Name: 생체 내 체세포 및 내장 자극에 대한 배근 신경절 뉴런의 반응에 대한 칼슘 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: 배우세요 생체 내 칼슘 이미징을 통해 요추 6번 배근 신경절 뉴런이 체세포 및 내장 자극에 반응하는 메커니즘을 실시간으로 관찰하는 방법. 이 기술은 내장통 및 침 치료 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 연구는 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(No. 2022YFC3500702), 중국 국립 자연 과학 재단(82230123, 82174281)의 지원을 받았습니다.

이 동물 프로토콜은 중국 의학원 침술 및 뜸 연구소의 동물 관리 및 사용 윤리 위원회의 승인을 받았으며 동물 사용 및 불편을 최소화하기 위해 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 가이드를 준수합니다. Pirt-cre 마우스는 Johns Hopkins University(Baltimore, MD)의 Dr. Xinzhong Dong이 친절하게 기증했습니다. Rosa26-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s 마우스는 상용 소스에서 얻었습니다(재료 표 참조). 다음 절차는 체중이 20-35g인 마우스의 성별에 최적화되어 있습니다. 수술을 받은 쥐의 권장 연령은 8주에서 14주 사이였다. Pirt-GCaMP6 마우스와 같은 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표(GECI) 또는 바이러스 GECI를 상내 주입한 정상 C57 마우스를 채택하여 DRG 뉴런의 주요 개체군을 보여주었습니다. 바이러스 GECI를 주사하거나 Rosa26-GCaMP 마우스와 교배한 유전자 조작 마우스는 DRG 뉴런의 특정 집단을 보여줍니다. 실험복, 장갑, 마스크는 의정서 내내 착용했습니다. 실험 후, 생쥐는 CO2 흡입 후 경부 탈구로 안락사되었습니다.
1. 수술 전 설정
<ol>
	<li>마취 인공호흡 장치(재료 표 참조)가 제대로 설치되었는지 확인합니다.</li>
	<li>이미징 시스템(재료 표 참조)이 미리 열려 있고 제대로 작동하는지 확인합니다. 
	참고: 작동 및 이미징 절차는 순차적으로 수행되었으며 분석 프로세스는 나중에 오프라인으로 완료할 수 있습니다.</li>
</ol>
2. 마취
<ol>
	<li>마우스에 트리브로모에탄올 용액(1.25%, 250mg/kg, 재료 표 참조)을 복강내 주입13,14,15. 진행하기 전에 발가락 꼬집기를 통해 마취 깊이를 평가합니다.</li>
	<li>허리 아래쪽 부분과 복부 경추 부분의 수염을 면도합니다.</li>
	<li>마우스를 가열 패드의 앙와위 위치에 놓습니다(재료 표 참조).</li>
	<li>동물의 눈에 연고를 발라 눈이 건조해지지 않도록 합니다. 
	참고: 마우스가 모든 수술 및 기록 절차 동안 뒷발 꼬집음에 반응을 보이지 않는 한 마취의 깊이는 유지되었습니다. 동물이 통증의 징후를 보이면 근육 경련을 방지하고 마취 깊이를 보장하기 위해 인공호흡기를 착용한 후 0.2mL의 트리브로모에탄올 용액을 추가로 복강내로 투여하거나 0.5% 이소플루란을 기관내로 투여했습니다.</li>
</ol>
3. 기관절개술
<ol>
	<li>수술용 칼날을 사용하여 흉골에서 턱까지 목구멍 피부를 약 2cm 정도 절개합니다.</li>
	<li>절개 부위를 확장하고 상악 아래 땀샘을 부드럽게 옆으로 밀어 기관 중앙을 따라 세로로 뻗어 있는 땀샘 아래에 위치한 이복근이 완전히 노출되도록 합니다.</li>
	<li>근육 중앙의 기관주위 근육 조직의 이음새가 보이면 근육 조직을 부드럽게 분리하고 수축시켜 열어 기관을 노출시킵니다.</li>
	<li>폐(그림 1A)를 향하는 기관 캐뉼라(외경 1.3mm, 길이 13mm, Y 어댑터 포함, 재료 표 참조)를 수용할 수 있을 만큼 충분히 큰 기관 절개를 기관에 만듭니다.</li>
	<li>기관주위 근육과 상악하선으로 기관을 덮은 다음 5-0 수술 봉합사를 사용하여 주변 조직을 피부에 층별로 봉합합니다.</li>
</ol>
4. 요추 노출
<ol>
	<li>동물을 가열 패드 위에 엎드린 자세로 놓습니다.</li>
	<li>요추-5에서 천골-1 척추까지 허리 아래쪽에 약 7cm의 정중선 절개를 만듭니다.</li>
	<li>longissimus lumborum muscle을 옆으로 움직여 세 척추의 가시 돌기를 조심스럽게 노출시킵니다.</li>
	<li>양측 요추 장근, 등쪽 경추 근육 및 등쪽 경추 반척추 근육의 내부 부분을 옆으로 이동하여 척추 중앙에 기록 세그먼트를 사용하여 연속적인 3개의 관절 돌기와 유반 돌기를 노출시킵니다(그림 1B). 
	참고: 3개의 척추뼈의 관절 돌기와 유방 돌기가 노출되어 척추 클램프가 기록 중 변위 없이 동물을 고정할 수 있도록 했습니다.</li>
</ol>
5. 등뿌리 신경절의 노출
