<em>In Vivo</em> Confocal Fluorescence Imaging of Neural Activity Induced by Sensory Stimulation in Partially Restrained Larval Zebrafish

Joseph B. Alzagatiti; Luis Salazar; Heidi Brown; Gabriel Rosas; Lama Adel Jaber; Jaime L. Minaya; Courtney Scaramella; Adam C. Roberts; David  L. Glanzman

doi:10.3791/67301

생체 내 부분적으로 구속된 유충 제브라피시에서 감각 자극에 의해 유도된 신경 활동의 공초점...

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Neuroscience

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In Vivo Confocal Fluorescence Imaging of Neural Activity Induced by Sensory Stimulation in Partially Restrained Larval Zebrafish

생체 내 부분적으로 구속된 유충 제브라피시에서 감각 자극에 의해 유도된 신경 활동의 공초점 형광 이미징

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05:12 min

April 18, 2025

DOI: 10.3791/67301-v

Joseph B. Alzagatiti^1,2, Luis Salazar³, Heidi Brown³, Gabriel Rosas³, Lama Adel Jaber³, Jaime L. Minaya³, Courtney Scaramella⁴, Adam C. Roberts³, David L. Glanzman^2,5,6

¹Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology,University of California, Santa Barbara, ²Department of Integrative Biology and Physiology,University of California, Los Angeles, ³Department of Psychology,California State University at Fullerton, ⁴Department of Neuroscience,University of California, Riverside, ⁵Department of Neurobiology,David Geffen School of Medicine at UCLA, ⁶Integrative Center for Learning and Memory, Brain Research Institute,David Geffen School of Medicine at UCLA

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a detailed protocol for examining neural activity in brain regions of transgenic zebrafish expressing GCaMP calcium indicators using confocal microscopy. It aims to investigate dynamic changes in neural activity in response to stimulation, particularly focusing on fluorescence intensity in specific regions.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Neuroimaging
Transgenic models

Background

Transgenic zebrafish models allow for real-time imaging of neuronal activity.
GCaMP indicators provide a method for monitoring calcium fluctuations as a proxy for neural activity.
Confocal microscopy offers high spatial resolution to observe fluorescence intensity changes in neurons.
The protocol allows for precise control of imaging conditions to optimize data acquisition.

Purpose of Study

To develop a robust methodology for assessing GCaMP-mediated neural activity.
To characterize the time-lapse imaging responses in specific neuronal clusters of zebrafish.
To investigate the effects of certain stimuli on neural activity dynamics.

Methods Used

Confocal microscopy was used to visualize neuronal activity in vivo.
Transgenic zebrafish larvae aged 2–7 days post fertilization served as the biological model.
Laid out critical steps for acclimatization and imaging settings.
Included post-imaging analysis using Fiji software for assessing fluorescence intensity.

Main Results

The application of aloe isothiocyanate resulted in increased GCaMP fluorescence, indicating heightened neural activity.
Changes in imaging speed affected spatial and temporal resolution of neuronal visualization.
Normalized fluorescence intensity measurements facilitated the generation of neural traces over time.
Neurons in the hindbrain and spinal cord displayed significant activity changes in response to stimulus.

Conclusions

This study establishes a valuable imaging protocol for analyzing neural dynamics in zebrafish.
Findings enhance understanding of the relationship between stimuli and neuronal behavior.
Insights contribute to the broader comprehension of neural mechanisms and plasticity.

Frequently Asked Questions

What advantages does the zebrafish model offer?

The zebrafish model provides a transparent organism with rapid development, allowing for real-time imaging of neural activity in a living system.

How are the larvae prepared for imaging?

Larvae are embedded in low melting point agarose and positioned dorsal side up in embryo medium before imaging.

What types of data can be obtained?

Data includes time-lapse fluorescence imaging revealing changes in calcium dynamics associated with neuronal activity.

How can the method be adapted for other studies?

The protocol can be modified for various stimuli or fluorescent reporters to investigate different aspects of neural function.

What are some limitations of this technique?

Potential limitations include variations in zebrafish genetics and the challenge of capturing very fast neural activity due to resolution constraints.

