Name: 마우스 성상세포의 분리 및 직접 뉴런 리프로그래밍 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 배우세요 마우스 중추신경계에서 성상세포를 분리하고 전사인자 발현을 통해 기능적 뉴런으로 직접 리프로그래밍하는 방법을. 고순도 세포 배양으로 신경가소성 연구의 신뢰성을 높입니다.

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우리는 재 프로그래밍을위한 구조를 복제 한 Ines Mühlhahn, 바이러스 생산을위한 Paulina Chlebik, 원고에 대한 의견에 대한 Magdalena Götz와 Judith Fischer-Sternjak에게 감사드립니다.

다음 절차는 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 지침 2010/63/EU에 따라 헬름홀츠 젠트럼 뮌헨의 동물 관리 지침을 따릅니다. 해부가 수행되는 기관의 동물 관리 지침을 준수하십시오.
1. 해부, 해리 및 배양 재료의 준비
참고: 생물학적 안전 캐비닛 내의 모든 배양 시약을 준비하고 오토클레이브 또는 멸균 장비만 사용하여 작업하십시오. 해부 및 해리 시약은 생물학적 안전 캐비닛 외부에서 제조될 수 있다.
<ol><li>T25 배양 플라스크를 H2O에 폴리-D-라이신 (스톡 1 mg/mL; 작업 용액 20 μg/mL)으로 코팅하여 배양 플라스크를 최소2시간 동안 준비한다. 그런 다음H2O로 3x 헹구고 공기 건조하십시오.</li>
	<li>행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS) 500 mL에 1 M HEPES 완충액 5 mL를 첨가하여 해부 완충액을 준비하십시오.</li>
	<li>신경 조직 해리 키트로부터 1950 μL의 완충액 X를 첨가하여 여섯 척수 당 하나의 C-튜브 ( 물질 표 참조)를 준비 하십시오 (자료 표 참조). 해부 중에 얼음에 보관하십시오. C-튜브 당 20 μL의 완충액 Y 및 10 μL의 완충액 A를 첨가하여 효소적 소화 마스터 믹스를 제조하였다 (신경 조직 해리 키트의 일부; 물질 표 참조). 잘 섞어서 필요할 때까지 4°C에서 보관한다.</li>
	<li>칼슘과 마그네슘으로 1x 인산염 완충 식염수 (1x PBS)를 준비하고 얼음 위에 놓습니다. DMEM/F12 485 mL에 페니실린-스트렙토마이신 5 mL(최종 농도, 100 U/mL), 45% D-글루코스 5 mL, 글루타민 보충제 5 mL(최종 농도 2 mM; 물질표 참조)를 첨가하여 기본 배양 배지를 준비한다. 기본 배지는 4주 동안 4°C에서 안정하다.</li>
	<li>기본 배양 배지 44 mL에 B27 보충제 1 mL와 소 태아 혈청 (FBS) 5 mL를 첨가하여 성상세포 배양 배지를 준비한다. 표피 성장 인자 (EGF) 및 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) (각각 10 ng/mL)를 가진 보충 배지. EGF 및 bFGF를 적절한 양의 배지에 사용하기 직전에 첨가한다.</li>
	<li>척수 조직의 해부를 위해서는 구부러진 팁이있는 한 쌍의 큰 포셉, 구부러진 팁이있는 작은 포셉 한 쌍, 작은 포셉 한 쌍, 작은 가위 한 쌍 및 작은 주걱을 사용하십시오.</li>
</ol>2. 성상세포 분리
<ol><li>성상세포를 산후 마우스의 척수로부터 분리하여 기능적 뉴런으로 직접 재프로그래밍을 수행한다(그림 1A). 이 프로토콜을 위해, 출생 후 2-3 일째에 마우스로부터 척수 조직을 수집하십시오. 성상세포 분리를 위해 여섯 개에서 여덟 개의 척수를 수집합니다. 이 동일한 프로토콜을 사용하여 성상 세포를 피질, 중뇌 및 소뇌와 같은 신경계의 다른 영역으로부터 분리하십시오. 이 지역의 경우, 출생 후 다섯 일에서 칠일 사이에 세포를 얻으십시오. 참고: 이 프로토콜에서 언급되지 않은 영역에서 성상세포를 분리하는 것을 목표로 할 때, 나이와 투입 물질은 실험적으로 결정되어야 한다.</li>
</ol>3. 척수 조직 해부
참고 : 조직의 해부는 생물학적 안전 캐비닛 외부에서 수행 할 수 있습니다.
<ol><li>동물을 마취시키지 않고 탈구함으로써 P2-P3에서 마우스를 희생시킨다. 몸통을 35mm 페트리 접시에 넣고 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	<li>가위로 피부를 열고, 작은 가위로 척추를 제거하고, 척수를 추출하고, 얼음 위의 해부 완충액에 넣으십시오. 2x 배율의 입체 박리 현미경으로 포셉을 사용하여 분리 된 척수에서 수막을 제거하고 해부되고 세척 된 척수 조직을 C 튜브로 옮깁니다.</li>
</ol>4. 자기 활성화 세포 분류 (MACS)
<ol><li>신경 조직 해리 키트(표 표 참조)로부터 50 μL 의 효소 P와 이전에 제조된 30 μL의 효소 믹스를 각 C-튜브에 첨가한다. C 튜브를 뒤집어 가열 된 해리기 ( 재료 표 참조)에 놓고 모든 조직이 튜브의 뚜껑에 수집되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>실행 시간이 약 22분인 37_NTDK_1 해리 프로그램을 실행합니다. 프로그램이 끝나기 직전에 사용된 C-튜브 수와 동일한 15mL 튜브에 70μm 스트레이너( 자료표 참조)를 놓고 스트레이너를 빙냉 PBS 2mL로 미리 적시십시오. 전체 MACS 절차 중에 얼음에 1x PBS를 저장합니다.</li>
	<li>프로그램 완료 후 C-튜브를 제거하고 간단히 원심분리하여 튜브 하단의 조직을 수집합니다. 해리된 조직을 C-튜브로부터 스트레이너를 통해 통과시켜 준비된 15 mL 튜브로 옮긴다. 스트레이너를 15mL 튜브에 두십시오.</li>
	<li>1x PBS로 10 mL의 C-튜브를 헹구어 남은 조직을 수집하고, 스트레이너를 한번 더 통과시켜 동일한 15 mL 튜브에 수집한다. 해리된 조직을 함유하는 15 mL 튜브를 실온에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 참고: 이 단계 후에 원심분리기를 4°C까지 냉각하십시오.</li>
	<li>세포를 1x PBS의 80 μL에 재현탁시키기 전에 세포 펠릿을 교란시키지 않고 상청액을 제거하고; 마우스 항-ACSA-2 마이크로비드 키트로부터 10 μL의 블로킹 시약을 첨가 한다(표 참조). 피펫팅으로 부드럽게 섞으십시오.</li>