<ol>
	<li>이빨이 있는 집게(재료 표 참조)로 동물을 이웃 척추의 양측 관절 돌기에 단단히 고정시킵니다. 그런 다음 롱거 집게를 사용하여 요추-6 척추의 왼쪽 또는 오른쪽 관절 및 유공 돌기를 제거합니다.</li>
	<li>요추-6 척추의 왼쪽 또는 오른쪽에 있는 온전한 상피신경을 유지하면서 그 위의 결합 조직을 제거한 후 왼쪽 또는 오른쪽 요추-6 DRG를 조심스럽게 노출시킵니다.</li>
	<li>식염수에 적신 작은 면봉으로 노출된 부위를 덮어 노출된 DRG의 활성 상태를 확인합니다. 
	알림: DRG 뉴런의 선명한 이미징에 영향을 줄 수 있으므로 노출된 DRG와 주변 조직 근처에 미묘한 혈액 누출이 없을 때까지 면봉을 교체하십시오. 조직 액체가 빨간색이나 노란색으로 누출되지 않을 때까지 식염수에 적신 작은 면봉을 교체하십시오.</li>
</ol>
6. 고정 및 환기
<ol>
	<li>lumbar-6 DRG가 노출된 동물을 맞춤형 척추 클램프의 스테이지에 있는 가열 패드에 놓습니다.tag이16,17 (그림 1C).</li>
	<li>테스트 중 움직임을 최소화하기 위해 인접한 척추의 척추에 두 개의 클램프를 사용하여 동물을 고정합니다(그림 1D).</li>
	<li>수술 부위가 충분히 깨끗해질 때까지 식염수에 적신 면봉을 계속 교체합니다(그림 1E).</li>
	<li>실험 전반에 걸쳐 인공호흡 및 맥박 산소 측정법을 모니터링합니다. 
	참고: 맞춤형 척추 클램프를 사용하여 척추를 고정한 다음 현미경의 대물렌즈가 DRG에 수직이 되도록 패드의 각도를 조정합니다. 각도 조절기를 사용하여 대물렌즈와 DRG를 정렬하기 위해 필요한 조정을 수행합니다.</li>
</ol>
7. 이미징을 위한 하드웨어 및 소프트웨어 설정
<ol>
	<li>맞춤형 척추 cl 삽입amp 맞춤형으로 설계된 현미경 스테이지(그림 1F,G)에 넣습니다.</li>
	<li>이미징을 위해 노출된 DRG(그림 1G) 위에 컨포칼 현미경의 10x/0.32 긴 작동 거리 공기 대물 렌즈(재료 표 참조)를 배치합니다.</li>
	<li>25μm/step 및 512 x 512 또는 1024 x 1024 픽셀 해상도로 온전한 L-6 DRG의 타임랩스 z-스택을 캡처합니다. 전체 DRG의 한 스택 스캔 시간은 대물 렌즈에 대한 DRG 위치의 직각도, 각 스캐닝 단계의 깊이와 속도, 이미징 해상도와 같은 요인에 따라 5-15초까지 다양합니다.</li>
	<li>1-3개의 기준선 상태, 2-3개의 침술 또는 내장 결장직장 팽창(CRD) 자극, 1-2개의 자극 후 상태를 포함하는 4-8개의 스택으로 DRG의 XYZT 스캔을 수행합니다.</li>
</ol>
8. 침술/내장 자극 및 영상
<ol>
	<li>동물의 허리, 뒷다리 또는 뒷발 부위에 빗질 또는 꼬집기 자극을 가하여 이미지화된 DRG 뉴런의 가장 민감한 수용 영역을 평가합니다(그림 1H).</li>
	<li>침술 자극을 수동으로 또는 시중에서 판매되는 경혈 및 신경 자극기(그림 1F)로 투여합니다(재료 표 참조).</li>
	<li>자체 제작 공기압 게이지 (그림 1H)와 함께 결장 직장 팽창 (CRD)을 사용하여 내장 자극을 유도합니다. 
	참고: lumbar-6 DRG의 수용 영역을 솔질하거나 꼬집어 이미징된 DRG 뉴런의 가장 민감한 수용 영역을 테스트합니다. 이러한 자극이 XYZT 스택 기록 중 형광 변화를 일으키는 경우 허리 경혈 BL25 (Dachangshu)18과 같은 이러한 영역의 경혈을 선택합니다. 요추-6 신경 분포의 수용장 내에 피부와 근육이 있는 경혈(그림 2 참조)을 선택하십시오.</li>
</ol>
9. 데이터 분석 및 처리
<ol>
	<li>체세포 또는 내장 자극에 따라 세포 내 칼슘에 결합할 때 신경 세포 GCaMP의 녹색 형광 증가를 측정하여 컨포칼 현미경을 사용하여 유발된 칼슘 반응을 평가합니다.</li>
	<li>이미징 소프트웨어를 사용하여 보이는 세포를 수동으로 추적하고 세포 크기와 상대적 형광 강도를 결정합니다(피지, 재료 표 참조). 이전 연구를 기반으로 소마 직경이 각각 <20 μm, 20 - 30 μm, >30 μm인 것으로 소뉴런, 중< 및 대형 뉴런을 정의합니다17,sup class="xref">19.</li>
	<li>형광 강도를 기저 수준에 대한 최대 유발 형광 증가의 비율(ΔF/F0) 또는 기저 수준에 대한 최대 유발 형광의 비율(Ft/F0)로 표시하며, 여기서 F0는 기준선 기간 동안 측정된 최대 형광 강도를 나타냅니다.</li>
	<li>활성화된 뉴런의 비율과 유발된 칼슘 과도 상태의 강도를 측정하여 체세포 또는 CRD 자극에 따른 뉴런 반응성의 변화를 평가합니다.</li>
	<li>세포의 활성화를 형광 강도(ΔF)의 증가로 정의합니다≥기준선(F0)의 30%. 
	참고: 보이는 세포를 추적하기 전에 세포 경계를 식별하는 데 도움이 되도록 이미지의 밝기를 최대 수준으로 조정하십시오. 불확실성이 있는 경우 셀을 추적하지 마십시오. 녹화된 동영상을 앞뒤로 검토하여 간과된 셀이 없는지 확인합니다.</li>
</ol>

