향상된 뇌 형광 염색 및 면역 염색을 위한 초파리 머리의 직접 동결 절편

우리 팀은 Drosophila model을 사용하여 대사, 심장, 근육 수면 및 노화 장애를 연구합니다. 이 Jove 논문은 참수, 고정, 냉동 절제, 염색 및 이미징을 포함하여 뇌 조직 처리를 위한 간소화된 프로토콜을 자세히 설명했습니다. 우리 연구 그룹은 여러 가지 인간 질병과 노화를 연구하기 위해 초파리 모델 개발을 개척했습니다.

우리는 또한 시간 제한 섭식 및 운동과 같은 중재를 조사했습니다. 우리는 기계 학습, 오믹스 및 분자 접근 방식을 사용하여 일주기 리듬 및 유전학과 같은 요인을 연구하여 세포 무결성, 생리학 및 행동에 미치는 영향을 밝힙니다. 이 간소화된 초파리 뇌 연구 프로토콜은 복잡한 해부를 피하고, 한 손으로 실행하기만 하면 되며, 값비싼 컨포칼 현미경 검사의 필요성을 제거하여 접근성을 높이고 장비 의존도를 줄입니다.

시작하려면 노화된 바이알에 있는 파리를 얻은 다음 이산화탄소 매트의 밸브를 열고 파리를 매트에 재빨리 버려 탈출을 방지합니다. 파리가 대부분 의식을 잃게 되면 대물 렌즈 아래로 매트를 이동하여 SZ61 현미경 아래에 파리를 배치합니다. 파리가 명확하게 보이고 목을 베기 편할 때까지 배율과 초점을 조정합니다.

스프링 가위를 사용하여 칼날을 흉부와 파리의 머리 사이에 놓고 단단히 짜서 실험 그룹당 5-10개의 파리 머리를 참수합니다. 사용한 파리와 사용한 파리를 노화된 바이알에 다시 넣습니다. 브러시를 사용하여 목이 잘린 파리 머리를 얼음 위에 놓인 라벨이 붙은 1.5ml 튜브에 부드럽게 옮깁니다.

얼음에서 튜브를 제거한 후 100%파라포름알데히드와 PBS를 4마이크로리터씩 각 튜브에 피펫팅하여 모든 플라이 헤드가 완전히 잠기도록 합니다. 헤드가 튜브 벽에 부착되면 브러시를 사용하여 부드럽게 아래로 밀거나 튜브를 수평 표면에 가볍게 두드려 용액과 적절하게 접촉하도록 합니다. 그런 다음 중간 설정으로 오비탈 쉐이커에서 15분 동안 튜브를 배양합니다.

파라포름알데히드 용액을 버리고 PBS로 교체하여 모든 플라이 헤드가 물에 잠기도록 합니다. 최종 세척 후 플라이 헤드를 PBS의 10% 자당 용액으로 옮겨 튜브 안에 잠기도록 합니다. 라벨이 부착된 금형에 최적의 절단 온도 또는 OCT 화합물로 약 50% 용량까지 채워 금형의 네 모서리 전체로 퍼질 수 있도록 합니다.

브러시를 사용하여 수집된 고정 플라이 헤드를 금형 내의 OCT 화합물 표면에 조심스럽게 놓습니다. 집게 끝을 사용하여 각 머리를 금형 바닥으로 부드럽게 밀어 눈이 관상동맥 평면을 절단하기 위해 아래쪽을 향하도록 합니다. X, Y 및 Z 치수의 모든 헤드를 조심스럽게 정렬하여 모든 섹션에 모든 실험 그룹이 동시에 포함되도록 합니다.

헤드를 적절하게 정렬한 후 금형을 섭씨 영하 20도로 설정된 냉동고에 직접 조심스럽게 넣어 얼립니다. 금형이 거의 얼면 남은 공간을 OCT 화합물로 채웁니다. 주형 동결 절제의 경우 주형 상단에 충분한 양의 OCT 화합물을 도포하여 척 비트를 주형에 부착합니다.

비트를 위에 평평하게 놓고 저온 유지 장치 내부에서 완전히 얼게 하는데, 일반적으로 5분이 걸립니다. 그런 다음 비트와 OCT 블록을 금형에서 분리합니다. 블록을 척에 놓고 위에서 아래로 적절한 방향이 유지되는지 확인하고 블록이 제자리에 단단히 고정될 때까지 척 키를 조입니다.

조정 손잡이와 척 깊이 컨트롤을 사용하여 블록을 블레이드에 맞춥니다. 저온 유지 장치의 절편 폭을 20마이크로미터로 설정하고 롤 방지 유리가 각 조각을 캡처할 수 있도록 하면서 느리고 일관된 동작으로 각 조각을 자릅니다. 그런 다음 따뜻한 슬라이드를 사용하여 슬라이드를 섹션의 더 가까운 가장자리로 터치하고 섹션이 슬라이드 위로 올라갈 수 있도록 합니다.

슬라이드를 실온에서 최소 30분 동안 건조시키지만 1시간을 넘지 않도록 합니다. 동결 절제된 초파리 플라이 헤드를 잡고 면도날을 사용하여 슬라이드 가장자리에 남아 있는 OCT 화합물을 제거하여 소수성 경계를 위한 공간을 남겨둡니다. 그런 다음 소수성 마커를 사용하여 각 슬라이드 주위에 테두리를 그리고 5분 동안 건조시킵니다.

슬라이드를 부드럽게 피펫으로 PBS를 사용하여 5분씩 모든 슬라이드를 세 번 세척합니다. 슬라이드를 세척한 후 Tris Buffered Saline 차단 용액에 3%BSA를 피펫으로 넣고 슬라이드에 30분에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 차단 용액을 버리고 1차 항체 용액을 슬라이드에 피펫팅합니다.

항체를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하거나 물티슈를 사용하여 실온에서 1시간 동안 배양하여 건조를 방지합니다. 기본 항체 용액을 버리고 PBS를 사용하여 슬라이드를 각각 5분씩 세 번 세척합니다. 그런 다음 슬라이드에 2차 항체 용액을 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

PBS로 슬라이드를 세 번 세척한 후 슬라이드에 소량의 PBS만 남겨 두십시오. 다음으로, 1000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 DAPI가 들어있는 경화 장착 매체를 3-5 방울 떨어뜨려 슬라이드에 고르게 추가합니다. 덮개 슬립을 슬라이드에 놓고 배치하는 동안 기포가 형성되지 않도록 합니다.

새로 장착된 슬라이드를 조심스럽게 다루고 장착 매체가 완전히 마를 때까지 평평하게 보관하십시오. 장기간 보관이 필요한 경우 슬라이드의 가장자리를 밀봉하십시오. 형광 감소를 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 슬라이드의 이미지를 캡처합니다.

이미지를 획득하는 동안 모든 실험 그룹 간에 일관성을 유지하기 위해 동일한 채널의 각 고유 피사체에 초점을 맞춥니다. 선택한 모든 채널에서 노출 과다를 방지하기 위해 각 채널의 노출을 보정합니다. 선택한 노출이 일정하게 유지되고 모든 피험자, 특히 다른 실험 그룹 간에 적절한지 확인합니다.

ApoE 항체 태그의 발현은 Elav+ 및 Elav-ApoE4 표본의 뇌 영역에서 명확하게 국한되었습니다. 지질 축적은 나일강 적색 염색으로 표시되었으며, 이는 두 유전자형 모두에서 뇌 영역에서 볼 수 있었습니다.