체외에서 인간 배아 줄기 세포의 생체내의 Bioluminescence 리포터 진 영상에

생체 내에서 기형종 형성은 세포의 다능성 또는 세 가지 배아층을 모두 형성할 수 있는 능력을 결정하기 위한 황금 표준입니다. 기형종은 또한 줄기세포 이식에 큰 장애물이며, 현재 성장 역학에서 기형종의 형성에 대해 알려진 바는 거의 없습니다. 미분화 세포가 숙주 환경에 이식되면 생물 발광 리포터, 유전자 전달 및 초고감도 전하 결합 소자 또는 CCD 사진의 개발로 생체 내 세포 위치 이동, 증식 및 분화에 대한 비침습적 반복 평가가 가능해졌습니다.

이 비디오에서는 살아있는 쥐에서 이식된 인간 배아 줄기 세포 증식을 효과적으로 추적하기 위한 자세한 프로토콜을 시연합니다. 안녕하세요, 저는 스탠포드 대학교 의학 및 방사선학과 Joseph Wu 연구실의 Kit Wilson입니다. 오늘은 체외(in vitro) 및 살아있는 쥐에 이식한 후 인간 배아 줄기 세포를 이미징하는 절차를 보여드리겠습니다.

이러한 절차에는 인간 배아 줄기 세포의 체외 생물 발광 이미징, 생체 내 이미징 및 이식된 세포의 생체 내 이미징을 위한 마우스 준비 및 줄기 세포 주입 단계가 포함됩니다. 따라서 이러한 절차의 몇 가지 주요 구성 요소를 검토하는 것으로 시작하겠습니다. 인간 배아 줄기 세포의 생물 발광 이미징을 수행하려면 먼저 유비퀴틴 또는 eef one alpha 배양과 같은 구성 프로모터에 의해 구동되는 반딧불이 루시퍼라제와 같은 EL 루시페라제 리포터 유전자를 안정적으로 발현하는 세포를 확보해야 합니다.

당사는 일반적으로 표준 Y cell 프로토콜을 따르며 상태 배지 또는 상업용 피더 프리 배지를 사용하여 마트리겔로 코팅된 6개의 웰 플레이트를 사용합니다. 루시퍼라제 양성 세포를 검출하려면 이미 이를 수행할 준비가 된 리포터 프로브 d Lucifer가 필요합니다. 1-1.5 밀리리터 제제의 분취 루시퍼를 밀리리터당 45 밀리그램의 최종 농도로 만듭니다.

사용하지 않을 때는 부분 표본을 섭씨 영하 20도로 유지하고 보관하지 않을 때는 종이 타월로 덮어 빛에 노출되지 않도록 하십시오. 루시퍼라제 양성 세포를 시각화하기 위해 두 가지 다른 이미징 시스템을 사용할 것입니다. 체외 시술의 경우 멸균 이미지 시스템인 Xeno IVUS 50을 사용하고, 생체 내 시술의 경우 Xeno IVUS 200을 사용하여 생체 내 이미징을 위해 스탠포드 센터로 향할 것입니다.

이 시스템에는 작은 동물의 임시 마취를 위한 통합 로린 장치와 유도 챔버가 포함되어 있습니다. 좋아, 내 자신을 얻었다. 이제 체외 생물 발광 이미징으로 넘어가겠습니다.

체외 생물 발광 이미징을 위해서는 멸균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 따라서 이미징 시스템은 멸균 상태여야 하며, 가급적이면 세포 배양실에서 무균 상태여야 합니다. 이미징하기 전에 세포 배지를 제거하고 세포를 덮을 만큼만 PBS를 추가합니다.

예를 들어, 인간 배아 줄기 세포 배양액을 포함하는 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 PBS 1ml를 추가합니다. 데린과 PBS의 비율은 1:100이어야 합니다. 따라서 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 10마이크로리터의 해동 데린을 추가합니다.

문화권에 추가하기 전에 데린을 필터링하는 것을 잊지 마십시오. 1분을 기다린 후 플레이트를 챔버에 넣은 다음 10초의 노출 시간을 사용하여 이미지를 촬영하고 노출 시간을 조정합니다. 신호가 포화 상태이거나 너무 약하면 생물 발광 신호가 세포 수를 반영하므로 신호를 다른 세포 수와 연관시키는 정량 분석을 수행할 수 있습니다.

이 이미지는 일반적인 정량 분석 분석에서 가져온 이미지입니다. 왼쪽 상단에는 일부 인간 배아 줄기 세포 군집의 밝은 영역이 있습니다. 우리는 이 세포들이 녹색으로 형광을 발하기 때문에 우리의 리포터 유전자를 가지고 있다는 것을 알고 있습니다.