Advanced Imaging of Dorsal Root Ganglion Neurons for Sensory Modality Research

<ol><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+tactile+acuity+in+chronic+low+back+pain+is+linked+with+structural+neuroplasticity+in+primary+somatosensory+cortex+and+is+modulated+by+acupuncture+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Reduced tactile acuity in chronic low back pain is linked with structural neuroplasticity in primary somatosensory cortex and is modulated by acupuncture therapy.</a> Neuroimage. 217, 116899(2020).</li>
<li>Wei, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+activates+inhibitory+neural+circuits+in+the+somatosensory+cortex+to+relieve+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture activates inhibitory neural circuits in the somatosensory cortex to relieve neuropathic pain.</a> iScience. 24 (2), 102066(2021).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Referred+somatic+hyperalgesia+mediates+cardiac+regulation+by+the+activation+of+sympathetic+nerves+in+a+rat+model+of+myocardial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Referred somatic hyperalgesia mediates cardiac regulation by the activation of sympathetic nerves in a rat model of myocardial ischemia.</a> Neuroscience Bulletin. 38 (4), 386-402 (2022).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+hypersensitivity+as+an+indicator+of+visceral+inflammation+via+c-nociceptor+axon+bifurcation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Cutaneous hypersensitivity as an indicator of visceral inflammation via c-nociceptor axon bifurcation.</a> Neuroscience Bulletin. 37 (1), 45-54 (2021).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+in+population+of+dorsal+root+ganglion+neurons+unravels+novel+mechanisms+of+visceral+pain+sensitization+and+referred+somatic+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging in population of dorsal root ganglion neurons unravels novel mechanisms of visceral pain sensitization and referred somatic hypersensitivity.</a> Pain. 162 (4), 106801081(2021).</li>
<li>Huang, T. Y., Belzer V Fau - Hanani, M., Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+in+dorsal+root+ganglia%3A+possible+contribution+to+visceral+pain%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Gap junctions in dorsal root ganglia: possible contribution to visceral pain.</a> European Journal of Pain. 14 (1), 49.e1-49.e11 (2010).</li>
<li>Wang, Y. L., Su, Y. S., He, W., Jing, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+relieved+visceral+and+referred+hindpaw+hypersensitivity+in+colitis+rats+by+inhibiting+tyrosine+hydroxylase+expression+in+the+sixth+lumbar+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropeptides%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture relieved visceral and referred hindpaw hypersensitivity in colitis rats by inhibiting tyrosine hydroxylase expression in the sixth lumbar dorsal root ganglia.</a> Neuropeptides. 77, 101957(2019).</li>
<li>Weng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+diminishes+P2X2+and+P2X3+purinergic+receptor+expression+in+dorsal+root+ganglia+of+rats+with+visceral+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture diminishes P2X2 and P2X3 purinergic receptor expression in dorsal root ganglia of rats with visceral hypersensitivity.</a> Neural Regeneration Research. 8 (9), 802-808 (2013).</li>
<li>Spencer, N. J., Hibberd, T. J., Lagerström, M., Otsuka, Y., Kelley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visceral+pain+-+Novel+approaches+for+optogenetic+control+of+spinal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Visceral pain - Novel approaches for optogenetic control of spinal afferents.</a> Brain Research. 1693 (Pt B), 159-164 (2018).</li>
<li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+vivo+single-fiber+recording+and+intact+dorsal+root+ganglion+with+attached+sciatic+nerve+to+examine+the+mechanism+of+conduction+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of in vivo single-fiber recording and intact dorsal root ganglion with attached sciatic nerve to examine the mechanism of conduction failure.</a> Journal of Visualized Experiments. 150, e59234(2019).</li>
<li>Ma, C., Nie, H., Gu, Q., Sikand, P., Lamotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+responses+of+cutaneous+C-mechanosensitive+neurons+in+mouse+to+punctate+chemical+stimuli+that+elicit+itch+and+nociceptive+sensations+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">In vivo responses of cutaneous C-mechanosensitive neurons in mouse to punctate chemical stimuli that elicit itch and nociceptive sensations in humans.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (1), 357-363 (2012).</li>
<li>Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+pain+mechanisms+by+calcium+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches.</a> Neuroscience Bulletin. 34 (1), 194-199 (2018).</li>
<li>Yao, L., Ye, Q., Liu, Y., Yao, S., Yuan, S., Xu, Q., Deng, B., Tang, X., Shi, J., Luo, J., Wu, J., Wu, Z., Liu, J., Tang, C., Wang, L., Xu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+improves+swallowing+function+in+a+post-stroke+dysphagia+mouse+model+by+activating+the+motor+cortex+inputs+to+the+nucleus+tractus+solitarii+through+the+parabrachial+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture improves swallowing function in a post-stroke dysphagia mouse model by activating the motor cortex inputs to the nucleus tractus solitarii through the parabrachial nuclei.</a> Nat Commun. 14 (1), 810 PMID: 36781899; PMCID: PMC9925820 (2023).</li>
<li>Tian, D., Liu, B., Huang, S., Shi, W., Tian, Y., Yang, Y., Zhang, D., Zhang, Z., Bu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+Ileus+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Postoperative Ileus Murine Model.</a> J Vis Exp. (209), PMID: 39072642 (2024).</li>
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<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+cluster+firing%2C+a+distinct+form+of+sensory+neuron+activation%2C+drives+spontaneous+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synchronized cluster firing, a distinct form of sensory neuron activation, drives spontaneous pain.</a> Neuron. 110 (2), 209-220 (2022).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2Y12+receptor+as+a+new+target+for+electroacupuncture+relieving+comorbidity+of+visceral+pain+and+depression+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">P2Y12 receptor as a new target for electroacupuncture relieving comorbidity of visceral pain and depression of inflammatory bowel disease.</a> Chinese Medicine. 16 (1), 139(2021).</li>
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<li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 59, e2760(2012).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+dorsal+root+ganglia+in+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of dorsal root ganglia in awake behaving mice.</a> Nature Communications. 10 (1), 3087(2019).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

