Name: 성체 마우스에서 해마 미세아교세포의 분리 및 전체 세포 패치-클램프 기록 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:47:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 학습하세요 성체 마우스 해마에서 미세아교세포를 분리하고 전체 세포 패치-클램프 기록을 수행하는 방법을. 효소 소화와 세포 분류를 활용한 이 기술은 미세아교세포의 이온 채널 활성을 정확히 분석하여 신경생물학 연구에 활용됩니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>성체 마우스에서 채취한 해마 미세아교세포의 전기생리학적 기록

<ol><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
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<li>Zelenka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+protocol+for+the+isolation+of+highly+purified+neonatal+murine+microglia+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Novel protocol for the isolation of highly purified neonatal murine microglia and astrocytes.</a> J Neurosci Methods. 366, 109420(2022).</li>
<li>Keren-Shaul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+microglia+type+associated+with+restricting+development+of+alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A unique microglia type associated with restricting development of alzheimer's disease.</a> Cell. 169 (7), 1276-1290.e17 (2017).</li>
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<li>Ramesha, S., Rayaprolu, S., Rangaraju, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+approach+to+characterize+phagocytic+properties+of+acutely-isolated+adult+microglia+and+brain+macrophages+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry approach to characterize phagocytic properties of acutely-isolated adult microglia and brain macrophages in vitro.</a> J Vis Exp. 160, e61467(2020).</li>
<li>Mccarthy, K. D., De Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li>
<li>Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+used+for+studying+synaptic+transmission+in+slices+of+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain.</a> Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>100mm 페트리 접시</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>15mL Falcon 튜브</td><td>BD 352096</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>BD</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>35mm 페트리 접시</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>353001-50mL Falcon 튜브</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m 세포 스크리닝</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td>세포 분류 전에 세포 덩어리를 제거하기 위해</td></tr><tr><td>성인 마우스 뇌 해리 키트</td><td>Miltenyi</td><td>130-107-677</td><td></td></tr><tr><td>항-CD11b 항체</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA74</td><td>염소 항마우스 IgG도 사용할 수 있습니다. 내인성 면역글로불린 차단용.</td></tr><tr><td>항-Iba 1 항체</td><td>SYSY</td><td>234308</td><td>염소 항기니피그 IgG)도 사용할 수 있습니다. 내인성 면역글로불린 차단용.</td></tr><tr><td>Axon Digidata 1440A</td><td>미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axon MultiClamp 700B 증폭기</td><td>미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA 알부민 분획 V</td><td>BioFrox</td><td>4240GR500</td><td>혈청</td></tr><tr><td>C57BL/6 마우스&nbsp;</td><td>광동 의료 실험실 동물 센터</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11 b/c MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-105-634</td><td></td></tr><tr><td>클로랄 수화물</td><td>압신 abs47051394</td><td></td><td>마우스의 마취로 널리 사용</td></tr><tr><td>Clampfit 10.6</td><td>미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>공초점 현미경</td><td>Zeiss</td><td>&nbsp; LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>배양 배지</td><td>피셔 사이언티픽</td><td></td> <td>C11995500BT-DAPI</td></tr> <tr><td>염료</td><td>비요타임</td><td>C1002</td><td></td></tr><tr><td>전극 풀러</td><td>나리시게</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Servicebio</td><td>G4203</td><td></td></tr><tr><td>수평 셰이커</td><td>SCILOGEX</td><td>SLK-O3000-S</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>피지</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS 컬럼</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS 분리기</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td>1X PBS, pH 7.2-7.4.&nbsp에 신선한 4% 용액을 사용합니다.</td></tr><tr><td>폴리-L-라이신</td><td>비요타임</td><td>&nbsp; C0313</td><td>커버슬립 코팅</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>시그마</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

성체 마우스에서 해마 미세아교세포의 분리 및 전체 세포 패치-클램프 기록

Isolation and Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Hippocampal Microglia from Adult Mice