	<li>어둠 속에서 10분 동안 4°C에서 인큐베이션한다(냉장고). 10 μL의 항성상세포 세포 표면 항원-2-결합 마이크로비드( 표 참조)를 첨가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합한다. 어둠 속에서 4°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>3 mL의 1x PBS를 첨가하고 4°C에서 10분 동안 300 x g에서 원심분리하여 세포를 세척하였다. 원심분리하는 동안, 적절한 수의 자기 분류 컬럼(재료 표 참조)을 15 mL 수집 튜브가 있는 세퍼레이터 상에 배치하여 자기 분리기(재료 표 참조)를 조립한다. 컬럼을 500 μL의 1x PBS로 헹구십시오.</li>
	<li>상청액을 제거하고 세포 현탁액을 자기 컬럼으로 옮기기 전에 세포를 1x PBS의 500 μL에 재현탁시켰다. 중력에 의해 배수하게하십시오. 15 mL 튜브를 500 μL의 1x PBS로 세척하고 컬럼에 적용한다. 컬럼을 추가로 두 번의 세척을 위해 500 μL의 1x PBS로 세척한다.</li>
	<li>분리기로부터 컬럼을 제거하고, 800 μL의 성상세포 배양 배지를 첨가하고, 포함된 플런저로 컬럼 밖으로 세포를 밀어냄으로써 유체 세포.</li>
	<li>플레이트 세포를 EGF 및 bFGF가 보충된 성상세포 배양 배지 4.2 mL를 첨가하여 미리 제조된 배양 플라스크에 넣고 37°C 및 5%CO2에서 배양하였다. 참고 : 코팅 배양 플라스크는 다른 뇌 영역에서 분리 된 성상 세포에는 필요하지 않지만 척수에서 분리 된 성상 세포에 대한 더 나은 기질을 제공합니다.</li>
	<li>세포를 컨플루언시까지 약 7일 동안 배양한다(80%-90%). 셀이 7 일 후에 합류하지 않으면 도금하기 전에 10 일까지 기다리십시오. 10 일 후에 세포는 더 이상 증식하지 않으며 재 프로그래밍 효율은 떨어집니다.</li>
</ol>5. 재 프로그래밍을위한 성상 세포의 시딩
참고: 다음 단계는 안전 레벨 1(SL1)이 있는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.
<ol><li>배양 플라스크를 이전에 제조했던 것과 동일한 방법으로 폴리-D-라이신 코팅된 유리 커버슬립으로 24-웰 플레이트를 준비하였다. 필요한 플레이트의 수를 결정하기 위해, 성상세포가24 -웰 플레이트에서 웰당 5-5.5 x 10 4 세포의 밀도로 플레이팅된다는 것을 고려한다. 일반적으로 P2 마우스에서 6 척수를 분리하면 약 1 x 106 세포가 생성됩니다.</li>
	<li>배양된 성상세포를 함유하는 T25 배양 플라스크로부터의 흡인물 배지를 1x PBS로 1회 세척한다. 0.5 mL의 0.05% 트립신/EDTA를 첨가하여 배양 플라스크로부터 성상세포를 분리하고, 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다. 플라스크의 측면을 부드럽게 두드려 배양 플라스크 표면으로부터 세포를 방출하고 10X 배율을 사용하여 밝은 현장 현미경으로 박리를 확인합니다.</li>
	<li>2.5 mL의 성상세포 배양 배지로 트립신화를 중단하고 15 mL 튜브에 세포 현탁액을 수집하십시오. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 흡인하고, 세포를 1 mL의 성상세포 배양 배지에 재현탁시킨다. 혈소세포계 또는 자동화된 세포 계수 시스템을 사용하여 세포 농도를 계산합니다.</li>
	<li>세포 수에 기초하여, 세포 현탁액을 신선한 성상세포 배지로 희석하여 mL당 1-1.1 x 105 세포의 용액을 얻었다. 배지에 EGF 및 bFGF를 인자당 10ng/mL로 보충하십시오. 5-5.5 x 10 4 세포에 상응하는 500 μL의 세포 현탁액을 미리 제조된24 -웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 세포를 37°C 및 5%CO2에서 배양한다.</li>
</ol>6. 전사인자의 강제 발현
참고: 프로토콜을 진행하기 전에 실험을 올바르게 설계하는 것이 중요합니다. 특히, 리프로그래밍에 대한 네거티브 컨트롤, 즉 리프로그래밍 요소가 표현되지 않는 조건을 항상 포함하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 리프로그래밍 인자 및 리포터(예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP), DsRed)에 대한 cDNA를 운반하는 벡터를 사용하는 경우, 음성 대조군은 리포터만을 운반하는 동일한 벡터로 표시된다. 서로 다른 기자를 운반하는 여러 요인을 표현할 때, 부정적인 통제는 그에 따라 조정되어야합니다.
<ol><li>도금 다음 날, 24웰 플레이트를 검사하여 셀이 커버슬립에 부착되었는지 확인합니다.</li>
	<li>실험 목표 및 이용가능한 자원에 기초하여, 리프로그래밍 인자의 강제 발현은 바이러스 형질도입(단계 6.3 참조) 또는 DNA 형질감염(단계 6.4 참조)에 의해 달성될 수 있다. 참고: 레트로바이러스 또는 렌티바이러스를 사용하려면 정부 당국의 승인이 필요하며 안전 수준 2(SL2)의 실험실 내의 생물학적 안전 캐비닛 아래에서 수행해야 합니다.</li>
	<li>세포를 유전 정보를 운반하는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스로 형질도입하여 하기에 기재된 바와 같이 관심있는 리프로그래밍 인자(들)를 발현시킴으로써 성상세포를 재프로그래밍한다.<ol><li>1 x 10 10-1 x 1012 입자 / mL의 높은 바이러스 역가를 가진 세포를 1 μL의 세포 현탁액을 성상 세포 배지에 직접 첨가하여 형질도입하십시오. 이것은 높은 감염률을 보장합니다. 실험의 목적에 따라 섹션 7 또는 섹션 8로 진행하기 전에 24-36 h 동안 바이러스 입자를 함유하는 성상세포 배지로 세포를 배양한다. 참고: 상이한 프로모터가 전이유전자의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다(또한 대표적인 결과 참조). 구성적 프로모터 (예를 들어, CMV, CAG)는 유도성 프로모터보다 일찍 전이유전자의 발현을 유도하고; 그러나, 두 유형의 프로모터 유형 모두 세포를 뉴런으로 재프로그래밍하는데 성공적으로 사용되었다.</li>
	</ol></li>