침술 진통제는 통증 부위의 구심성 자극과 경혈의 자극 사이의 상호 작용을 포함하는 DRG의 통합 과정에 의해 조절되는 것으로 여겨집니다. 여기에서는 L6 DRG 이미징을 위한 정교한 절차를 설명합니다. 이미징의 장점은 놀라운 공간 해상도, 뉴런의 넓은 영역을 동시에 고효율 이미징할 수 있는 가능성, 유전자 표적 프로브를 사용하여 특정 세포 아형 및 세포 내 도메인을 모니터링하는 기능을 포함하여 다양합니다21. 척수에서, 척수 뉴런 활동의 생체 내 이미징을 위해 다중 추궁 절제술 기술이 개발되었습니다22,23. DRG는 척수 근처에 있지만 DRG 세포의 생체 내 이미징은 결합 조직과 근육으로 둘러싸인 위치로 인해 여전히 더 어렵습니다. 이전 연구에서는 체세포 자극 하에서 L5 DRG의 신경 반응을 조사하는 접근 방식을 보여주었습니다24. L5 DRG 뉴런은 내장 구심성 신체 대신 대부분 체세포 구심성 신경을 받기 때문에 체세포 및 내장 입력을 받는 DRG 뉴런의 활동을 조사하기 위한 수술 절차에 대한 의문이 남아 있습니다.
여기에 설명된 방법은 온전한 마우스에 침술 자극 및 내장 자극을 적용하면서 DRG의 유전적으로 정의된 뉴런에서 안정적인 칼슘 이미징을 허용합니다. 대부분의 생체 내 기술에서 언급된 바와 같이, 달성 가능한 이미징 안정성은 척추 안정화 장치 및 적절한 마취에 크게 좌우됩니다25. 본 연구에서는 각도 조절기가 장착된 맞춤형 척추 어댑터를 사용하여 척추의 각도를 편리하게 조정하여 DRG의 선명한 이미지를 얻었습니다. 한 쌍의 Adson 집게는 관절 팔에 부착된 척추 클램퍼 역할을 하도록 수정되어 노출된 DRG 위로 에어 렌즈를 내릴 수 있는 충분한 공간을 확보했습니다. 더 나은 안정성을 제공하기 위해 다양한 척수 세그먼트에 필요에 따라 대체 겸자를 적용할 수 있습니다. 척수와 영상 영역을 클램프에서 약간 매달아 호흡 변위를 줄이는 것이 좋습니다. 이미징 중 변동을 최소화하기 위한 또 다른 중요한 전략은 기계 환기와 결합된 기관 캐뉼라 마취 및 근육 이완제를 사용하는 것입니다.
이 연구는 또한 더 깊은 조직에서 더 나은 세포 해상도를 제공할 수 있는 2광자 이미징에 적용될 수 있습니다. 최근에, Chen et al. 연구자들이 장기간에 걸쳐 깨어 있는 쥐의 DRG에서 뉴런의 활동을 조사할 수 있는 이미징 기술을 개발했습니다26. 그러나 수술 준비의 어려움으로 인해 대부분의 실험실에서 아직 쉽게 사용할 수 없습니다. 또한, 여기에 설명된 방법은 깨어 있는 마우스에서 몇 주에 걸쳐 DRG를 이미징하는 데 적합하지 않지만, ACSF의 관류를 위한 풀을 유지하기 위해 동물의 피부를 링에 꿰맬 수 있기 때문에 약물 적용 및 등근 자극에 이점이 있습니다.
이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항도 있습니다. 기록을 요추 등근 분절로 제한하면 흉부 DRG를 기록하여 흉부 장기 연구와 같이 몸 전체의 다양한 기관을 자극하는 다양한 신경절 분절에 대한 이 기술의 적용 가능성이 제한됩니다. 칼슘 이미징 비디오는 이미징 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. 세포 검출 및 Ca2+ 신호 추출과 같은 칼슘 이미징 데이터 분석에는 어려움이 있습니다. MATLAB에서 맞춤 작성된 스크립트는 효과적인 도구인 것처럼 보이지만 연구원은 프로그래밍 배경 지식이 있어야 합니다.