간단히 말해서, 이 과정에는 성체 쥐의 뇌에서 해마 미세아교세포를 분리한 다음 이러한 세포를 전체 세포 패치 클램프 기록하는 것이 포함됩니다(그림 1). 이 절차는 3-5개월 된 C57BL/6J 성체 쥐의 해마를 해부하는 것으로 시작됩니다. 구체적으로 말하자면, 관류 후 뇌 전체를 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 배양 접시에 넣습니다(그림 2A). 해마에서 세포를 급성으로 분리하기 위해 대뇌 피질을 제거하고 초승달 모양의 해마 조직을 그대로 분리합니다(그림 2B).
최적의 세포 품질과 그에 따른 고품질 전체 세포 패치 클램프 기록을 위해서는 단일 세포 현탁액을 준비하는 동안 분해 시간을 제어하는 것이 중요합니다. 이 연구는 효소 혼합물의 해마 조직을 일관되게 수동으로 교반하고 소화 시간을 15분 이하로 엄격하게 제한했습니다(그림 3). 그런 다음 MACS 방법을 사용하여 세포를 분리하여 86.20% ± 0.68%19,20의 순도를 달성했습니다. 이렇게 분류된 세포가 미세아교세포임을 확인하기 위해 미세아교세포18을 검출하는 데 널리 사용되는 anti-Iba1 및 anti-CD11b 항체를 사용하여 면역형광으로 미세아교세포 표면 마커를 테스트했습니다. 그 결과 분리된 세포가 CD11b 및 Iba1 양성임을 나타내어 미세아교세포의 성공적인 분리를 확인했습니다(그림 4).
마지막으로, 급성으로 분리된 미세아교세포가 후속 실험을 위한 고품질인지 여부를 평가하기 위해 미세아교세포칼륨 전류를 평가하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기록을 수행하는 방법을 설명합니다. 기록된 미세아교세포의 평균 멤브레인 커패시턴스는 10.42 ± 2.05였습니다(그림 5). 그 결과 미세아교세포(microglial potassium) 전류가 기록될 수 있음을 보여주었으며, 이는 급성으로 고립된 미세아교세포가 신경생물학적 연구에 적합하다는 것을 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig01.jpg"> 
그림 1: 실험 절차의 개요. 네 가지 주요 단계가 있습니다: 뇌 조직을 조심스럽게 추출하고 해마를 양측으로 절개합니다. 해마 조직을 절단하여 프로토콜 섹션에 자세히 설명된 대로 효소 혼합물을 사용하여 단일 세포 현탁액을 제조합니다. 표적 세포는 자기 활성화 세포 분류 방법에 의해 격리됩니다. 그리고 급성으로 고립된 세포의 칼륨 전류는 전체 세포 패치-클램프 기록에 의해 분석됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig02.jpg"> 
그림 2: 해마 해부 절개. (A) 생후 3-5개월 된 쥐의 뇌 전체. (B) 고립된 양측 해마. 눈금 막대: 0.5cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig03.jpg"> 
그림 3: 해마 조직의 소화를 보여주는 개략도. 중요한 실험 단계의 그림으로, 최대 15분 동안 연속 진탕하면서 37°C에서 효소 혼합물을 추가하여 해마 조직이 단일 세포 현탁액으로 소화되도록 합니다. 이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig03large.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig04.jpg"> 
그림 4: 급성으로 분리된 해마 미세아교세포의 식별. 해마에서 정제된 CD11b(녹색) 및 Iba1(빨간색) 양성 세포를 보여주는 대표적인 컨포칼 이미지로, 분리된 세포가 미세아교세포임을 확인합니다. 눈금 막대 : 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig05.jpg"> 
그림 5: 전체 세포 미세아교세포 칼륨 전류의 기록. (A) 기록 전극은 고립된 해마 미세아교세포의 표면에 위치합니다. 스케일 바 : 20 μm. (B) 전압 클램프 조건에서 급성으로 분리 된 해마 미세 아교 세포의 대표적인 칼륨 전류. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Microglia are resident immune cells in the brain that interact with neurons to maintain the homeostasis of the central nervous system (CNS). Studies show ...

isolation-whole-cell-patch-clamp-recording-hippocampal-microglia-from

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

절연 hippocampi에서 급성 뇌 조각뿐만 아니라 astrocytes와의 뉴런의 동시 electrophysiological 레코딩의...

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

이 비디오는 성인 쥐의 뇌 피질에서 미세아교세포를 분리하는 기술을 보여줍니다. 첫째, 피질은 뉴런과 다른 신경교세포를 제거하기 위해 세분화와 균질화를 거쳐 미세아교세포를 보존합니다. 그 후, 세포 현탁액은 항 미엘린 자기 마이크로비드와 자기장에 노출되어 미엘린 파편과 미엘린을 포함하는 세포에서 미세아교세포와 골수성 세포를 효과적으로 분리합니다.