	<li>DNA 플라스미드는 또한 하기에 기재된 바와 같이 DNA 형질감염을 통해 성상세포 내로 도입될 수 있다. 참고: 이것은 SL1에 대해 승인된 생물학적 안전 캐비닛에서 수행할 수 있습니다.<ol><li>형질감염 전에, 형질감염 시약, 원하는 구축물의 플라스미드 DNA, 신선한 성상세포 배지, 및 혈청-환원 배지를 수득한다( 표 참조). 24-웰 플레이트의 각 웰이 300 μL의 혈청 환원 배지를 필요로 한다는 것을 고려하여 혈청 감소 배지의 필요한 양을 계산한다( 표 문헌 참조). 적절한 양의 혈청 환원 배지를 50 mL 튜브에 첨가하고 이를 37°C로 가온한다.</li>
		<li>혈청 감소 배지가 따뜻해지면, 모든 웰로부터 성상세포 배지를 흡인하고 이를 50 mL 튜브에 수집한다. 수집된 성상세포 배지를 0.45 μM 시린지 필터로 여과하여 분리된 세포를 제거하였다.</li>
		<li>여과된 배지에 동일한 부피의 신선한 성상세포 배지를 첨가하여 웰 당 1 mL의 성상세포 배지를 첨가하기에 충분한 용액을 얻었다. 성상세포 컨디셔닝 배지를 사용할 때까지 인큐베이터 내의 37°C로 유지한다(단계 6.4.9). 참고: 배양 배지는 배양물의 생존력을 지원하는 몇 가지 분비 인자를 포함하기 때문에 재사용됩니다.</li>
		<li>300 μL의 예비-가온된 혈청-환원 배지를 각 웰에 첨가하고, 24-웰 플레이트를 다시 인큐베이터에 놓는다.</li>
		<li>DNA 및 혈청 환원 배지로 구성된 용액 A를 준비한다. 각 웰에 대해 총 0.6 μg의 DNA를 사용하고 50 μL의 혈청 환원 배지에 첨가한다. 용액 A를 사용할 때까지 실온에서 보관하십시오. 참고: 일반적으로 조건당 기술적 트리플라이케이트가 고려됩니다. 따라서, 24-웰 플레이트의 3웰을 형질감염시키기에 충분한 물질을 보장하기 위해 3.5 반응에 충분한 혼합 (예를 들어, 혈청 감소 배지의 175 μL에 희석된 총 DNA 2.1 μg)이 제조된다.</li>
		<li>형질감염 시약 및 혈청 환원 배지로 구성된 용액 B를 준비한다. 각 웰에 대해, 0.75 μL의 형질감염 시약을 50 μL의 혈청 환원 배지에 첨가한다. 이 용액은 모든 형질감염 조건에 공통적이므로 형질감염에 걸친 변동성을 줄이기 위해 대량으로 준비하십시오.</li>
		<li>용액 B를 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 용액 A에 용액 B를 1:1 비율로 한 방울씩 떨어뜨리고 부드럽게 섞는다. 소용돌이치지 마십시오. 용액 A + B를 후드 아래의 실온에서 20-30 분 동안 인큐베이션하십시오.</li>
		<li>모든 형질감염 조건에 대해 6.4.5-6.4.7단계를 반복한다. 20-30분 후, 용액 A+B를 각 웰에 100 μL의 최종 부피 동안 적하하여 떨어뜨린다. 플레이트를 부드럽게 진탕하고 세포를 다시 37°C에서 4시간 동안 인큐베이터에 넣는다.</li>
		<li>4시간 후, 형질감염 배지를 제거하고 단계 6.4.3에서 제조된 미리 가온된 성상세포 컨디셔닝 배지 1 mL를 첨가한다. 실험의 목적에 따라 섹션 7 또는 섹션 8로 진행하기 전에 36-48 시간 동안 세포를 유지한다.</li>
	</ol></li>
</ol>7. 성상세포의 재프로그래밍 (7일 분석)
<ol><li>기본 배지 49 mL에 B27-보충제 1 mL를 첨가하여 뉴런 분화 배지를 제조하였다(단계 1.4 참조). 24-48시간 후, 세포가 형질도입 또는 형질감염되었는지에 따라(각각 단계 6.3 및 6.4 참조), 성상세포 배지를 웰당 1 mL의 뉴런 분화 배지로 교체하고 세포를 37°C 및 9%CO2에서 배양한다. 참고: 9% CO2 인큐베이터가 없는 경우 세포를 5%CO2 로 유지할 수도 있습니다. 그러나 뉴런 재 프로그래밍은 이러한 조건 하에서 더 효율적입니다.</li>
	<li>선택사항: 리프로그래밍 효율을 높이려면 성상세포 배지를 분화 배지로 교체할 때 신경세포 분화 배지에 포스콜린(최종 농도 30 μM) 및 도르소모르핀(최종 농도 1 μM)을 보충합니다. Forskolin 및 Dorsomorphin으로 세포를 치료하기로 선택할 때 초기 치료 후 2 일 후에 Dorsomorphin의 두 번째 용량을 제공하십시오. 이 두 번째 처리를 배양 배지에 직접 첨가한다.</li>
	<li>뮤린 성상세포를 뉴런 세포로 직접 재프로그래밍하는 것은 일반적으로 배지를 바꾼 후 7일 이내에 발생합니다. 따라서, 뉴런 재프로그래밍의 개시 후 7 일, 하류 분석을 위해 세포를 수정하거나 수집하십시오.</li>
</ol>8. 성상세포를 성숙한 뉴런으로 재프로그래밍 (장기 배양)
<ol><li>기본 배지 49 mL에 B27-보충제 1 mL를 첨가하여 뉴런 분화 배지를 제조하였다(단계 1.4 참조). 24-48시간 후, 세포를 형질도입 또는 형질감염시켰는지에 따라(각각 단계 6.3 및 6.4 참조), 성상세포 배지를 웰당 포스콜린(최종 농도 30 μM) 및 도르소모르핀(최종 농도 1 μM)으로 보충된 뉴런 분화 배지 1 mL로 교체하고 세포를 37°C 및 9%CO2에서 배양하였다. 참고: 9% CO2 인큐베이터가 없는 경우 세포를 5%CO2 로 유지할 수도 있습니다. 그러나 뉴런 재 프로그래밍은 이러한 조건 하에서 더 효율적입니다.</li>
	<li>초기 치료 2일 후에 Dorsomorphin 처리를 반복하여 이를 뉴런 분화 배지에 직접 첨가한다.</li>
	<li>뉴런 리프로그래밍의 시작으로부터 7일 후, 6 μL의 N2, 1.2 μL의 NT3 (스톡 20 μg/mL), 1.2 μL의 BDNF (스톡 20 μg/mL), 1.2 μL의 GDNF (스톡 20 μg/mL), 및 1.2 μL의 cAMP (스톡 100 mM)를 189.2 μL의 신경 분화 배지에 첨가하여 성숙 배지를 제조하였다. 각 웰에 존재하는 뉴런 분화 배지를 200 μL의 성숙 배지로 보충한다. 참고 : 성숙 배지는 첫 번째 치료에만 보충됩니다. 모든 후속 치료는 하기에 기재된 바와 같이 뉴런 분화 배지를 부분적으로 대체함으로써 수행된다.</li>
	<li>200 μL의 뉴런 분화 배지를 제거하고 200 μL의 신선한 성숙 배지를 일주일에 두 번 첨가하여 최대 6 주 동안 소분자로 치료를 반복하십시오. 성숙 동안, 세포를 전기생리학적 실험(전형적으로, 21일째 이상)에 사용하거나, 하류 분석(예를 들어, 면역형광)을 위해 고정시킨다.</li>
</ol>