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Erratum: In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

침술은 전통 중국 의학의 필수적인 부분으로, 주로 만성 내장 통증 완화를 포함한 통증 관리 효과로 인해 전 세계적으로 인정을 받고 있습니다1. 지난 수십 년 동안 침술 진통제의 기저에 있는 중추 신경 메커니즘에 대한 우리의 지식은 상당한 성장을 겪었습니다1,2. 그러나 내장 통각(nociceral nocipion)에서 침술의 진통 효과를 유도하는 배근신경절(dorsal root ganglia, DRG) 뉴런의 기능적 역할을 탐구하는 데는 거의 관심이 기울여지지 않았다. 내장 통각 및 침술 진통 연구는 전기 생리학 기술 또는 기타 신경 기록 방법을 사용하여 1차 감각 뉴런에 대해 잠재적으로 수행됩니다3,4. 이러한 연구는 특정 표적 조직 또는 표적 장기에서 체세포와 내장 입력 사이의 관계를 이해하는 데 도움이 되며, 침술, 내장 통증, 자율신경계 조절 및 관련 의학적 상태와 관련된 상태에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.
체성 감각계의 1차 뉴런인 DRG의 뉴런은 외부 환경과 내부 상태에 대한 정보를 전기 신호로 전달하고 중추 신경계(CNS)로 신호를 전달하는 데 중요한 역할을 하는 1차 감각 뉴런이라고 합니다. 수많은 연구에서 내장 통각(共西 감각)이 세포체가 DRG5,6에 속하는 감각 뉴런에 의해 우세하게 전달된다고 제안했습니다. 수많은 연구에서 침술로 인한 내장 통증에 대한 진통 효과에서 DRG 뉴런의 세포 및 분자 메커니즘을 규명했지만7,8, 기술적 어려움으로 인해 그 기능적 특성에 대한 문헌은 거의 없습니다9. 말초 섬유 기록, 단일 세포 전기 생리학 기록 및 생체 내 칼슘 이미징과 같은 DRG에서 신경 활동을 기록하는 여러 방법을 사용하여 축삭을 따라 전달되는 활동 전위의 패턴과 특성을 기록할 수 있습니다10. DRG의 느슨하게 패치된 유리 전극 기록은 생체 내에서 신경 활동과 다양한 자극 사이의 상관 관계를 조사하는 데 가장 널리 사용되는 기술 중 하나였습니다11. 그러나 전기생리학적 기록과 같은 기존 방법은 생체 내에서 내장 반응 뉴런을 식별하기 위해 충분한 세포 수와 뚜렷한 특정 세포 아형을 효율적으로 검사할 수 없습니다.
말초 감각을 암호화하는 것 외에도 DRG 뉴런은 중추 신경계에 침술 신호를 전달하는 데 중요한 역할을 합니다. 전통적인 전기생리학적 기록은 병리학적 통증에 의해 유도된 DRG 뉴런의 비정상적인 활동에 대한 침술의 조절을 탐구하기 위해 이미 널리 적용되었습니다11. 감각 신경 분포와 관련하여 DRG의 적절한 부분을 관찰해야 합니다. 요추(L) 6 DRG는 일반적으로 결장 조절을 조사하는 것으로 관찰되었습니다4.
최근 광학 및 유전 방법 개발의 발전으로 유전적으로 표지된 뉴런의 대규모 집단의 활동을 동시에 조사할 수 있게 되었습니다12. 그러나 내장 및 신체 자극 하에서 DRG의 신경 활동을 모니터링하기 위한 상세한 칼슘 이미징 방법은 여전히 부족합니다. 따라서 이 프로토콜은 결장 내 및 침술 자극에 대한 L6 DRG 뉴런의 반응성을 생체 내에서 관찰하는 절차를 설명합니다. 여기에 설명된 방법은 체세포 및 내장 감각 뉴런의 특성을 감지하는 데에도 사용할 수 있습니다.
칼슘 영상의 광범위한 적용과 홍보는 침술 연구를 위한 매우 효과적이고 실용적인 도구를 제공합니다. 위에서 언급한 칼슘 영상의 장점을 고려할 때, 이 방법은 침술 연구에 널리 보급되어 적용되었어야 합니다. 그러나 침술 연구에서 칼슘 영상의 활용은 여전히 상대적으로 드뭅니다. 이러한 제한의 주요 원인은 운영 및 기록 절차의 어려움일 수 있습니다. 이 기사의 주요 목적은 마우스에서 L6 DRG 뉴런의 칼슘 이미징 기록 수행에서 몇 가지 중요한 점에 대한 개요를 제공하는 것입니다. 가장 중요한 것은 이 최첨단 도구를 in vivo를 사용하여 침술 연구의 발전과 발전을 촉진하기를 희망합니다.

