중추 신경계에 대한 생체 내 수초화 연구를위한 삼투압 펌프 기반 약물 전달

탈수초화는 여러 중추 신경계 질환에서 발생합니다. 신뢰할 수 있는 생체 내 약물 전달 기술은 약물 검사를 재수초화하는 데 필요합니다. 이 프로토콜은 뇌실질로 직접 장기간 약물 전달을 허용하고 약물 생체 이용률을 향상시키는 삼투압 펌프 기반 방법을 설명하며 수초화 연구에 광범위하게 적용됩니다.

삼투압 펌프는 미엘린 재생 연구, 특히 반감기가 짧고 혈액 뇌 장벽 투과성이 좋지 않으며 다양한 말초 부작용이있는 약물에 큰 가치가 있습니다. 삼투압 펌프는 혈액 뇌 장벽을 우회하여 코퍼스 캘로섬에 직접 약물을 전달할 수 있으며, 이는 특히 반감기가 짧은 일부 약물의 경우 약물의 생체 이용률을 효과적으로 향상시킵니다. 시작하려면 마취 된 마우스의 머리를 치아 막대와 이어 바가있는 입체 택시 장치에 고정하십시오.

수술 부위를 제외한 동물의 몸을 덮으십시오. 메스를 사용하여 목 바닥에서 눈 사이까지 피부를 한 센티미터 길이의 중간 시상 절개하여 두개골을 노출시킵니다. 30% 과산화수소가 들어있는 면봉을 사용하여 두개골 표면을 부드럽게 닦아 두개골 구조를 시각화합니다.

치아 막대와 이어 바의 높이를 조정하여 람다 점과 브레그마 점을 같은 높이에 배치하십시오. 10 마이크로리터 및 33 게이지 주사기 바늘의 끝을 브레그마 지점에 부드럽게 놓고 X, Y 및 Z 좌표를 0으로 재설정합니다. 주사기를 주사 부위로 옮깁니다.

하나의 마이크로 리터 26 게이지와 0.45 밀리미터 주사기 바늘로 경막을 관통하지 않고 주사 부위의 두개골을 통해 작은 버 구멍을 천천히 뚫습니다. 특정 깊이에 도달 할 때까지 구멍을 통해 마이크로 리터 주사기 바늘을 뇌 조직에 천천히 삽입하십시오. 1.5 마이크로 리터의 1 % 리솔레시틴을 분당 0.5 마이크로 리터의 속도로 주입하십시오.

주사기를 꺼내기 전에 5 분 동안 기다렸다가 5-0 개의 수술 봉합사로 피부를 꿰매십시오. 수술을받은 마우스를 케이지에 혼자 놓고 수술 후 매일 마우스를 모니터링하십시오. 조직 접착제로 뇌 주입 캐뉼라의 바늘에 세 개의 깊이 조절 스페이서를 부착하여 캘로섬에 가까운 1.5 밀리미터의 주사 깊이를 달성하십시오.

시린지 바늘을 펌프 패키지로 한 밀리리터 주사기에 부착하여 삼투압 펌프를 채우고 약물을 흡인한다. 펌프를 똑바로 세운 자세로 잡으십시오. 주사기를 펌프 상단의 개구부에 삽입하고 기포를 만들지 않고 천천히 약물을 주입하십시오.

액체가 개구부에서 흘러 나올 때 주사기를 천천히 꺼냅니다. 가위 또는 펜치를 사용하여 유량 조절기에서 흰색 플랜지를 제거합니다. 흐름 중재자를 펌프에 삽입합니다.

삼투 펌프에 기포가 있는지 여부를 확인하려면 충전 전후에 삼투 펌프를 별도로 칭량하십시오. 동물의 크기에 따라 카테터를 필요한 길이로 다듬습니다. 카테터를 뇌 주입 캐뉼라에 부착하십시오.

카테터에 공기를 도입하지 않고 주사기를 사용하여 약물을 채 웁니다. 카테터를 유동 중재자에 연결하여 노출된 유량 중재자의 약 네 밀리미터를 덮도록 합니다. 채워진 펌프를 섭씨 37도에서 멸균 0.9% 식염수 또는 PBS에 적어도 네 시간에서 여섯 시간 동안 담그십시오.

구현 후 하룻밤 사이에 확장하는 것을 선호합니다. 마우스를 입체 택시 장치에 다시 고정시킵니다. 이전에 꿰매어 놓은 외과 절개를 열고 절개를 어깨 뼈까지 확장하십시오.

견갑골의 피하 결합 조직으로부터 피부를 분리하고, 지혈 펜치 또는 핀셋을 사용하여 공동을 열고 삼투 펌프를 공동에 넣습니다. 면봉으로 탈수초화 모델을 수립할 때 생성된 두개골 표면의 핀 구멍을 부드럽게 닦아내고 노출시킵니다. 핀홀을 통해 뇌 주입 캐뉼라를 수직으로 삽입하고 조직 접착제로 두개골에 고정하십시오.

한 쌍의 가위로 뇌 주입 캐뉼라 위의 이동식 탭을 떼어냅니다. 절개를 바늘로 꿰매거나 조직 접착제로 부착하십시오. 수술 후 동물을 혼자 새장에 넣으십시오.

시행을 수행 한 후 DAPI 염색은 뇌 조직의 핀홀이 백질 바로 위에 놓여 있음을 밝혀 삼투 펌프의 뇌 주입 캐뉼라를 성공적으로 구현했음을 나타냅니다. 성숙한 희소덴드로사이트 마커인 MAG 프로브와 함께 계내 혼성화 실험을 수행하였고 새로 분화된 희소돌기아교세포를 표지하기 위해 사용하였다. 그 결과, UM206 처리는 대조군보다 탈수초 영역에서 더 많은 MAG 양성 세포를 산출하였다.

탈수초화 영역의 투과 전자 현미경 검사는 대조군에 비해 UM206 처리군에서 수초화 축색돌기의 수가 증가한 것으로 나타났으며, 이는 UM206이 더 높은 수준의 재수초화를 유도함을 시사한다. 삼투압 펌프를 준비 할 때 시스템에 거품이 생기지 않도록주의하십시오.