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<li>Fishman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+divisions+are+not+essential+for+the+direct+conversion+of+fibroblasts+into+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells.</a> Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biology. 8 (5), 1000373(2010).</li>
<li>Treutlein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+direct+reprogramming+from+fibroblast+to+neuron+using+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq.</a> Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242 (4877), 405-411 (1988).</li>
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<li>Berninger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+neurons+derived+from+in+vitro+reprogrammed+postnatal+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia.</a> Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).</li>
<li>Marro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+conversion+of+terminally+differentiated+hepatocytes+to+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons.</a> Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).</li>
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<li>Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%3A+toward+an+understanding+of+the+development+and+evolution+of+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li>
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<li>Masserdotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mechanisms+of+proneural+factors+and+REST+in+regulating+neuronal+reprogramming+of+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).</li>
<li>Rao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+Ascl1-mediated+astrocyte-to-neuron+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).</li>
<li>Gascon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+successful+negotiation+of+a+metabolic+checkpoint+in+direct+neuronal+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).</li>
<li>Russo, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+induction+of+neuron-enriched+mitochondrial+proteins+boosts+direct+glia-to-neuron+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonstochastic+reprogramming+from+a+privileged+somatic+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state.</a> Cell. 156 (4), 649-662 (2014).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-restrict+astrocytes+exhibit+heterogeneous+susceptibility+to+neuronal+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).</li>
<li>Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+generation+of+glia+is+a+major+astrocyte+source+in+postnatal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex.</a> Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).</li>
<li>Price, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ink4a%2FArf+locus+is+a+barrier+to+direct+neuronal+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).</li>
<li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunoaffinity-based+method+for+isolating+ultrapure+adult+astrocytes+based+on+ATP1B2+targeting+by+the+ACSA-2+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