<table><tbody><tr><td>마취 시스템&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>SomnoSuite</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>STELLARIS 8</td><td></td></tr><tr><td>DC 온도 컨트롤러</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>DC 온도 컨트롤러 가열 패드</td><td>FHC</td><td>40-90-2-05</td><td></td></tr><tr><td>피지 소프트웨어</td><td>국립 보건 연구소</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>미세 가위</td><td>미세 과학 도구</td><td>14558-11</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16220-14</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴 스폰지</td><td>Coltene</td><td>274-007</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 집게</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>Han' s Acupoint 신경 자극기</td><td>Jason Scientific</td><td>HANS-200A</td><td></td></tr><tr><td>삽관 캐뉼라</td><td>Harward 장치</td><td>73-2737</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD</td><td>R510</td><td></td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pirt-cre 마우스</td><td>Johns Hopkins University</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rosa-GCaMP6s&nbsp; 마우스 (AI96)</td><td>Jax Laboratory</td><td>28866</td><td></td></tr><tr><td>척추 어댑터</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>봄 가위</td><td>미세 과학 도구</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Tribromoethanol</td><td>시그마</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 봄 가위</td><td>미세 과학 도구</td><td>15019-10</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 내 체세포 및 내장 자극에 대한 배근 신경절 뉴런의 반응에 대한 칼슘 이미징

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

다양한 내장 및 체세포 자극에 반응하여 노출된 DRG의 생체 내 칼슘 이미징 프로토콜과 함께 마취된 살아있는 실험실 마우스에서 요추-6의 등뿌리 신경절(DRG)을 외과적으로 노출시키는 기술이 설명됩니다. GCaMP6와 함께 패키징된 AAV 바이러스를 상내 주입한 Pirt-GCaMP6 마우스 또는 C57BL6 마우스를 사용하여 Ca2+ 과도 현상을 포착했습니다. 이러한 과도 현상의 진폭은 특정 감각 양상에 대한 민감도를 나타냅니다. 구심성 섬유(afferent fibers)는 내부 장기에서 유래하며, 주요 신경 세포체는 척추 또는 미주신경절(vagal ganglia)에 있습니다. 내장 통각 및 침술 진통에 대한 연구는 생체 내 칼슘 이미징과 같은 고급 이미징 기술을 사용하여 1차 감각 뉴런에 대해 잠재적으로 수행될 수 있으며, 이를 통해 자극 또는 개입 중에 온전한 동물의 뉴런 활동 앙상블을 기록할 수 있습니다. 해당 수용 영역에 적용된 신체 및 내장 자극에 대한 DRG 뉴런 앙상블의 반응을 기록했습니다. 이 기술은 뉴런 개체군이 다양한 유형의 신체 및 내장 자극에 어떻게 반응하는지 보여줍니다. 다양한 자극에 대한 뉴런 앙상블 반응을 종합적으로 비교할 수 있으며, 이는 내장 통증 및 침술과 같은 신체 자극의 분절 메커니즘에 대한 연구에서 특히 유용한 접근 방식입니다.