여기에서는 컨포칼 현미경을 사용하여 GCaMP 칼슘 지표를 발현하는 형질전환 제브라피쉬의 뇌 영역에서 신경 활동을 조사하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

[강사] 시작하려면 배아 배지에 3% 저융점 아그로스를 준비하고 아그로스를 손상 없이 얼룩말 물고기를 조작하기에 안전한 온도로 가열합니다. 농업이 식고 굳기 전에 수정 후 2-7일 된 유충을 바닥이 유리로 된 페트리 접시에 등쪽이 위로 향하도록 배치합니다. 유충이 제자리에 있는 상태에서 농구가 굳으면 접시에 배아 배지 5밀리리터를 추가합니다. 메스를 사용하여 유충 주변에서 필요에 따라 아그로를 자릅니다. 얼룩말 물고기가 담긴 페트리 접시를 공초점 현미경의 스테이지로 옮깁니다. 20분 동안 적응한 후 명시야 이미징을 사용하여 실온에서 40배 침수 대물렌즈 아래 물고기를 중앙에 배치합니다. 형광 분자의 품질과 발현 수준, 조직의 깊이 및 광학 특성에 따라 공초점 현미경 획득 매개변수를 설정합니다. 레이저 출력과 마스터 게인 설정을 조정하여 형광등을 최적의 범위에서 적절하게 포착하고 G 캠프 성공 의존 형광의 불필요한 손실을 방지합니다. 그런 다음 척수의 부분에 있는 신경 클러스터의 시야를 중앙에 둡니다. 픽셀당 0.119제곱마이크로미터의 공간 해상도로 초당 1.20프레임의 프레임 속도로 79.86제곱마이크로미터의 시야각으로 시계열 스캔을 수행합니다. 실험의 목표에 따라 시야, 크기 및 획득 속도를 조정합니다. 이미징 시작 2분 후, 41.67마이크로리터의 알로에 이소티오시아네이트 원액 또는 배아 배지를 접시에 추가하고 약 30초 동안 계속 기록하여 타임랩스 이미징을 통해 관심 영역에서 G Camp 6의 활성 변화를 관찰합니다. 기록된 출력이 도트 TIF 파일 형식이 아닌 경우 다운스트림 피지 분석을 위해 현미경 소프트웨어 제품군에서 이미지 파일을 도트 TIF 파일로 내보냅니다. 신경 추적 분석을 위해 피지 소프트웨어를 다운로드한 후 피지를 열고 도트 CZI 파일을 프로그램으로 가져옵니다. 피지의 원 또는 자유형 도구를 사용하여 해당 아이콘을 클릭하여 관심 영역이나 뉴런을 강조 표시합니다. 관심 지역 또는 ROI를 선택한 후 Fiji 도구 모음에서 분석, 도구 및 ROI 관리자를 클릭합니다. Add T(T 추가)를 클릭하여 선택한 ROI를 ROI 관리자 창에 추가합니다. ROI 관리자에서 더보기 및 다중 측정값을 클릭하여 ROI를 분석합니다. 설정을 기본값으로 두고 확인을 클릭하여 원시 데이터를 생성합니다. 그런 다음 Python 또는 스프레드시트를 사용하여 추가 조작을 위해 출력을 CSV 파일로 저장합니다. 이제 원시 데이터를 정규화하여 2분 전자극의 마지막 30초를 평균화하여 신경 추적으로 표현하고 주어진 공식을 사용하여 정규화된 형광 강도를 생성하고 정규화된 데이터를 신경 추적으로 플로팅합니다. 알로에 이소티오시아네이트의 투여는 유충 제브라피쉬의 국소 뇌 영역 내에서 G CAMP 6S 형광의 증가를 일으켰으며, 이는 향상된 신경 활동을 나타냅니다. 초당 0.10프레임의 느린 캡처 속도에서 후뇌와 척수의 뉴런이 고해상도로 선명하게 보였습니다. 캡처 속도를 초당 0.79프레임으로 높이면 공간 해상도가 약간 손실되었지만 시간 해상도는 향상되었습니다. 초당 3.16프레임에서 뉴런은 더 많은 시간적 역학을 포착하는 동안 덜 뚜렷하게 나타났습니다.

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