유도된 구조적 변화의 평가를 위한 식물 기생 선충을 사용한 감자 뿌리의 생체 내 및 체외 감염

이 프로토콜은 생체 내 온실 조건에서 Solanum tuberosum 뿌리를 식물 기생 선충과 감염시키고 광학 현미경을 통한 뿌리 구조의 조직화학적 분석을 위해 감자 체외 형질전환 뿌리를 감염시키는 것을 설명합니다.

작물의 기생충 선충 감염에 대한 연구는 환경 조건의 가변성에 영향을 받으며, 이는 실험 결과와 데이터 재현성에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.

우리는 식물 기생 선충류를 사용한 감자 형질전환 뿌리의 시험관 내 배양을 공간을 덜 차지하고 얻는 데 더 적은 시간이 필요하며 오염이나 숙주 유전적 변이성이 없는 신뢰할 수 있는 대안으로 개발했습니다.

작물 뿌리에서 선충 감염의 시간적 진행을 추적하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 감별 염색 기술은 감염 부위를 식별하고 선충 생활 단계를 정밀하게 구별하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

온실 시험과 비교할 때 감자 무거운 뿌리는 계절적 또는 기후 변화와 관계없이 선충 발달의 모든 단계를 제공하기 위한 지속적인 제어 시스템을 지원합니다.

따라서 설명된 프로토콜은 몇 가지 유망한 미래 응용 프로그램을 제공합니다. 예를 들어, 식물 기생 선충이 숙주를 감염시키고 조작하는 방법에 대한 통찰력을 제공하는 분자 및 세포 메커니즘에 대한 자세한 연구가 가능합니다.

