Patch-Clamp 기록을 위해 신생아 설치류에서 전정 및 나선형 신경절 소마타를 분리 및 배양합니다.

청각 및 전정 구심성 뉴런의 말단에서 발견되는 많은 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체는 세포체에서도 발견됩니다. 분리된 세포체의 배양은 이러한 이온 채널과 수용체가 뉴런의 반응에 어떻게 영향을 미치는지 이해하기 위해 시험관에서 연구할 수 있습니다. 세포체의 조밀한 형태는 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체의 전압 의존적 특성을 특성화하기 위한 고품질 전기 기록을 가능하게 합니다.

또한 다양한 세포 유형에 쉽게 접근할 수 있어 세포 다양성의 물리적 분석을 통해 높은 처리량을 얻을 수 있습니다. 이 절차는 대학원생인 캐서린 레갈라도(Katherine Regalado)와 박사 후 연구원인 다니엘 브론슨(Daniel Bronson) 박사와 나다니엘 노왁(Nathaniel Nowak) 박사가 시연할 예정입니다. 시작하려면 유리 목초지 피펫을 Bunsen 버너의 불꽃에 대고 세포 해리를 위한 삼중 피펫을 준비합니다.

유리 팁이 녹기 시작하면 유리를 원하는 팁 직경으로 늘립니다. 피펫의 한쪽 끝을 화염에서 당겨 약간 구부립니다. 구부러진 피펫을 현미경 아래에 놓습니다.

점수 타일을 사용하여 원하는 직경으로 유리에 점수를 매기고 깨뜨립니다. 피펫 팁을 버너 불꽃 위에 통과시킵니다. 이렇게 하면 팁 근처의 거친 가장자리가 빠르게 연마됩니다.

닫힌 수술용 가위를 사용하여 안락사된 쥐의 뇌를 퍼냅니다. 뇌신경을 절단하고 제거하여 두개골에서 뇌를 완전히 분리합니다. 머리 뒤쪽에서 시작하여 집게로 투명한 막질 물질을 잡아 당긴 다음 수술 용 가위로 두개골 상단을 잘라냅니다.

머리와 목 뒤쪽의 여분의 조직을 제거하여 해부 부위와 귀 캡슐을 더 깨끗하고 접근하기 쉽게 만듭니다. 조직을 신선한 L-15 용액이 있는 두 번째 페트리 접시로 옮깁니다. 그런 다음 귀 캡슐과 청각 신경, 상전정 신경, 전정 신경, 하부 전정 신경을 찾습니다.

작은 스프링 가위를 사용하여 상신경절과 하신경절을 분리하고 청각 신경을 잘라냅니다. 메스를 사용하여 뼈 융기를 부드럽게 깎아 신경이 뼈 캡슐로 잠수하는 뼈 부위를 약화시킵니다. 메스로 조심스럽게 이물질을 제거하고 신경절의 부풀어 오른 부분 전체를 노출시킵니다.

가는 스프링 가위를 사용하여 요실을 향해 잠수하는 말초 신경 가지에서 신경절을 자르고 분리합니다. 미세한 집게를 사용하여 상부 신경절을 제거하고 신선한 L-15 용액과 함께 35mm 페트리 접시에 옮깁니다. 효소 용액을 예열한 후 효소 혼합물을 35mm 페트리 접시에 붓고 섭씨 37도의 인큐베이터에 10-15분 동안 넣습니다.

미세한 집게와 작은 스프링 가위를 사용하여 뼈, 과도한 조직, 신경 섬유 및 기타 불필요한 구조물을 제거하여 신경절을 청소하십시오. 신경절 조직의 제거를 최소화하도록 주의하십시오. 세척된 신경절을 예열된 효소 용액에 옮기고 10-40분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.

그런 다음 신경절을 신선한 L-35 용액과 함께 15mm 페트리 접시로 옮깁니다. 2-3분 후, 신경절을 여과된 배양 배지로 채워진 다른 35mm 페트리 접시로 옮깁니다. 약 150마이크로리터의 여과된 배양 배지를 코팅된 유리 바닥 접시에 옮깁니다.

그런 다음 원하는 수의 신경절을 커버 슬립에 옮깁니다. 배양 접시에서 소량의 배양 배지를 꺼내고 삼중 피펫을 배지로 헹구어 조직이 유리 피펫의 측면에 달라붙지 않도록 합니다. 신경절이 충분히 해리될 때까지 피펫을 통해 조직을 부드럽고 반복적으로 통과시켜 삼중 작용합니다.

5분 후 광학 현미경으로 세포가 커버 슬립에 정착했는지 확인합니다. 배양 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 조심스럽게 넣어 12-24시간 동안 보관합니다. 다음으로, 머리를 이등분한 후 귀 캡슐을 찾아 집게를 사용하여 가장자리를 깎아 두개골에서 추출합니다.