성인 마우스 뇌의 피질에서 미세아교세포의 분리

이 비디오는 형질주입된 쥐 해마 뇌 절편에서 시냅스 상호 작용 및 신경 반응을 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 여기에는 활동 전위를 트리거하기 위해 장거리 감각 뉴런을 조명하고 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 기록된 뉴런에서 결과로 발생하는 흥분성 시냅스 후 전위를 기록하는 것이 포함됩니다.

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

이 비디오는 고립된 해마에서 세타 진동이라고도 하는 리드미컬한 뉴런 네트워크 활동을 기록하는 방법을 보여줍니다. 전극은 세타 진동을 감지하고 분석하기 위해 다양한 층과 공간 위치에 삽입됩니다. 이것은 독특한 뉴런 구성과 해마의 여러 층에 걸친 뉴런 네트워크의 연결성을 보여줍니다.

마우스 해마의 세타 진동에 대한 시험관 내 기록

미세 아교 세포 생물학의 성공적인 조사에 하나의 키는 CNS의 조직으로부터 분리하는 동안 생체 미세 아교 immunofunction의 보존이다. 형광 이미징, 면역 세포 화학, 및 염증성 자극 지질 다당류 (LPS)와 팸 3 CSK 4 (팸)와 ELISA 다음 미세 아교 세포의 활성에 의해 평가 매우 순수하고 immunofunctional 세포 배양에 회전 흔들림 결과를 통해 미세 아교 세포를 분리.

쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리

대뇌 피질의 네트워크는 억제의 interneurons의 작지만 다양한 설정에 의해 제어된다. 의 interneurons의 기능 조사 그러므로 표적으로 기록하고 엄격한 확인이 필요합니다. 세포 내 라벨, 사후 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석 신경 세포의 단일 또는 시냅스 결합 쌍에서 전체 셀 녹음을 포함하는 통합 접근 방식은 여기에 설명한다.

Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

여기에서, 우리는 격리 된 전체 해마 제조물로부터 리듬 뉴런 네트워크 세타 및 감마 진동을 기록하기위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 해마 추출에서 현장, 단일 및 전체 세포 패치 클램프 녹음뿐만 아니라 theta 리듬의 광 발생기 페이싱에 이르기까지의 실험 단계를 설명합니다.

Hippocampal 쎄타 밴드의 튜닝<em&gt; 체외에서</em&gt; : 격리 된 설치류 Septohippocampal Circuit에서 기록하는 방법론

우리는 성인 마우스 뇌 반구의 다른 해부 된 영역에서 microglia의 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 전체 길이 전사체의 깊은 단일 세포 RNA 시퀀싱을위한 반자동 라이브러리 준비를 제공합니다. 이 방법은 건강과 질병에서 microglia의 기능적 이질성을 해명하는 데 도움이됩니다.

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

우리는 마우스의 등간 중간 해마에서 급성 슬라이스를 준비하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 기록의 품질과 기록 된 뉴런의 형태학적 특징의 보존 측면에서 관상 슬라이스와이 트랜스 버사제 준비를 비교합니다.

성인 마우스의 덴테이트 자이루스에서 전신 기록 및 신경 재건을위한 등산 해마에서 급성 슬라이스의 준비

이 논문은 정밀하게 제어된 수술과 이광자 현미경을 사용하여 마우스 해마 CA1에서 휴식 미세아교세포를 만성적으로 생체 내에서 관찰하는 방법을 설명합니다.

생체 내 마우스 해마에서 미세아교세포의 만성 이광자 이미징

우리는 상대적으로 짧은 시간에 MACS(magnetically activated cell sorting)를 사용하여 쥐의 시상하부(또는 이에 상응하는 작은 뇌 구조)에서 미세아교세포를 분리하는 프로토콜을 설명합니다. MACS 분류된 시상하부 미세아교세포는 체외 분석에 사용할 수 있으며 in vitro 분석을 수행하기 위해 도금할 수 있습니다.

Isolation of Hypothalamic Microglia from Freshly Perfused Adult Mouse Brain by Magnetic-Activated Cell Sorting  

학습하세요 성체 마우스 해마에서 미세아교세포를 분리하고 전체 세포 패치-클램프 기록을 수행하는 방법을. 효소 소화와 세포 분류를 활용한 이 기술은 미세아교세포의 이온 채널 활성을 정확히 분석하여 신경생물학 연구에 활용됩니다.

성체 마우스에서 해마 미세아교세포의 분리 및 전체 세포 패치-클램프 기록

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