위의 프로토콜에 따라, 형질전환 Pirt-GCaMP6s 마우스의 요추-6(lumbar-6) DRG를 노출시킨 후, 결장 또는 수용 영역에 내장성 CRD 또는 체성 침 자극을 가했습니다. 본 실험의 목적은 서로 다른 내장성 CRD 및 체성 자극에 의해 유발되는 뉴런의 수와 유형을 관찰하는 것이었습니다.
~에서 보여지는 바와 같이 그림 2A기저 조건에서 요추 6번(lumbar-6) DRG의 신경세포 대부분은 GFP 형광을 나타내지 않습니다. 이러한 기저 형광은 GCaMP의 발현 수준과 수술 중 DRG에 발생했을 가능성이 있는 손상이라는 두 가지 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다. CRD 자극은 GCaMP 형광의 신속하고 일시적인 증가를 유도했으며, 이는 다음에서 확인할 수 있듯이 GFP의 수와 강도의 증가로 나타났습니다. 그림 2B유사한 변화가 다음에서도 나타났습니다. 그림 2C BL25(장수) 전침(EA)을 적용했을 때18BL25는 아래 4번 요추 정중앙선에서 옆으로 3mm 떨어진 곳에 위치합니다.th 하부 장 질환이 있을 때 흔히 사용되는 요추 부위20선택 및 번호가 매겨진 세포들이 원으로 표시되어 있습니다. 그림 2D 이미징 소프트웨어를 사용하여.
위의 프로토콜에서 설명한 바와 같이, F0의 ≥30% 임계값 이상의 형광 강도 변화를 양성 반응으로 간주하였습니다. 그림 2E에서는 CRD(빨간색)와 EA(녹색) 모두에 반응한 뉴런의 병합 이미지를 보여주기 위해 유사 색상을 추가하였습니다. 그림 2E의 화살표가 가리키는 바와 같이, CRD와 EA 모두에 반응한 병합 뉴런이 하나 있었습니다. 그림 2F 및 그림 2H의 히트맵과 선 차트는 이미지 분석 소프트웨어에서 표시한 모든 뉴런의 CRD에 대한 반응을 나타냅니다. 그림 2G는 CRD에 반응한 뉴런들의 다양한 직경에 대한 히스토그램 차트를 보여줍니다. 그림 2I 및 그림 2K의 히트맵과 선 차트는 이미지 분석 소프트웨어에서 표시한 모든 뉴런의 BL25에서 EA에 대한 반응을 나타냅니다. 그림 2J는 EA에 반응한 뉴런들의 다양한 직경에 대한 히스토그램 차트를 보여줍니다. 반응 뉴런의 수와 형광 강도를 분석하는 것 외에도, 그림 2G,J에서 보는 바와 같이 다양한 자극이 가해질 때 서로 다른 크기의 DRG 뉴런들이 나타내는 상이한 반응을 분석할 수 있습니다.
단일 뉴런이 식별되면, 동일하거나 인접한 세포가 서로 다른 자극에 대해 보이는 반응을 분석하는 것도 가능합니다. 이를 통해 DRG 수준에서 서로 다른 내장 및 체성 자극 간의 시간적, 공간적 상호작용을 조사할 수 있습니다.
<img alt="실험 도식 내의 이미징 설정, 신경 노출, 컨포컬 현미경, 인공호흡기가 포함된 마우스 수술." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65975/65975fig01v4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 1"> 
그림 1: 요수-6 DRG 수술 절차. (A) 실험 동물의 기관 절개술. (B) 노출된 세 개의 척추뼈를 보여주는 상단 뷰이며, 왼쪽이 머리 쪽(rostral)이고 오른쪽이 꼬리 쪽(caudal)임. (C) 맞춤형 척추 클램프. 노출된 DRG와 이미징 대물렌즈를 수직 각도로 정밀하게 정렬할 수 있게 해주는 조절 가능한 패드에 유의하십시오. 척추 클램프는 유니버설 볼 유닛으로 제어되어, 기록 대상인 DRG와 대물렌즈의 미세 조정이 가능합니다. (D) 이미징 전 척추 클램프 적용 및 DRG 노출. (E) 확대 이미지는 노출된 왼쪽 요수-6 DRG를 더 자세히 보여줍니다. (F) 이 절차에 사용된 마취용 인공호흡기와 맞춤형 스테이지의 묘사. (G) 대물렌즈 아래에서의 DRG 이미징 과정. (H) 기록 중 체성 및 내장 자극의 모식도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65975/65975fig01largev4.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="뉴런 활성화의 칼슘 이미징 및 데이터 분석; 히트맵, 형광 그래프, CRD, EA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65975/65975fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
그림 2: 요추 6번 DRG 뉴런의 in vivo 칼슘 이미징 대표 이미지 및 분석. (A-C) 기저 상태, CRD 이후, 그리고 BL25 EA 자극 이후의 요추 6번 DRG 뉴런을 나타내는 대표 이미지. (D) 이미징 소프트웨어를 이용한 세포 추적 후, 단일 요추 6번 DRG 내에서 표시 및 번호가 매겨진 세포들을 보여주는 이미지. (E) CRD(빨간색)와 EA(초록색) 자극 모두에 반응하는 요추 6번 DRG 뉴런 앙상블을 보여주는 병합 이미지. 스케일 바 = 100 µm. (F), (H), (I), (K) CRD 및 EA 자극에 반응하여 추적된 세포들의 형광 강도 변화를 보여주는 히트맵 및 선 그래프. (G), (J) CRD 및 EA 자극에 대해 다양한 크기의 반응 세포 수를 묘사함. 오차 막대는 mean ± SEM을 나타냄. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65975/65975fig02largev3.jpg" target="_blank">여기에서 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.</a>

본 프로토콜은 체세포 및 내장 자극에 대한 요추-6 DRG 뉴런의 앙상블의 반응을 측정하기 위한 생체 내 칼슘 이미징을 간략하게 설명합니다. 다른 자극에 반응하는 뉴런 간에 철저한 비교가 이루어질 수 있습니다. 이 프로토콜은 침술과 같은 내장 통증 및 신체 자극의 메커니즘을 조사하는 데 유용합니다.

