택레그 매크로를 사용하여 포커스 드리프트(6.3, 도4, 비디오 3,오른쪽 패널)를 사용하여 원래 하이퍼스택에서 관찰된 움직임의 실질적인 감소를 초래하였다.
회전 라인스캔을 이용한 피질 신호 측정 Baz::GFP(녹색) 및 적외선 형광 단백질(CD4:mIFP, 빨간색)으로 태그된 막 단백질 CD4를 발현하는 신경아세포가 하나의 미토시스 중에 이미지화되었다. CD4:mIFP 신호는 라인스캔을 이용한 신경아세포의 다양한 부분에서 피질을 검출하기 위한 참조로 사용되었다(7단계, 도 5, 도 8A-C)및 Baz::GFP 신호는 검출된 위치에서 측정되었다 8D). 그들의 분열 도중, 신경 폭발은 뚜렷하고 반대 피질 도메인을 설치해서 일시적으로 편광했습니다: 정맥 극및 기저 극. Baz는 정압 극을 정의하고, 일관되게, Baz:GFP 신호는 신경 폭발의 정압 극에서 증가하고 분열 도중 기저 극에서 감소합니다(그림 8C, D). 피질의 위치는 시간경과(도 8C, 비디오 4)를통해 만족스럽게 추적하였다. Drosophila 선 및 유전자형보충표 1-2에서참조됩니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> 그림 6: 라이브 이미징 중 고정된 애벌레 뇌에 ATP 아날로그를 적용합니다. (A)바즈를 표현하는 두 개의 애벌레 뇌의 라이브 이미징:GFP는 동일한 커버슬립에 고정되어 있습니다. 배양 배지는 ATP 아날로그 1-NAPP1의 10 μM 농도로 0분에서 변경된다. 제어 뇌는 ATP 아날로그에 눈에 띄게 반응하지 않는 반면 APKC(aPKCAS4)의아날로그 민감한 돌연변이를 운반하는 뇌는 신경 폭발과 자손에서 신경 피상화증 (화살촉)과 밝은 클러스터의 수축을 표시합니다. 23 μM. 스케일 바의 깊이에 대한 33 슬라이스의 최대 강도 투영: 20 μM.(B)신경 상피성배율. 스케일 바: 10 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> 그림 7: 라이브 이미징 중에 고정된 계란 챔버에 ATP 아날로그를 적용합니다. 바즈를 표현하는 두 개의 오병의 라이브 이미징 : GFP는 동일한 커버 슬립에 고정. 배양 배지는 ATP 아날로그 1-NAPP1의 10 μM 농도로 0분에서 변경된다. 대조군 계란 챔버는 ATP 아날로그에 눈에 띄게 반응하지 않는 반면 APKC(aPKCAS4)의아날로그 민감한 돌연변이를 운반하는 계란 챔버는 결국 부착 접합의 명백한 고장으로 이어지는 상피 (화살표 헤드)의 수축을 표시합니다. 27 μM. 스케일 바의 깊이에 대한 33 슬라이스의 최대 강도 투영 : 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> 그림 8: 회전 라인스캔을 사용하여 피질 신호의 측정. (A)라이브 D. 멜라노가스터 신경 폭발 바즈를 표현 ::GFP (녹색) 및 CD4:mIFP (빨간색). 원안 선: 초기 스캐닝 라인은 측정하기 위해 다양한 피질 영역에 수직으로 추적되었습니다. 스케일 바: 5 μM.(B)피질 라인스캔을 사용하여 피질(진한 파란색 선)의 식별및 CD4:mIFP(빨간색)를 참조 채널로 식별한다. 시안 선: 피질 검출 후 신호를 측정하는 "주변 측정" 매개 변수(여기, 2픽셀)에 의해 정의된 영역입니다. 스케일 바: 2 μm.(C)시안: CD4:mIFP(빨간색)를 참조 채널로 사용하여(A)에 표시된 초기 스캐닝 라인에서 회전 라인스캔 방법에 의해 신경아세포 분열 중에 확인된 피질 영역. 스케일 바: 5 μM. 화살표: 정격 기둥. 애로우헤드: 기저기둥. (D)바즈:GFP 신호 강도의 측정은(C)에표시된 회전 라인스캔에 의해 식별된 두 개의 해당 영역에서 시간이 지남에 따라 이다. 미토시스 동안 Baz:GFP는 신경 폭발의 정압극에 일시적으로 풍부해지고 반대쪽 기저 극에서 고갈됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 1: 라이브 이미징 중 고정 된 애벌레 뇌에 미디어 교환을 적용하여 그림 6,스케일 바 : 20 μm에 제시 된 억제제추가하십시오. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank"></a>
비디오 2: 라이브 이미징 중에 고정 된 계란 챔버에 미디어 교환을 적용하여 그림 7,스케일 바 : 20 μm에 제시 된 억제제추가 : 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드하십시오.</a>
비디오 3: MultiHyperStackReg를 사용하여 측면 및 초점 드리프트를 보정합니다. 막 프로브 PH::GFP를 표현하는 신경 폭발의 라이브 이미징. Xy: 단일 초점 평면. Xz: 직교 재슬라이스. 왼쪽: 드리프트를 교정하기 전. 중간: 측면 드리프트를 보정한 후. 오른쪽: 측면 및 초점 드리프트를 보정한 후, 10 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 4: 그림 8,스케일 바: 5 μm에 제시된 회전 라인스캔을 사용하여 피질의 감지: 5 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 이미지 드로소필라 조직의 유전자형. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 2: 사용된 유전자의 기원. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
추가 코딩 파일 1: 사용된 유전자의 기원. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
추가 코딩 파일 2: 사용된 유전자의 기원. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 코딩 파일 3: 사용된 유전자의 기원. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 Fibrin 혈전을 사용하여 샘플 고정응용을 설명하고, 표류를 제한하며, 라이브 이미징 중에 시약을 첨가및 세척할 수 있도록 합니다. 시료는 커버슬립의 표면에 배양 배지를 함유하는 피브리노겐의 한 방울로 전달되며, 그 후 중합화가 혈전을 첨가하여 유도된다.

