마우스 망막의 신경교세포(glial interactions)를 연구하기 위한 생체 외 이식 모델(Ex vivo Explant Model for Study Glial Interactions in the Mouse Retina)

우리는 전 세계적으로 돌이킬 수 없는 실명의 주요 원인인 녹내장의 신경염증을 이해하고 싶습니다. 특히, 우리는 망막의 신경교 지지 세포가 질병 진행 중 신경 손실에 어떤 영향을 미치는지 연구하고 있습니다.

성상세포 및 미세아교세포와 같은 신경아교세포는 녹내장 진행에 영향을 미치는 것으로 생각되지만 살아있는 동물 모델에서 신경 기능을 연구하는 데 사용되는 많은 도구는 이러한 세포에 적합하지 않습니다. 망막 외식편은 신경염증과 신경교 기능을 연구하는 데 사용되지만 학습 곡선은 가파르다. 우리의 프로토콜은 더 접근하기 쉽게 만들고 기술을 더 널리 채택할 수 있기를 바랍니다.

기존의 체외 세포 배양과 비교하여 당사의 외식편 접근 방식은 내부 망막에 있는 세포의 자연 환경을 더 잘 보존하여 생리적 기능을 보다 정확하게 조사할 수 있습니다.

[해설자] 시작하려면 추출된 마우스 눈을 멸균된 실온 PBS로 채워진 해부 접시에 넣습니다. 적절한 고정 지점을 식별하고 각진 겸자로 잡은 다음 각막에서 시신경까지의 전후축이 수평으로 위치하도록 하면서 물에 잠긴 실험실 물티슈 위에 눈을 부드럽게 배치합니다. 각진 겸자로 단단히 고정하면서 11번 메스 끝을 사용하여 각막이 공막으로 전환되는 윤부와 평행하고 약 0.5mm 뒤쪽으로 절개합니다. 스프링 가위의 한 날을 지구본 내부에 삽입하고 눈 주위를 사두엽으로 자르고 필요에 따라 집게로 위치를 변경합니다. 윤연부 절단을 완료한 후 겸자로 전안부와 수정체를 제거합니다. 긴 시신경 조각이 남아 있으면 가는 가위를 사용하여 1-2mm 길이로 다듬습니다. 그런 다음 아이컵이 위쪽을 향하도록 돌려 육안 검사가 가능하고 유리체 제거가 용이합니다. 각진 겸자를 계속 사용하여 아이컵을 고정하고 망막에 눈에 보이는 손상이 있는지 검사하고 유리체실에서 망막 색소 상피 또는 맥락막의 색소 세포 파편이 있는지 검사합니다. 수정된 이송 피펫을 사용하여 유리체 챔버를 PBS로 세척하고 기포를 방지하기 위해 피펫 팁을 물에 담그십시오. 그런 다음 고운 수채화 브러시로 망막과의 접촉을 최소화하면서 더 큰 이물질을 부드럽게 제거합니다. 잔해물이 지속되는 경우 망막에 금속이 직접 닿지 않도록 끝이 가는 집게를 조심스럽게 사용하십시오. 눈에 보이는 파편을 제거한 후, 이송 피펫에서 PBS로 유리체 챔버를 3-5회 세척하고 미세한 브러시를 사용하여 주변 근처에서 잔류 모양체 요소를 조사하여 브러시 섬유의 항력에 의해 유리체를 감지합니다. 유리체 주머니가 남아 있으면 망막 손상을 방지하기 위해 섬유가 얕은 각도로 이어지도록 브러시로 주변을 향해 바깥쪽으로 쓸어냅니다. 끝이 닿은 상태에서 한 쌍의 집게를 닫은 위치로 잡고 취급 중에 형성된 자연스러운 틈을 사용하여 망막과 맥락막 사이에 부드럽게 삽입합니다. 집게의 평평한 팔을 사용하여 완전히 분리될 때까지 망막과 맥락막 사이의 공간을 점차적으로 확대합니다. 한 쌍의 집게로 샘플을 계속 안정화하고 두 번째 집게를 사용하여 공막과 맥락막을 포함한 안컵을 아래로 부드럽게 당깁니다. 망막이 아이컵과 함께 하강하는 경우 집게를 사용하여 시신경유두를 피하고 나머지 연결 지점을 부드럽게 조사하고 분리합니다. 그런 다음 망막이 여전히 시신경 유두에 고정된 상태에서 조직을 계속 안정적으로 유지하고 두 번째 겸자를 사용하여 시신경 유두 아래에 안구 컵을 묶습니다. 특히 모양체가 남아 있는 부위에서 잔류 유리체로 인해 망막 주변이 접히지 않았는지 검사합니다. 