뮤린 성상세포의 일차 배양은 직접적인 뉴런 재프로그래밍을 연구하는 놀라운 시험관내 모델 시스템이다. 실제로, 출생 후 단계에서 단리되었음에도 불구하고, 세포는 전형적인 성상세포 마커(29)를 발현하고, 패터닝 유전자(28,29)의 발현을 유지하며,38세에 생체내 성상세포와 유사하게 증식하는 능력을 유지한다. MACS-매개 단리 후, 세포는 먼저 플라스크에 부착 한 다음 증식하기 시작하여 고도로 농축 된 성상 세포 배양29을 일으킨다. 중요하게도, 배양된 성상세포는 다분화능 세포 상태로 탈분화되거나 불멸화되지 않는다는 것이다. 더욱이, 이들은 리포터 단백질 (예를 들어, DsRed 또는 GFP)의 발현 이후에 자발적으로 뉴런을 생성하지 않지만, 성상세포 동일성을 유지한...

포유동물 중추신경계(CNS)는 매우 복잡하며, 방대한 수의 상이한 뉴런 아형 1,2,3,4,5,6을 포함하는 수백 개의 상이한 세포 유형들로 구성된다. 다른 기관 또는 조직 7,8,9와는 달리, 포유동물 CNS는 매우 제한된 재생 능력을 갖는다; 외상성 뇌 손상 또는 신경 변성에 따른 신경 세포 손실은 돌이킬 수 없으며 종종 운동 및인지 결핍을 초래합니다10. 뇌 기능을 구하기 위해 잃어버린 뉴런을 대체하기위한 다양한 전략이 집중적 인 조사를 받고 있습니다11. 그 중에서도, 체세포를 기능적 뉴런으로 직접 재프로그래밍하는 것은 유망한 치료 접근법12로 부상하고 있다. 직접 재프로그래밍 또는 전분화는 하나의 분화된 세포 유형을 중간 증식성 또는 다능성 상태13,14,15,16을 거치지 않고 새로운 동일성으로 전환시키는 과정이다. 섬유아세포를 근육세포(17,18)로 전환시키기에 충분한 인자로서 MyoD1의 확인에 의해 개척된 이 방법은 여러 세포 유형을 기능적 뉴런(19,20,21)으로 재프로그래밍하는데 성공적으로 적용되었다.
CNS22,23에서 가장 풍부한 거대 아교세포 인 성상 세포는 여러 가지 이유로 직접 신경 재 프로그래밍을위한 특히 유망한 세포 유형입니다. 첫째, 그들은 CNS에 걸쳐 광범위하고 균등하게 분포되어 새로운 뉴런을위한 유전자좌 공급원이 풍부합니다. 둘째, 성상세포와 뉴런은 배아 발달 동안 공통조상인 방사상 신경교세포(24)를 공유하기 때문에 발달적으로 밀접한 관련이 있다. 두 세포 유형의 일반적인 배아 기원은 상이한 배아층19,21로부터의 세포의 재프로그래밍과 비교하여 뉴런 전환을 촉진하는 것으로 보인다. 더욱이, 그들의 방사상 신경교세포 기원을 통해 성상세포에 의해 유전된 패터닝 정보는 성인 성상세포(25,26,27)에서도 유지되며, 지역적으로 적절한 뉴런 아형(28,29,30)의 생성에 기여하는 것으로 보인다. 따라서 성상세포가 뉴런으로 전환되는 것을 조사하고 이해하는 것은 세포 기반 대체 전략에 대한이 기술의 잠재력을 최대한 발휘하는 데 중요한 부분입니다.
시험관내 배양된 성상세포를 뉴런으로 전환시키는 것은 다음을 포함하는 직접적인 뉴런 리프로그래밍 분야에서 몇 가지 돌파구를 가져왔다: i) 성상세포로부터 뉴런을 생성하기에 충분한 전사 인자의 확인15,19,31, ii) 동일한 세포 맥락에서 상이한 리프로그래밍 인자에 의해 촉발된 분자 메커니즘의 풀림(32) iii) 성상세포의 발달 기원이 상이한 뉴런 아류형을 유도하는 것에 미치는 영향을 강조한다28,29,33. 더욱이, 성상세포의 시험관내 직접 전환은 증가된 반응성 산소 종(ROS) 생산(34) 및 성상세포와 뉴런(35)의 미토콘드리아 프로테옴 사이의 차이와 같은 직접적인 뉴런 재프로그래밍(34,35)을 제한하는 몇 가지 주요 장애물을 풀었다. 따라서 이러한 관찰은 세포 정체성 유지, 세포 운명 변화를 막는 장애물 및 재 프로그래밍에서 신진 대사의 역할과 관련된 생물학12의 몇 가지 근본적인 질문을 조사하기 위해 직접 신경 재 프로그래밍을위한 모델로서 성상 세포의 일차 배양을 사용하는 것을 강력히지지합니다.
여기서 우리는 뮤린 척수29로부터 성상세포를 분리함으로써 입증된 바와 같이, 매우 높은 순도로 출생 후 (P) 나이에 마우스로부터 성상세포를 분리하기 위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한 바이러스 형질도입 또는 DNA 플라스미드 형질감염을 통해 성상세포를 뉴런으로 재프로그래밍하는 프로토콜을 제공한다. 재프로그램된 세포는 형질도입 후 7일(7 DPT)에서 분석되어 리프로그래밍 효율 및 뉴런 형태학과 같은 다양한 측면을 평가하거나, 수주 동안 배양물에서 유지될 수 있고, 시간에 따른 성숙을 평가할 수 있다. 중요하게도, 이 프로토콜은 척수 성상세포에 특이적이지 않으며, 피질 회색 물질, 중뇌 및 소뇌를 포함한 다양한 다른 뇌 영역으로부터 성상세포를 분리하는데 용이하게 적용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>0.05% 트립신/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>4', 6-디아미디노-2-페닌돌, 딜락테이트(DAPI)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 IgG1 알렉사 647</td><td>써모 피셔</td><td>A21240</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 IgG1 비오틴</td><td>서던바이오텍</td><td>Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 IgG2b Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>안티 래빗 Alexa 546</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>아쿠아 폴리/마운트</td><td>폴리사이언스</td><td>Cat# 18606-20</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>13256029</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>Cat# A9418</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>시그마 알드리치</td><td>D0260</td><td></td></tr><tr><td>C-튜브</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>도르소모르핀</td><td>시그마 알드리치</td><td>P5499</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Dako</td><td>Cat# Z0334; RRID: AB_100013482</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025050</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Life Technologies</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 (Transfection reagent)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 11668019</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainer 70&마이크로; m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>마우스 anti-ACSA-2 MicroBeat 키트&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-678</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG1 항-Synaptophysin 1</td><td>시냅스 시스템</td><td>Cat# 101 011 RRID:AB_887824)</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG2b 항-Tuj-1 (&beta; III-tub)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8660</td><td></td></tr><tr><td>MS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>NT3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>octoMACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM &ndash; GlutaMAX (혈청 감소 매체)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 51985-026</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1149</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-RFP</td><td>Rockland</td><td>Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751</td><td></td></tr><tr><td>토끼 안티 Sox9</td><td>시그마-알드리치</td><td>고양이# AB5535; RRID:AB_2239761</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa 405</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# S32351</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# T9284</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 성상세포의 분리 및 직접 뉴런 리프로그래밍