[해설자] 시작하려면 흐르는 수돗물에 당근을 씻은 다음 일반 세제 용액으로 잔해물을 제거하십시오. 종이 타월로 말리면 멸균 된 금속 꼬치를 당근 윗부분에 안쪽으로 약 1-2cm 정도 삽입합니다. 노즐이 장착된 세척병을 사용하여 당근을 96% 에탄올로 적십니다. 멸균된 여과지에 당근의 아래쪽 끝을 닦아냅니다. 그런 다음 조심스럽게 불꽃에 통과시킵니다. 멸균 필러를 사용하여 당근을 위에서 아래로 껍질을 벗기고 불을 붙이는 것을 반복합니다. 상단과 하단 부분을 버린 후 중간 부분을 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 멸균 칼날과 핀셋을 사용하여 1cm 두께의 부분을 자릅니다. 절편을 멸균 페트리 접시로 옮깁니다. 접시를 밀봉한 후 당근 디스크를 살균하기 위해 양면에 60분 동안 자외선 아래에 보관합니다. 당근 디스크를 어둠 속에서 섭씨 25도에서 1-2주 동안 배양합니다. 다음으로, 멸균 칼날을 사용하여 당근 디스크 중앙에 X자 모양의 절개를 하고 절반 깊이만 자릅니다. 최소 50개의 혼합 생활 단계를 포함하는 50마이크로리터의 뿌리 병변 선충 현탁액을 절개 부위에 피펫팅합니다. 페트리 접시를 밀봉한 후 암울한 곳에서 섭씨 25도에서 최대 3개월 동안 배양합니다. 뿌리 병변 선충을 추출하려면 눈에 보이는 괴사가 있는 당근 디스크를 멸균 유리 그릇에 넣은 직경 8cm의 75마이크로미터 메쉬 체로 옮깁니다. 그런 다음 디스크가 덮일 때까지 체 위에 항생제 용액을 붓습니다. 어두운 곳에서 하룻밤 배양한 후 멸균된 피펫을 사용하여 선충류를 그릇 바닥에서 멸균된 유리 염색 블록으로 옮깁니다. 염색 블록에 항생제 용액 1밀리리터를 피펫팅하고 선충이 30-40분 동안 가라앉도록 합니다. 사용한 항생제 용액을 피펫팅하고 세척 과정을 4-5회 반복합니다. 뿌리 병변 선충 현탁액을 즉시 사용하거나 섭씨 11도에서 보관하십시오. 같은 크기의 감자 괴경을 선택하고 구멍, 타박상 또는 부드러운 부분이 있는 것은 버립니다. 5리터 냄비에 오토클레이브 토양과 모래의 일대일 혼합물을 채우고 22.5g의 서방성 NPK 비료를 섞습니다. 그런 다음 토양 표면 아래 9cm 깊이에 감자를 뿌립니다. 화분을 습도 50-70%의 온실에 놓습니다. 토양 수분을 최대 수분 보유 용량의 70%로 유지하기 위해 자주 물을 주고 극한의 온도를 피하십시오. 감자 식물이 나오면 각 식물 주위에 고르게 분포된 4-6개의 구멍을 만들어 깊이를 확인합니다. 30,000개의 살아있는 혼합 생활 단계 뿌리 병변 선충류가 들어 있는 8밀리리터의 현탁액을 구멍에 피펫팅합니다. 그런 다음 토양 혼합물로 구멍을 덮습니다. 대조군 화분과 뿌리 병변 선충이 포함된 화분의 경우 접종 당일 물주기를 자제하십시오. 두 달 동안 배양한 후 감자 식물을 뿌리째 뽑고 새싹과 뿌리를 분리하여 무게를 측정합니다. 뿌리 시스템을 조심스럽게 씻으십시오. 적절한 염색 기술을 사용하여 RLN 공격 부위의 뿌리를 검사합니다. 씻어서 멸균한 감자 괴경을 용기에 담습니다. 괴경을 25% 상업용 표백제 용액으로 덮습니다. 용기를 닫고 15분 동안 섞습니다. 표백제를 버리면 살균된 수돗물로 괴경을 세 번 헹굽니다. 다음으로, 플로우 후드에서 괴경을 80% 에탄올 용액에 15분 동안 격렬하게 교반하면서 담급니다. 에탄올을 피펫팅한 후 멸균된 수돗물로 세 번 헹굽니다. 멸균 메스로 괴경의 주변 부분을 제거하십시오. 내부 중앙 조각을 0.5cm 두께의 세그먼트로 나눕니다. 절편을 접종하려면 먼저 1밀리리터의 Rhizobium rhizogenes 현탁액과 9밀리리터의 SH 배지를 혼합합니다. 멸균 메스 끝을 희석된 현탁액에 담그고 감자 조각의 표면을 다섯 번 감습니다. 세그먼트가 건조되면 반고체 SH 배지에 놓고 플라스미드 형질감염을 용이하게 하기 위해 어두운 곳에서 섭씨 25도에서 3일 동안 배양합니다. 셋째 날이 끝나면 감염된 세그먼트를 항생제가 보충된 반고체 SH 배지가 들어 있는 플레이트로 옮깁니다. 3개월 후 멸균 핀셋을 사용하여 1g의 형질전환 뿌리 클러스터를 수집합니다. 신선한 반고체 항생제가 없는 SH 배지를 사용하여 뿌리를 플레이트 중앙으로 옮깁니다. 선충 알 덩어리를 수집하려면 뿌리 담즙을 얻으십시오. 멸균 초미세 포인트 핀셋을 사용하여 20배 배율로 설정된 쌍안 실체 현미경에서 계란 덩어리를 조심스럽게 추출합니다. 계란 덩어리를 5밀리리터의 멸균 수돗물이 담긴 뚜껑이 있는 페트리 접시에 넣고 48시간 동안 부화시킵니다. 다음으로, 플로우 후드에서 밀리리터당 100마리의 선충류를 함유한 J2 현탁액 5밀리리터를 20마이크로미터 메쉬 체에 피펫팅합니다. 멸균 수돗물로 세척한 후 J2 선충류가 함유된 체의 아래쪽 절반을 20% 과산화수소 용액에 담그고 15분 동안 원을 그리며 혼합합니다. 멸균 수돗물을 체를 통해 선충 위에 분배하고 세척 과정을 두 번 반복합니다. 최종 세척 중에 선충이 경계에 모이도록 체를 기울입니다. 그런 다음 체 경계에서 멸균 초순수 1밀리리터를 피펫팅하여 선충을 회수합니다. 흐름 후드에서 1g의 감자 형질전환 뿌리 덩어리를 100개의 멸균 선충이 있는 SH 플레이트에 계대 배양합니다. 100배 배율의 도립 현미경으로 공동 배양을 정기적으로 모니터링합니다. 알 덩어리가 보이면 뿌리를 새로운 SH 배지 플레이트로 계대 배양합니다. 당근 디스크를 사용하면 3개월 이내에 선충 개체수가 평균 100배 증가했습니다. 감자 식물은 낮은 뿌리 병변 선충 개체군 수에서 눈에 띄는 증상을 보이지 않았습니다. 산성 푹신으로 염색한 후 뿌리 피질에서 Pratylenchus penetrans의 여러 생활 단계가 관찰되었으며, 이는 조직의 침투 및 관련 괴사성 병변이 감염된 부위에서 명확하게 보였음을 나타냅니다. 감자 형질전환 뿌리의 발달은 감자 괴경 절편에서 메스 유발 상처를 따라 초기 세포량 성장을 보였고, 이어서 형질전환 뿌리의 출현을 보였습니다. 배양 배지에서 뿌리의 지속적인 성장이 관찰되었고 뿌리 덩어리는 지속적인 성장을 위해 신선한 배양 배지로 성공적으로 옮겨졌습니다. 감자 형질전환 뿌리 배양은 식물 선충 공동 배양을 확립하기 위해 Meloidogyne chitwoodi 2단계 어린 새끼와 성공적으로 감염되었습니다. 감염된 배양에서 성인 암컷과 알 덩어리를 포함하는 뿌리 담즙이 관찰되었습니다. Meloidogyne chitwoodi에 의해 형성된 담즙 조직은 형질전환 감자 뿌리의 감염 후 알 덩어리와 알의 형성을 포함하여 식별 가능한 선충 발달 및 번식의 뚜렷한 단계를 가진 것으로 보였습니다.