Click Chemistry and Expansion Microscopy를 사용한 세포 내 사이알릴화 시각화

여기에서는 대사 올리고당 엔지니어링, 클릭 화학 및 확장 현미경 검사를 결합한 간단한 프로토콜을 제안하며, 이를 통해 일상적인 현미경 장비를 사용하여 향상된 해상도로 세포 내 시알릴화된 N-당단백질의 바이오이미징을 가능하게 합니다.

당사는 높은 공간 분해능으로 세포 내 시알릴화 당접합체를 시각화하기 위한 간단한 프로토콜을 제시하여 특수 장비의 필요성을 제거합니다. 이 방법은 다양한 병리학적 맥락에서 생합성, 밀매 및 재활용에 대한 연구를 용이하게 합니다. 이를 위해 당사는 대사 라벨링, 클릭 화학 및 확장 현미경을 결합합니다.

STED 및 STORM과 같은 초고해상도 현미경 기술을 통해 과학자들은 회절 장벽을 능가할 수 있지만 값비싼 장비가 필요합니다. 최근에는 팽창 현미경이 샘플을 물리적으로 확대하여 해상도를 향상시키는 보다 접근하기 쉬운 대안으로 부상하고 있습니다. 이 방법은 모든 일상적인 전체 자원 현미경과 함께 사용할 수 있습니다.

비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 접근하기 어렵고 광범위한 최적화가 필요한 초고해상도 현미경이 필요하지 않습니다. 따라서 이 방법은 대부분의 실험실로 쉽게 이전할 수 있습니다. 먼저 준비된 세포에 500마이크로몰의 N-아지도아세틸만노사민이 보충된 배지 1ml를 추가하고 5% 이산화탄소 분위기에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다.

그런 다음 PBS 1ml로 샘플을 세척합니다. 500마이크로리터의 5% 파라포름알데히드를 사용하여 각 커버 슬립에 셀을 고정하고 실온에서 15분 동안 그대로 둡니다. 다음으로, 뚜껑이 있는 불투명 상자를 사용하여 맞춤형 습한 챔버를 준비합니다.

젖은 압지 조각을 바닥에 놓고 그 위에 파라필름을 한 겹 얹습니다. 파라필름에 커버 슬립을 세포가 위를 향하도록 놓습니다. 세포 투과화를 위해 실온에서 15분 동안 PBS에 0.5%Triton X-100 200마이크로리터를 첨가합니다.

그런 다음 200마이크로리터의 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 주어진 성분을 사용하여 엔지니어링된 아지드 변형 시알릴화 글라이칸을 라벨링하기 위해 CuAAC 반응 버퍼를 준비합니다. 반응을 시작하려면 각 커버 슬립에 200마이크로리터의 CuAAC 버퍼를 추가하고 샘플을 철저히 덮습니다.

그런 다음 200마이크로리터의 PBS로 커버 슬립을 세 번 세척하여 반응을 멈추고 과도한 프로브와 시약을 제거합니다. 섭씨 4도에서 1시간 동안 샘플을 200마이크로리터의 BSA 차단 버퍼에서 배양합니다. 커버 슬립에 1차 항체가 포함된 용액 70마이크로리터를 추가하고 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 각 커버 슬립에 형광 2차 항체 100마이크로리터를 추가하고 빛으로부터 보호된 실온에서 1시간 동안 배양합니다. PBS로 커버 슬립을 세 번 세척한 후 커버 슬립을 6웰 플레이트로 옮기고 샘플을 섭씨 4도의 PBS 2밀리리터에 담아 며칠 동안 빛으로부터 보호합니다. 먼저 기계식 셰이커에서 PBS에 들어 있는 밀리리터당 3.2mg의 농도로 n-아크릴로일숙신이미드가 포함된 면역염색 세포를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 1ml의 PBS로 샘플을 세 번 세척합니다. 이제 파라필름 조각에 70마이크로리터의 단량체 용액을 떨어뜨립니다. 1.4 마이크로 리터의 10 %N, N, N'N'Tetramethylethylenediamine 및 10 % ammonium persulfate를 첨가 한 다음 방울에 혼합합니다.

셀이 아래를 향하도록 용액에 커버 슬립을 빠르게 놓습니다. 용액이 습한 챔버에서 실온에서 1시간 동안 중합되도록 합니다. 다음으로, 하이드로겔에 1ml의 소화 완충액을 추가하고 기계식 셰이커에서 섭씨 37도에서 3시간 동안 분해를 진행합니다.

소화 완충액을 제거한 후 2ml의 탈이온수로 젤을 세 번 씻습니다. 이제 하이드로겔을 3ml의 탈이온수로 2시간 동안 팽창시키면서 30분마다 물을 교체합니다. 시작하려면 현미경을 켜고 광원이 예열되었는지 확인하십시오.

그런 다음 바이오이미징 획득 소프트웨어를 엽니다. 채널을 만들려면 형광단에 해당하는 레이저 여기 파장을 선택하고 그에 따라 레이저를 활성화하십시오. 1.4 개구수를 가진 63x 오일 이멀젼 대물렌즈 또는 이에 상응하는 대물렌즈와 같은 적절한 대물렌즈를 선택하십시오.

이제 32mm 직경의 커버 슬립을 현미경에 맞게 조정된 홀더에 넣고 고정합니다. 면역염색 세포 샘플을 세포가 아래를 향하도록 32mm 커버 슬립에 놓고 탈이온수 한 방울을 추가하여 샘플이 건조되는 것을 방지합니다. 그런 다음 커버 슬립이 있는 홀더를 현미경 스테이지에 놓고 대물렌즈 위에 놓습니다.

확장 후 이미징의 경우 커버 슬립에 하이드로겔을 놓고 타일 스캔을 수행합니다.명시야 또는 낮은 레이저 강도 형광 모드를 사용하여 관심 영역을 찾고 초점을 맞춥니다. 그런 다음 스캔 속도, 평균 번호, 방향, 스캔 모드, 방법 및 핀홀 크기와 같은 이미지 획득 매개변수를 설정하여 원하는 관찰을 얻을 수 있습니다.

이제 Live Fluorescence 모드를 사용하여 소프트웨어에서 세포를 시각화합니다. 레이저 출력을 점진적으로 증가시키고 검출기 게인과 오프셋을 조정하여 과도한 노이즈를 도입하지 않고 신호를 증폭하여 과다 노출 없이 선명한 형광 시각화를 보장합니다. 마지막으로 이미지 획득을 수행하고 원하는 형식으로 데이터를 저장하여 나중에 참조할 수 있도록 적절한 메타데이터를 포함합니다.

수집이 완료되면 핀셋을 사용하여 쉽게 전달할 수 있도록 소량의 탈이온수를 추가하고 샘플을 6웰 플레이트로 다시 옮깁니다. 평균 핵 Feret 직경은 팽창 전 17.7μm에서 팽창 후 70.3μm로 증가하여 4의 팽창 계수를 나타냅니다. 팽창 현미경 검사 전의 섬유아세포 마킹 패턴은 골지체의 세포 내 세부 사항을 나타내는 눈에 띄는 적색 및 녹색 형광을 보였지만 해상도가 제한되어 사내 분석을 방해했습니다.

확장 현미경 검사 후, 섬유아세포 내에서 더 복잡한 녹색 및 빨간색 소포가 보이면서 세포 내 구조의 공간 해상도가 크게 향상되는 것이 관찰되었습니다.