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

직접 뉴런 재 프로그래밍은 다능성 중간체를 통과하지 않고 다른 스타터 세포 집단에서 기능적 뉴런을 생성하는 강력한 접근법입니다. 이 기술은 신경 퇴행성 질환을 앓고있는 환자의 섬유 아세포를 뉴런으로 전환 할 수 있기 때문에 질병 모델링 분야에서 큰 약속을 지닐뿐만 아니라 세포 기반 대체 요법에 대한 유망한 대안을 나타냅니다. 이러한 맥락에서, 주요한 과학적 돌파구는 성상세포와 같은 중추신경계 내에서 분화된 비신경세포가 시험관내에서 기능적 뉴런으로 전환될 수 있다는 것을 입증하는 것이었다. 그 이후로, 성상세포를 뉴런으로 시험관 내에서 직접 재프로그래밍하는 것은 강제 정체성 변환의 기초가 되는 분자 메커니즘과 효율적인 재프로그래밍을 방해하는 장애물에 대한 실질적인 통찰을 제공했다. 그러나, 상이한 실험실에서 수행된 시험관내 실험으로부터의 결과는 성상세포를 분리, 배양 및 재프로그래밍하는데 사용되는 방법의 차이로 인해 비교하기가 어렵다. 여기에서는 자기 세포 분류를 통해 출생 후 생쥐의 중추 신경계의 다른 영역에서 고순도의 성상 세포를 안정적으로 분리하고 배양하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 바이러스 형질도입 또는 DNA 형질감염을 통해 배양된 성상세포를 뉴런으로 재프로그래밍하는 프로토콜을 제공합니다. 이 간소화되고 표준화 된 프로토콜은 세포 동일성 유지의 기초가되는 분자 메커니즘, 새로운 신경 정체성의 확립, 특정 신경 아류형의 생성 및 그 기능적 특성을 조사하는 데 사용될 수 있습니다.

성상세포의 일차 배양은 일반적으로 MAC 분류 및 도금 후 7 일에서 10 일 사이에 80 % -90 % 합류율에 도달합니다 (그림 1B). 일반적으로, 단일 T25 배양 플라스크는 약 1-1.5 x 106 세포를 산출하며, 이는 웰 당 5-5.5 x 104 세포의 밀도로 세포를 시딩할 때 20-30 커버슬립에 충분하다. 도금 다음 날, 전지는 일반적으로 커버슬립 표면의 50%-60%를 덮는다(그림 1C). 이 단계에서 배양물은 거의 독점적으로 성상세포로 구성되어 있는 반면, 신경아세포와 같은 다른 세포 유형은 사실상 존재하지 않는다(그림 1D)29.
리프로그래밍 인자는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 형질도입을 통해 또는 DNA 플라스미드...

여기서 우리는 출생 후 마우스의 중추 신경계의 다른 영역에서 유래 된 성상 세포의 고도로 농축 된 배양물을 생성하고 전사 인자의 강제 발현에 의해 기능적 뉴런으로 직접 전환시키는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...