필요한 경우 전사 피펫을 사용하여 PBS로 챔버를 세척하고 브러시를 사용하여 접힌 망막을 부드럽게 풀고 과도한 유리체를 제거합니다. 망막이 양쪽에서 노출된 후 스프링 가위를 사용하여 망막 주변에서 시신경 유두를 향해 약 90도 떨어져 일련의 완화 절단을 합니다. 물에 잠긴 조직을 잡고 집게를 사용하여 실험실 물티슈를 샘플에서 옆으로 당겨 떼어내고 망막을 건드리지 않고 접시에서 제거합니다. 망막을 제자리에 고정한 상태에서 스프링 가위를 사용하여 망막 바로 아래의 시신경을 절단합니다. 그런 다음 접시에서 남은 아이컵 티슈를 조심스럽게 들어 올려 제거합니다. 이제 35mm 페트리 접시에 PBS를 채우고 집게를 사용하여 거칠고 무광택 면이 위쪽을 향하도록 필터 사각형을 바닥에 놓고 주름이 생기지 않도록 합니다. 그런 다음 이송 피펫을 사용하여 망막을 부드럽게 흡인하여 페트리 접시로 옮깁니다. 브러시를 사용하여 내부 표면이 위를 향하도록 망막의 방향을 잡고 필터 사각형 바로 위에 배치합니다. PBS를 천천히 흡인하여 망막을 필터 위로 내립니다. 망막이 필터에 안착되면 브러시를 사용하여 주변 주름을 부드럽게 펼칩니다. 망막 안정성과 수분 공급의 균형을 맞추기 위해 PBS 수준을 조정하여 조직을 건조시키지 않고 부드러운 브러시 움직임을 허용합니다. 이제 이송 피펫을 사용하여 약 1cm 위에서 PBS를 떨어뜨려 표면을 헹구고 망막에 이물질이 있는지 다시 검사합니다. 35mm 접시의 뚜껑을 닫고 생물 안전 캐비닛으로 가져갑니다. 닫힌 접시를 내부 표면이나 장비에 닿지 않고 생물 안전 캐비닛 내부에 놓습니다. 무균 작업으로 전환할 때 장갑을 멸균하거나 교체하고 이식편 배지가 미리 로드된 6웰 플레이트를 인큐베이터에서 생물안전 캐비닛으로 옮깁니다. 캐비닛 내에서 35mm 접시의 뚜껑을 제거하고 각진 집게를 사용하여 망막에 닿지 않고 필터 사각형을 들어 올립니다. 그런 다음 6웰 플레이트를 열고 필터를 한 웰의 인서트 중앙으로 부드럽게 내려 배지에 천천히 담급니다. 망막이 필터에서 분리되면 필터를 천천히 옆으로 옮기고 각진 집게를 사용하여 우물에서 제거합니다. 1밀리리터 피펫을 사용하여 인서트에서 500마이크로리터의 배지를 흡인하여 인서트와 공기-액체 인터페이스 사이에 망막을 가둡니다. 마지막으로 6웰 플레이트의 뚜껑을 덮고 인큐베이터로 되돌려 망막이 웰 내 중앙에 유지되도록 합니다. 망막 아교세포의 대규모 변화를 조사하기 위해 3일 이식된 망막을 배양하는 대신 분리 직후 고정된 가짜 외식편과 비교했습니다. 가짜 망막의 미세아교세포는 규칙적이고 겹치지 않는 분포 패턴을 보인 반면, 3일째에는 이식된 망막의 조직이 불규칙해졌고 세포가 뭉쳐 나타나 이동을 암시했습니다. 가짜 망막의 망막 성상세포는 맥관 구조와 밀접하게 정렬되어 시험관 내 3일 후에 크게 감소했습니다. 뮬러 세포에서의 GFAP 발현은 가짜 망막에서는 희미하거나 존재하지 않았지만 시험관 내 3일째, 특히 조직 가장자리 근처에서 뚜렷하게 보였습니다. 시험관 내에서 하루 후, 미세아교세포는 3일째까지 조밀한 아메바 형태로 진행된 과정 수축 및 활성화의 초기 징후를 보였습니다. 24시간 표시에서 Brn3a를 사용하여 정량화된 망막 신경절 세포 밀도는 가짜 외식편에 비해 배양 외식편에서 완만하지만 현저한 감소를 보여주었습니다. 항상성 미세아교세포 마커인 TMEM119는 가짜 망막에서 높게 발현되었지만 시험관 내 3일 후에는 거의 검출되지 않았습니다. 유세포를 표시하는 CD206 발현은 시험관 내 배양 3일 후에도 안정적으로 유지되었습니다. GFAP 염색은 해부 및 취급 중에 입은 기계적 손상 부위 주변의 성상세포 및 뮬러 세포 반응성을 나타냈습니다.