귀 캡슐의 나선형 부분에는 코르티 기관이 있는 달팽이관이 있습니다. 뼈를 깎아내고, 달팽이관 위에 뼈의 곡선과 평행한 미세한 집게로 회전시킵니다. 작은 스프링 가위를 사용하여 달팽이관 기저부의 모디올러스를 절단하여 나머지 귀 캡슐에서 분리합니다.

작은 스프링 가위를 사용하여 코르티의 기관을 두세 바퀴 잘라 평평하게 놓고 각 회전에서 모디올러스를 절제합니다. 미세한 집게로 밑부분의 줄무늬를 꼬집어 선조체 혈관을 제거합니다. 나선형과 정점 주위로 긴장을 풀어 코르티 기관에서 벗겨냅니다.

나선신경절 뉴런 섬유관이 유모세포를 향해 돌출된 부분의 가장자리를 잘라 나선신경절을 제거한 다음 앞서 본 것처럼 신경절을 청소합니다. 나선형 신경절을 효소로 처리한 후, N2 및 B27이 보충된 배양 배지에서 나선형 신경절을 트리트레이트합니다. 해리된 신경절이 들어 있는 배양 접시를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터에 12-24시간 동안 놓습니다.

피펫 끝을 배양 접시의 깨끗한 용액에 담그고 암포테리신이 포함되지 않은 깨끗한 용액으로 채웁니다. 피펫 뒷면을 암포테리신이 함유된 내부 용액으로 채웁니다. 피펫 팁을 배양 접시의 깨끗한 용액에 다시 담그고 암포테리신은 피펫 뒤쪽에서 팁으로 천천히 들어갑니다.

다음으로, 피펫의 2/3에 해당하는 암포테리신 용액을 피펫에 채우는 것을 마칩니다. 피펫을 기록 챔버의 수조로 내리고 시야 중앙에서 피펫 팁을 찾습니다. 팁에 기포나 기타 이물질이 없는지 확인하십시오.

피펫을 멤브레인 가까이에 놓고 셀 중앙에 단단히 착지합니다. 주사기 또는 구강 피펫을 사용하여 음압 또는 흡입을 가합니다. 마이너스 60밀리볼트의 유지 전위를 켭니다.

씰 저항은 기가 옴을 통과할 때까지 증가해야 합니다. 기가 옴 씰이 형성되면 음압을 해제하십시오. 티로신이 작동하기 전에 입력 저항이 서서히 감소하고 5 밀리 볼트 전압 단계에 응답하여 흐르는 전류는 암포테리신이 멤브레인에 들어가면서 점진적으로 증가합니다.

전정신경절 뉴런에서 유발된 전체 세포 전류의 대표적인 예가 이 그림에 나와 있습니다. 순 내부 나트륨 전류는 여기에서 일시적인 활성화 및 비활성화로 식별됩니다. 순 바깥쪽 전류는 주로 칼륨 이온에 의해 운반되며 나트륨 전류보다 활성화 및 불활성화 역학이 훨씬 느립니다.

과분극 활성화 고리형 뉴클레오티드 개폐 전류 또는 HCN 전류는 장기간 과분극 전압 계열에 의해 활성화됩니다. 기록 중 서로 다른 시점에서 천공된 패치의 이온 채널 특성 분석의 안정성이 이 그림에 나와 있습니다. HCN 전류의 전압 종속 활성화 곡선은 천공된 패치 구성으로 측정되었습니다.

곡선은 시그모이드 모양을 가지고 있으며 긴 녹음 내내 안정적이었습니다. 파열된 패치 모드의 상대적 불안정성은 서로 다른 시점의 겹치지 않는 시그모이드 곡선으로 설명됩니다. 파열된 패치 구성 중 HCN 전류의 활성화 곡선이 여기에 나와 있습니다.

5개의 전정신경절 소마라(vestibular ganglion somara), 5개의 나선형 신경절 뉴런(spiral ganglion neuron)의 발화 패턴과 해당 전류 단계가 여기에 나와 있습니다. 이러한 발화 패턴의 이질성은 전정신경절 뉴런과 나선형 신경절 뉴런 모두에서 기저 나트륨 및 칼륨 채널 구성의 근본적인 다양성을 반영합니다. 이 과정에서 세포 생존을 극대화하려면 기포가 형성되지 않도록 하고, 조직을 과도하게 사용하지 말고, 샘플을 인큐베이터에 넣기 전에 세포가 가라앉도록 하십시오.

천공된 패치 클램프는 세포질 제2 메신저에 의해 조절되는 이온 채널을 연구할 수 있으며, 이는 신경절 뉴런에 대한 원심성 신경전달물질의 효과를 조사하는 데 중요합니다. 이러한 양극성 뉴런의 패치 클램프 기록은 생물물리학적 다양성이 감각 뉴런의 기능적 다양성에 어떻게 기여하는지 밝히는 데 중요한 역할을 했습니다.