성상 세포는 직접적인 신경 프로그래밍을 목표로 삼는 흥미로운 자가 집단입니다. 이 프로토콜은 다른 영역 또는 중추 신경계로부터 고순도로 배양 성상 세포를 분리하는 신뢰할 수있는 기술을 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 시작 집단의 성상 세포 순도 차이와 같은 교란 요인없이 성상 세포가 기능적 뉴런으로 재 프로그래밍 될 수있는 능력을 조사하도록 설계 및 최적화되었습니다.이 절차를 시연하는 것은 실험실의 박사후 연구원 인 Bob Hersbach와 실험실의 기술 지원 인 Tatiana Simon이 수행합니다. 시작하려면 안락사 된 마우스의 몸통을 35mm 페트리 접시에 넣고 얼음 위에 보관하십시오. 가위로 피부를 열고 작은 가위로 척추를 제거하십시오.그런 다음 척수를 추출하여 얼음 위의 해부 완충액에 넣으십시오. 2 배 배율의 정위 해부 현미경에서 집게를 사용하여 분리 된 척수에서 수막을 제거하고 해부 및 청소 된 척수 조직을 C 튜브로 옮겼습니다. 신경 조직 해리 키트에서 50 마이크로 리터의 효소 P와 미리 준비된 30 마이크로 리터의 효소 혼합물을 각 C 튜브에 추가합니다.C 튜브를 뒤집어 가열된 해리 위에 올려 모든 조직이 튜브 뚜껑에 수집되도록 합니다. 800 마이크로리터의 성상세포 배양 배지를 첨가하고 포함된 플런저로 컬럼 밖으로 세포를 밀어내는 분리기로부터 컬럼을 제거하여 세포를 회피시킨다. 플레이트 세포는 이전에 제조된 배양 플라스크에 4.2 밀리리터의 성상세포 배양 배지를 첨가하여 EGF 및 bFGF의 밀리리터당 10 나노그램이 보충되었다.다른 뇌 영역에서 분리된 성상교세포에 대해 배양 플라스크를 코팅할 필요는 없지만 척수에서 분리된 성상세포에 더 나은 기질을 제공합니다. 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 세포를 배양하십시오. 안전 수준이 1인 생물학적 안전 캐비닛 아래에서 성상세포 안착을 수행하고 텍스트 원고에 설명된 대로 Poly-D-Lysine 코팅 유리 커버 슬립이 있는 24웰 플레이트를 준비합니다.도금을 위해 P2 마우스에서 6 개의 척수를 분리하면 약 1 백만 개의 세포가 생성됩니다. 배양된 성상세포를 포함하는 T-12.5 배양 플라스크에서 배지를 흡인하고 1x PBS로 1회 세척합니다. 0.05% 트립신 EDTA 0.5밀리리터를 첨가하여 배양 플라스크에서 성상세포를 분리하고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.플라스크의 측면을 부드럽게 두드려 배양 플라스크 표면에서 세포를 방출하고 10배 배율을 사용하여 명시야 현미경으로 분리 상태를 확인합니다. 2.5 밀리리터의 성상 세포 배양 배지로 트립시 나제 화를 중단하고 15 밀리리터 튜브에서 세포 현탁액을 수집하십시오. 섭씨 4도에서 5분 동안 300RCF로 원심분리합니다.상청액을 흡인하고 1 밀리리터의 성상 세포 배양 배지에서 세포를 재보냅니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수 시스템을 사용하여 세포 농도를 계산합니다. 세포 수에 기초하여, EGF 및 bFGF가 보충된 새로운 성상세포 배지로 세포 현탁액을 인자당 밀리리터당 10나노그램으로 희석한다.이전에 준비된 24웰 플레이트의 각 웰에 500마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하고 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 배양 세포를 추가합니다. 49 밀리리터의 기본 배양 배지에 1 밀리리터 B27 보충제를 추가하여 신경 분화 배지를 준비하십시오. 24 내지 48 시간 후, 세포가 형질 도입되었는지 또는 형질 주입되었는지에 따라, 성상 세포 배지를 웰 당 1 밀리리터 뉴런 분화 배지로 대체한다.세포를 섭씨 37도에서 9%이산화탄소로 배양합니다. 리프로그래밍 효율을 높이려면 성상세포 배지를 분화 배지로 교체할 때 포스콜린과 도르소모르핀으로 뉴런 분화 배지를 각각 30마이크로몰 및 1마이크로몰의 최종 농도로 보충합니다. 포스콜린 및 도르소모르핀으로 세포를 치료하기로 선택할 때 초기 치료 2일 후에 도르소모르핀의 두 번째 용량을 제공합니다.이 두 번째 처리를 배양 배지에 직접 추가합니다. 성상 세포의 1 차 배양은 자기 보조 세포 분류 및 도금 후 7 일에서 10 일 사이에 80-90 % confluency에 도달했습니다. 도금 다음 날, 셀은 전형적으로 커버 슬립 표면의 50 내지 60%를 덮었다.배양은 주로 이 단계에서 성상교세포로 구성되었지만 신경 모세포와 같은 다른 세포 유형은 사실상 없었습니다. 형질도입 또는 형질감염 후 7일째에, 유도된 뉴런 세포는 성상세포와 명확하게 구별될 수 있었다. 뉴런 세포 소마는 재프로그래밍되지 않은 성상세포보다 작았으며 과정이 길었고 뉴런 마커, 베타 3 튜불린에 대해 양성이었고 성상세포 마커 GFAP에 대해 음성이었습니다.형질도입 또는 형질주입 후 21일째에 많은 유도 뉴런이 활동 전위를 발화할 수 있었고 성숙한 뉴런 마커 NeuN 및 범시냅스 단백질 시냅토피신에 대해 양성이었습니다. 관심 영역을 적절하게 해부하는 것이 필수적입니다. 주변 조직의 오염을 방지합니다.격리 된 척수에서 수막과 등근 신경절을 제거하는 데주의를 기울여야합니다. 이 방법은 대뇌 피질, 등쪽 중뇌 및 소뇌를 포함한 중추 신경계의 다양한 영역에서 성상 세포를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 앞으로이 기술을 통해 우리는 지역 성상 세포에 대한 지식과 기능적 뉴런으로 재 프로그래밍 될 수있는 잠재력을 확장 할 수 있습니다.

isolation-and-direct-neuronal-reprogramming-of-mouse-astrocytes

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는 새로 태어난 마우스에서 성상세포를 순수하게 제제하는 방법을 설명합니다.

