성체 마우스에서 해마 미세아교세포의 분리 및 전체 세포 패치-클램프 기록

우리의 연구는 이온 채널 활동을 이해하기 위해 칼륨 전류를 포함하여 전체 세포 기록을 위해 미세아교세포를 급격하게 분리하는 데 중점을 둡니다. 이 프로토콜은 또한 다양한 뇌 영역의 미세아교세포를 분리하는 데 적용할 수 있어 다양한 신경학적 상태에서 제로에 대한 통찰력을 제공합니다.

우리 연구 분야의 가장 최근 발전에는 형광 활성 세포 분류를 통한 미세아교세포 정제와 결합된 전통적인 췌장염 효소 소화의 사용이 포함됩니다. 이러한 발전으로 인해 추가 연구를 위해 특정 미세아교세포 집단을 분리하는 정확성과 효율성이 향상되었습니다.

우리의 프로토콜은 1차 배양 CS에 의존하지 않고 성체 마우스 해마에서 직접 미세아교세포의 전기생리학적 특성을 조사합니다. 이 접근 방식을 사용하면 기본 환경에서 미세아교세포 기능을 보다 정확하게 분석할 수 있습니다.

우리의 결과는 생리학적 및 질병 조건 모두에서 미세아교세포의 생화학적 및 기능적 특성에 대한 새로운 과학적 질문의 길을 열었고, 연구자들에게 이러한 측면을 더 탐구하는 데 귀중한 지침을 제공했습니다.

[발표자] 시작하려면 마취된 동물을 해부대에 바로 누운 자세로 놓고 팔다리를 고정합니다. 가슴을 노출시키고 얼음처럼 차갑고 멸균된 PBS로 심장을 관류하여 혈관 내 순환 혈액 세포를 제거합니다. 그런 다음 머리를 잡고 가위로 뇌 정중선을 따라 피부를 잘라 두개골을 노출시킵니다. 다음으로 작은 가위로 두개골의 뒤쪽을 양측과 눈구멍 사이로 자릅니다. 시상 봉합사를 따라 두개골을 자르고 핀셋으로 두개골을 제거합니다. 그 후 뇌 조직을 빠르게 추출하십시오. 이제 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 10cm 배양 접시에 뇌 조직을 넣습니다. 핀셋으로 대뇌 피질을 양측으로 해부합니다. 해마 조직을 분리하여 더 작은 조각으로 자릅니다. 조각을 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 해마 조직의 작은 조각을 얼음처럼 차가운 행크스 균형 소금 용액 또는 HBSS 2밀리리터에 다시 현탁시킵니다. 그리고 실온에서 300G에서 3분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버린 후, 해마 조직 조각이 들어 있는 15밀리리터 원심분리기 튜브에 1,950마이크로리터의 효소 혼합물 1을 첨가합니다. 원심분리기 튜브를 섭씨 37도의 수조에서 5분 동안 계속 흔듭니다. 다음으로, 새로 준비된 효소 혼합물 30마이크로리터를 15밀리리터 원심분리기 튜브에 추가합니다. 1밀리리터 피펫 팁으로 조직 조각을 위아래로 20회 피펫팅하고 섭씨 37도에서 지속적으로 흔들면서 수조에서 5분 동안 배양합니다. 원심분리기 튜브를 제거한 후 큰 조직 조각이 남지 않을 때까지 1밀리리터 피펫으로 현탁액을 위아래로 여러 번 피펫팅합니다. 그런 다음 70마이크로미터 세포 스크리닝 필터를 통해 세포 현탁액을 여과하고 깨끗한 50밀리리터 원심분리기 튜브에 여과액을 수집합니다. 여과액을 새 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 300G에서 원심분리합니다. 그런 다음 1밀리리터 피펫으로 상청액을 버립니다. 이제 세포 현탁액을 15밀리리터의 HBSS로 위아래로 20회 피펫팅하여 세척하고 섭씨 4도에서 10분 동안 300G에서 원심분리합니다. 상청액을 버린 후, 세포 펠릿을 자기 활성화 세포 분류 완충액 1밀리리터에 다시 현탁합니다. 시작하려면 준비된 단일 세포 현탁액 1밀리리터를 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 3분 동안 300G에서 원심분리합니다. 상청액이 제거되면 단일 세포 펠릿을 90마이크로리터의 자기 활성화 세포 분류 또는 최대 완충액에 다시 현탁합니다. 10마이크로리터의 CD11b 또는 c 마이크로비드를 첨가하고 현탁액을 섭씨 4도에서 수평 셰이커에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 최대 완충액 1밀리리터를 튜브에 직접 추가하여 단일 세포 현탁액을 세척합니다. 원심분리 후, 세포 펠릿을 500마이크로리터의 최대 완충액에 다시 현탁합니다. 1밀리리터 피펫을 사용하여 재현탁된 세포 현탁액을 자기장의 분류 컬럼으로 옮깁니다. 자기장에 남아 있는 동안 500마이크로리터의 최대 완충액으로 컬럼을 세 번 세척합니다. 그런 다음 자기장에서 분류 열을 제거합니다. 컬럼에 최대 완충액 1밀리리터를 추가하고 피스톤으로 천천히 밀어 넣습니다. 흐름을 수집합니다. 이제 선택한 세포를 폴리-L-라이신으로 코팅된 커버 슬립이 포함된 24웰 플레이트에 시딩합니다. 200마이크로리터의 배양 배지를 첨가하고 95% 산소, 5% 이산화탄소 및 60-80% 습도가 있는 섭씨 37도 인큐베이터에서 20분 동안 배양합니다. 시작하려면 생쥐 뇌 조직에서 분리된 배양된 미세아교세포를 섭취하십시오. 40x 대물렌즈를 사용하여 수중 현미경 아래에서 구형 미세아교세포를 찾습니다. 다음으로, 전극에 세포내 용액을 채우고 전기생리학 설정의 증폭기 헤드 스테이지에 부착합니다. 양압을 가합니다. 4x 대물렌즈로 전환하고 전극을 찾습니다. 그런 다음 전극을 수조 용액에 내립니다. 앰프를 볼륨으로 설정tage clamp 수조 모드에서 멤브레인 테스트를 수행하는 모드입니다. 그런 다음 40x 대물렌즈로 다시 전환하고 전극 팁을 미세아교세포에 더 가깝게 이동합니다. 다음으로, 세포를 고정하기 위해 작은 음압을 가합니다. 저항이 100메가옴에 도달하면 멤브레인 테스트에서 수조 모드에서 패치 모드로 전환합니다. 저항이 300메가옴에 도달하면 음압을 해제합니다. 저항이 전극과 미세아교세포막 사이에 기가옴 씰이 형성되었음을 나타내는 경우. 멤브레인 테스트에서 패치 모드에서 세포 모드로 전환합니다. 그런 다음 소량의 흡입을 가하고 전기 충격을 시작하여 멤브레인을 파열시킵니다. 전압 클램프 모드로 전환한 후 녹음 프로그램을 열고 200밀리초 동안 칼륨 전류를 녹음합니다.