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

이 프로토콜은 피브린 혈전을 사용한 샘플 고정을 설명했습니다. 샘플을 커버 슬립 표면의 배양 배지를 함유한 피브리노겐 한 방울로 옮긴 후 트롬빈을 첨가하여 중합을 유도합니다. 해부 현미경에서 브러시를 사용하여 L3 유충을 PBS가 포함된 9웰 붕규산 유리 접시로 옮깁니다.유충에서 대부분의 파리 먹이를 분리하기 위해 저어주고 배양 배지가 들어 있는 다른 우물로 옮깁니다. 집게를 사용하여 몸 길이의 중간에 있는 전체 직경에 걸쳐 유충을 잡고 200마이크로리터의 신선한 배양 배지가 들어 있는 붕규산 플레이트의 다른 우물로 옮깁니다. 유충을 풀어주지 마십시오.유충을 전체 직경에 걸쳐 반으로 자르려면 집게 끝의 측면 움직임으로 잡은 부분을 갈거나 유충을 잡고 있는 두 집게 끝 사이에 다른 집게 한 쌍의 한 끝을 밀어 넣습니다. 집게를 사용하여 유충의 표피를 잡고 다른 집게를 사용하여 뇌를 당기지 않고 표피를 떼어냅니다. 뇌에서 비롯된 신경이 보이고 뇌와 입 부분을 연결하는 기관에 접근할 수 있을 때까지 이 작업을 반복합니다.뇌에서 비롯된 신경을 겸자로 잡고 다른 쌍의 집게로 뇌와 입 부분 사이의 연결을 끊고 뇌와 큐티클의 나머지 부분을 분리합니다. 복부 신경삭에서 나오는 축삭돌기를 잡고 주변 장기를 뇌에서 부드럽게 잡아당겨 뽑습니다. 그런 다음 다른 한 쌍의 집게로 눈, 상상 디스크, 뇌 사이의 연결을 잡고 뇌를 당기지 않고 이 연결을 끊습니다.뇌에 다른 조직이 적절히 제거되어 있고 손상되지 않았는지 확인해야 합니다. 뇌가 손상의 징후를 보이면 폐기하십시오. P20으로 코팅 용액을 피펫으로 피펫 투입하여 피펫 팁을 코팅한 다음 코팅된 팁과 3마이크로리터의 배지로 뇌를 흡인하고 200마이크로리터의 청정 배양 배지를 포함하는 다른 웰에서 피펫으로 배출합니다.충분한 뇌가 해부될 때까지 이 과정을 반복하고, 때때로 해부가 수행되는 우물의 배양 배지를 교체합니다. 코팅된 팁이 있는 P20 피펫을 사용하여 절개된 뇌를 200마이크로리터의 배양 배지와 피브리노겐이 들어 있는 붕규산 플레이트의 다른 웰로 옮깁니다. 9마이크로리터의 배양 배지 및 피브리노겐과 함께 하나의 뇌를 흡인합니다.팁의 끝이 세포 배양 접시의 커버 유리 바닥에 거의 닿을 때까지 피펫 팁을 나온 직후 배양 배지가 커버 슬립에 닿도록 내용물을 피펫으로 배출합니다. 한 쌍의 집게의 한쪽 끝 또는 닫힌 집게를 사용하여 배양 배지와 피브리노겐 방울 내에서 뇌를 부드럽게 밀어 넣고 배치합니다. 뇌의 복부 부분을 영상화해야 하는 경우, 피브리노겐 응고를 유도하여 혈전 내에서 뇌의 방향을 적절하게 잡습니다.뇌를 드롭의 한쪽으로 밀어 넣습니다. 피펫 팁으로 뇌의 반대쪽에 있는 방울의 가장자리를 만지고 1마이크로리터의 트롬빈을 추가합니다. 피브리노겐이 중합을 시작하여 방울의 한쪽에 탁한 침전물이 형성될 때까지 1-2분 동안 기다린 다음, 뇌를 부드럽게 밀어 넣고 피브린 응고에 밀어 넣어 뇌를 변형시키지 않고 복부 쪽이 커버 슬립에 최대한 가깝게 되도록 합니다.1마이크로리터의 트롬빈 용액을 피브린 응고에 끼워 넣지 않고 뇌 측면에 가깝게 피펫으로 배출합니다. 