성상세포 분리: 마우스 피질 성상세포의 순수한 준비를 얻는 방법

이 비디오는 다른 뇌 세포와 분리하여 쥐 성상세포를 배양하는 간단한 방법을 보여줍니다. 배양 중에 성상세포 특이적 배지를 사용하고 비성상세포 세포의 부착을 억제함으로써 이 방법은 성상세포를 선택적으로 배양합니다. 이러한 배양된 성상세포는 미세한 과정을 통해 성상 형태를 나타냅니다.

쥐 성상세포를 분리하고 배양하는 간단한 기술

이 비디오는 변형 인자를 뉴런으로 발현하는 성상세포의 직접 재프로그래밍을 보여줍니다. 형질전환 인자는 성상세포에서 뉴런으로의 전환을 촉진하는 일련의 분자 이벤트를 촉발합니다. 이 과정은 신경 분화 매체를 통해 특정 제제와 보충제를 공급함으로써 더욱 뒷받침됩니다.

마우스 성상세포를 뉴런으로 직접 뉴런 재프로그래밍(Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes into Neurons)

출처: Pereira, M. et. al., 바이러스 벡터의 뇌내 주사에 의한 상주 신경교세포를 인터뉴런으로 생체 내 직접 재프로그래밍. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 형질전환 마우스의 대뇌 피질에 아데노 관련 바이러스를 정위 주사하여 Cre 의존성 뉴런 재프로그래밍 및 형광 리포터 유전자를 신경교세포에 전달하는 방법을 보여줍니다.

마우스 모델에서 신경교세포 재프로그래밍을 위한 바이러스 벡터의 정위 주입

Astrocytes 정상 뇌 개발 및 기능, 및 중앙 신경계 수리를 위해 필수적인 기초 생물학적 과정에 참여하는 다양한 세포로 인정되었습니다. 여기 중추 신경계 세포의 주요 클래스의 생물학을 연구하는 순수 마우스 astrocyte 문화를 얻기 위해 빠른 절차를 제시한다.

마우스 두피 Astrocytes의 분리와 문화

플록스, 조건부 발암성 대립유전자로 조작되고 바이러스 Cre 매개 재조합을 통해 형질전환된 마우스에서 채취한 표현형 야생형 성상세포와 신경 줄기세포는 syngeneic, immune-competent littermate의 뇌에 형질전환된 세포의 orthotopic 주입에 의해 in vitro 및 in vivo에서 성상세포종 발병기전을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다.

모델링 성상 세포종 병인 체외와 생체 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여

우리는 수정하고 흥분 대뇌 피질의 뉴런 (12)에 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 빠른 재현, 효율적인 분화를 설명하는 이전에 게시 된 프로토콜을 구현합니다. 특히, 우리의 수정은 네트워크 레벨에서의 전기 생리 학적 특성을 측정하기위한 마이크로 - 전극 어레이의 신경 세포 밀도 및 사용의 제어를 허용한다.

마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

우리는 생체 외에서 문화에 대 한 셀의 신속 하 고 특정 격리 수 있는 기본 마우스 oligodendrocytes의 immunomagnetic 절연을 설명 합니다.

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

이 프로토콜의 전반적인 목표는 중추 신경계에서 뮤린 성상 세포와 미세 글리아 세포를 추출, 유지 및 해리하는 방법을 지시하고 원생 동물 기생충에 감염하는 것입니다.

원생 동물 기생충 감염에 대 한 기본 성상 세포와 Microglia의 수반되는 격리

성상 세포는 대뇌 피질을 균일하게 타일로 만들어 세포 수준에서 복잡한 형태에 대한 분석을 어렵게 만듭니다. 여기에 제공된 프로토콜은 자궁 전기포레이션을 기반으로 하는 다색 라벨을 사용하여 피질 성상신구를 선별하고 사용자 친화적인 이미지 분석 파이프라인을 사용하여 볼륨 및 형태를 분석합니다.

피질 마우스 성상세포를 개별화하기 위해 다각형 게놈 통합 색상(MAGIC) 마커의 자궁 전기포게에서

이 프로토콜은 성체 마우스 척수에서 정제된 성상교세포와 미세아교세포를 분리하여 RNA 분석 및 세포 배양과 같은 후속 응용 분야를 용이하게 합니다. 여기에는 분리된 세포의 품질과 수율을 모두 향상시키기 위해 고안된 상세한 세포 해리 방법 및 절차가 포함됩니다.

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies( 체외 분석 및 전사체 연구를 위한 성인 마우스 척수에서 순수 성상교세포 및 미세아교세포의 분리)

배우세요 마우스 중추신경계에서 성상세포를 분리하고 전사인자 발현을 통해 기능적 뉴런으로 직접 리프로그래밍하는 방법을. 고순도 세포 배양으로 신경가소성 연구의 신뢰성을 높입니다.

마우스 성상세포의 분리 및 직접 뉴런 리프로그래밍

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