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the ...

in-vivo-calcium-imaging-dorsal-root-ganglia-neurons-response-to

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Shannonhouse, J., et al. 생체 내 온전한 배근 신경절의 1차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징. J. Vis. 특급 (2023). 이 비디오는 형질전환 마우스의 배측근신경절(DRG)에서 신경 세포 활동을 모니터링하기 위한 생체 내 칼슘 이미징 기술을 보여줍니다. DRG 뉴런은 칼슘에 결합할 때 형광 강도를 증가시키는 칼슘 지표를 발현합니다. 뒷발에 가해지는 기계적 또는 열적 자극은 DRG로 전파되는 활동 전위를 생성하여 뉴런에 칼슘 유입을 유도하고 형광 방출을 증가시킵니다.

In vivo: Calcium Imaging of the Intact Dorsal Root Ganglia of a Mouse(마우스의 온전한 등뿌리 신경절에 있는 신경 앙상블의 생체 내 칼슘 이미징)

작은 투명 몸, 잘 문서화 neuroanatomy 및 의무 유전자 기술과 시약의...

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

이 프로토콜은 후근 신경절(DRG)에 이어 GCaMP3(유전적으로 인코딩된Ca2+ 지표; 녹색 형광 단백질-칼모듈린-M13 단백질 3) 동측 뒷발에 다양한 자극을 가하면서 Pirt-GCaMP3 마우스를 사용하여 신경 앙상블의Ca2+ 이미징.

생체 내 온전한 등근 신경절에 있는 일차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표(GECI)는 감각 뉴런 신호에 대한 강력한 집단 수준 분석을 가능하게 합니다. 여기에서 우리는 쥐의 삼차신경절 뉴런 활동의 생체 내 GECI 시각화를 가능하게 하는 새로운 접근 방식을 개발했습니다.

생체 내 쥐 삼차신경절(Rat Trigeminal Ganglion)의 감각 뉴런의 칼슘 이미징

이 연구는 동기식 ECG 기록과 함께 생체 내 칼슘 이미징을 위해 마취된 마우스의 T-DRG를 노출시키는 외과적 조작을 제시합니다. 이 방법은 말초 전기 신경 자극 및 흉부 내장 기관 입력뿐만 아니라 1차 감각 수준에서의 상호 작용을 연구하기 위한 최첨단 도구입니다.

말초 신경 자극 연구를 위한 생체 내 흉부 등근 신경절(DRG) 칼슘 영상 및 ECG 기록

이 프로토콜은 온전한 삼차신경절(TG) 뉴런의 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징을 설명합니다. 이 설명에는 TG 노출 수술, TG 뉴런의 생체 내 공초점 현미경 이미징, TG 뉴런 현미경 이미징 중 체세포 자극 적용 및 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징 데이터 분석이 포함됩니다.

생체 내 온전한 삼차신경절의 일차 감각 뉴런 네트워크에서 신경 앙상블의 칼슘 이미징

우리는 axonal 부상 다음 지느러미 루트 신경 조직에서 염색질 immunoprecipitation을위한 방법을 제시한다. 접근 방식은 특정 전사 인자 바인딩 사이트와 주변 및 중추 신경계 모두에서 부상을 axons의 재생을위한 히스톤 및 DNA의 중요한 epigenetic 수정을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

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GABA 성 시냅스 억제는 모터와 척수 네트워크에서 감각 신호 통합을위한 중요한 척수에서 강력한 억제 메커니즘입니다. 기초 기본 심성의 탈분극은 후근 전위 (DRP)의 기록에 의해 측정 할 수있다. 여기에서 우리는 생쥐의 DRP의 생체 기록하는 방법을 보여줍니다.

배근 잠재적 기록하여 생쥐의 척수 시냅스 억제를 측정<em&gt; 생체</em

도설 신경절 (DRG)은 말초 신경계의 감각 뉴런을 포함하는 구조이다. 해리 된 때, 그들은 손상 부위에서 생체 내 환경을 모방 관내 신경 재생과 수초 형성을 연구하는 유용한 모델을 제공하고, SC 형 지방 유래 줄기 세포 (ASC)와 함께 공동 배양 될 수있다.

루트 신경절 신경 세포와 차별화 된 지방 유래 줄기 세포를 이룬다 :<em&gt; 체외</em&gt; 공동 문화 모델은 주변 신경 재생을 연구하는

배우세요 생체 내 칼슘 이미징을 통해 요추 6번 배근 신경절 뉴런이 체세포 및 내장 자극에 반응하는 메커니즘을 실시간으로 관찰하는 방법. 이 기술은 내장통 및 침 치료 연구에 필수적인 도구입니다.

생체 내 체세포 및 내장 자극에 대한 배근 신경절 뉴런의 반응에 대한 칼슘 이미징

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