두 번째 피브린 혈전이 굳을 때까지 2-3분 동안 기다린 다음 혈전의 가장자리를 눌러 뇌가 변형되지 않도록 주의하면서 커버 슬립에 더 강하게 부착되도록 합니다. 뇌가 커버 슬립에서 너무 멀리 떨어져 있는 것 같으면 피브린 혈전을 뇌에 더 가깝게 눌러 더 가까이 가져옵니다.뇌의 등쪽 부분을 영상화하기 위해 피브린 응고를 유도하려면 뇌를 방울의 중앙에 위치시키고 등쪽 부분이 커버 슬립을 향하도록 합니다. P2 피펫을 사용하여 피펫 팁으로 뇌의 반대쪽에 있는 방울의 가장자리를 만지고 1마이크로리터의 트롬빈을 피펫으로 빼냅니다. 피브리노겐이 중합을 시작하여 탁한 섬유질 침전물이 형성될 때까지 2-3분 동안 기다린 다음 혈전의 가장자리를 눌러 뇌가 변형되지 않도록 주의하면서 커버 슬립에 더 강하게 부착되도록 합니다.팁의 끝부분을 응고에서 약 0.5cm 위에 놓고 피브리노겐이 없는 배양 배지 390마이크로리터를 혈전 위에 부드럽게 떨어뜨립니다. 응고 측면에 배양 배지를 추가하면 커버 슬립에서 분리될 수 있으므로 첨가하지 마십시오. 여분의 트롬빈을 씻어내려면 접시에서 300마이크로리터를 제거한 다음 300마이크로리터의 깨끗한 배양 배지를 추가하여 혈전이 완전히 잠긴 상태로 유지되도록 합니다.초점 변화를 일으키는 온도 변화를 방지하려면 시약이 포함된 용액을 배양 접시와 동일한 온도로 유지하십시오. 접시 자체를 옮기지 않고 배양 접시의 뚜껑을 제거하십시오. 쉽게 제거할 수 있도록 이미징하기 전에 35mm 접시의 뚜껑을 접시 위에 거꾸로 놓습니다.P1000 피펫 팁을 배양 접시 내부의 배지 표면 가까이에 놓고 응고를 분리할 수 있는 강한 플럭스를 생성하지 않고 적절한 양의 시약 용액을 그 위에 부드럽게 방출합니다. 배양 접시 내에서 용액을 균질화하려면 P200 피펫을 사용하여 소량의 용액을 5회 천천히 피펫팅합니다. 배양 접시를 옮기지 않고 뚜껑을 교체하고 이미징을 재개합니다.GFP 태그가 지정된 바주카포를 발현하는 피브린 고정 유충 뇌에 NAPP1 하나를 추가했을 때, aPKC의 아날로그 민감성 돌연변이를 가진 뇌는 신경 상피의 수축과 신경아세포와 그 자손에서 Baz의 밝은 클러스터를 보여주었습니다. 신경아세포는 타임랩스 내내 계속 분열했는데, 이는 조직이 건강하게 유지되고 있음을 나타냅니다. 그리고 뇌는 문화 매체의 변화에도 불구하고 거의 변동을 보이지 않았다.유사하게, GFP-표지된 바주카포를 발현하는 난소에 하나의 NAPP1을 적용하면 아날로그 민감성 aPKC 돌연변이 여포 세포의 수축을 유도했지만 대조군의 수축은 유도하지 않았습니다. 측면 드리프트와 포커스 드리프트를 모두 표시하는 하이퍼 스택은 먼저 측면 드리프트에 대해 수정된 다음 포커스 드리프트를 수정하여 원래 하이퍼 스택에서 관찰된 움직임을 크게 줄였습니다. 이 프로토콜을 시도할 때, 혈전이 여전히 가단성이 있지만 뇌를 안정적으로 유지할 수 있을 만큼 충분히 단단한 상태에서 부분적으로 중합된 피브린 응고에 뇌를 밀어 넣는 것이 중요합니다.빈 혈전을 조작하는 실험을 하고 중합하는 동안 혈전을 부드럽게 검사하여 얼마나 견고한지 확인합니다.

applications-immobilization-drosophila-tissues-with-fibrin-clots-for

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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라이브를 떠올리 Drosophila</em형광 염료와 함께> Glial - 신경근육학 융티온

라이브 영상 분석을위한 Drosophila의 배아를 준비, 간단한 저렴하고 효과적인 방법이 제공됩니다. 우리 프로토콜은 습도와 가스 교환을 제공하고 Drosophila의 배아를 압축하지 않습니다. 이 방법은 stereomicroscope 또는 수직 복합 현미경을 사용하여 Drosophila의 배아의 GFP 기반의 라이브 영상에 적합합니다.

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라이브 이미징 및 상해 응답의 연구에 대한 마이크로 유체 칩을 사용<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

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Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

이 프로토콜의 목표는 ex vivo 초파리 애벌레 뇌 문화를 장기 형광 시간 경과 영상 분자 circadian 리듬을 모니터링 하기 위해 최적화 설정입니다. 이 방법의 약리학 분석 응용 프로그램 또한 토론 된다.

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LarvaSPA, 장기 시간 경과 이미징을 위한 초파리 유충을 장착하는 방법

배우세요 피브린 혈전을 이용한 드로소필라 신경 조직 고정법으로 실시간 이미징 중 표본 이동을 최소화하고 시약 첨가 및 세척이 가능한 신경과학 연구 방법을 익히세요.

라이브 이미징을 위한 피브린 혈전을 가진 드로소필라 조직의 정화 응용 프로그램

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