파란색을 분류하는 것은 dappy staining입니다. 하단 패널은 세포 수가 증가하는 문화 우물을 보여줍니다. 세포 수는 이 그래프에서 볼 수 있듯이 생물 발광 신호와 상관관계가 있습니다.

이 상관 관계는 생체 내 세포 증식을 추적하기 위한 반정량 분석을 제공합니다. 네, 이것이 시험관 시술입니다. 이제 생체 내 생물 발광 이미징으로 넘어 갑시다.

생체 내에서 기형종 형성을 이미지화하기 위해 반딧불이 루시퍼라제 리포터 유전자를 발현하는 인간 배아 줄기세포를 스키드 마우스의 등에 주입하고 IVU 시스템으로 생물 발광 이미지를 촬영할 것입니다. 세포를 이식할 준비가 되면 디스크 공간 또는 콜라겐 분해 효소를 사용하여 세포를 여러 번 풀어 성장 인자, 감소된 마트리겔 및 DMM의 일대일 혼합물로 현탁시킵니다. 일반적으로 먼저 세포를 냉각된 DMM과 혼합한 다음 마트리겔을 첨가합니다.

각 피하 위치를 위해, 우리는 200, matrigel DMM 혼합물의 50에서 100 마이크로 리터 양에서 중단된 000의 세포를 주사한다. 셀 번호는 응용 프로그램에 따라 조정할 수 있습니다. 주사하기 전에 모든 것을 얼음 위에 두는 것을 잊지 마십시오.

세포가 준비되면 마우스를 유도 상자에 넣어 마취합니다. iso 불소 흐름을 켠 상태에서. 약 1분 후, 마우스는 마취되고 연속 iso 불소와 함께 수술대에 놓일 수 있습니다.

자연적으로 자동 형광을 발하고 생물 발광 이미지를 가릴 수 있기 때문에 마우스 뒷면의 머리카락을 제거해야 합니다. 가장 쉬운 방법은 전기 면도기를 사용하는 것이지만 제모 젤을 사용하고 알코올로 닦아 나중에 피부를 살균할 수도 있습니다. 다음으로, 주사기에 100 마이크로 리터 세포 현탁액을 그려 23-27 게이지 바늘은 세포로 막히지 않기 때문에 가장 잘 작동합니다.

이제 피부가 상당히 느슨하기 때문에 피부 아래의 세포를 쥐의 등에 주입하십시오. 엄지와 검지를 사용하여 주입하려는 부위를 꼬집고 펴십시오. 너무 깊게 구멍을 뚫지 않도록 주의하면서 피부 바로 아래에 주입합니다.

또한 플런저를 누르는 동안 바늘이 주입 부위에서 미끄러지지 않도록 하십시오. 이렇게 하면 세포가 누출될 수 있는 피부에 구멍이 생기는 것을 방지할 수 있습니다. 세포를 주입한 후 다시 주입하려고 하면 마우스가 깨어나서 뛰어다닐 때까지 몇 시간 동안 기다렸다가 다시 절전 모드로 전환하십시오.

생물 발광 이미징의 경우 이렇게 하면 이소플루란 독성을 피할 수 있습니다. 자, 이제 주입된 세포의 생체 내 생물 발광 이미징을 진행할 준비가 되었습니다. 다음 이미징 연구를 위해 전체 동물의 생물 발광 이미징을 위해 이미 기형종 형성을 보여주기 시작한 마우스를 사용할 것입니다.

우리는 체중 1kg당 375mg의 루시퍼를 복강내 주사합니다. 따라서 마취된 동물의 무게를 측정하여 복용량을 계산하고, 정중선에서 약간 떨어진 복막에 루시퍼를 주입하고, 바늘을 다시 당겨 내부 장기에 손상이 있다는 표시인 피가 없는지 확인해야 합니다. 마우스가 깨어나기 시작하면 인덕션 챔버에 다시 넣고 1-2분 정도 기다리면 됩니다.

이미징 상자에 무광택 검은색 종이를 넣어 인간 배아 줄기 세포에서 방출되지 않는 빛을 흡수할 수 있도록 이미징을 준비합니다. 생쥐의 경우 최대 생물 발광 신호는 일반적으로 주입 후 15-40분 후에 발생합니다. 따라서 10-15분 후에 마우스 뒷면을 위로 향하게 하여 iso fluorine이 있는 이미징 챔버에 놓습니다.

노출 시간 10으로 시작합니다. 신호가 포화 상태이면 노출 시간을 줄여 보십시오. 너무 약하면 노출을 늘리십시오.

신호 노출 시간이 마우스에 최적화되면 신호가 최대에 도달할 때까지 매분 이미지를 촬영하기 시작합니다. 이는 이미징 소프트웨어를 사용하여 주사 부위를 덮는 관심 영역을 선택하는 것이 가장 좋습니다. 각 관심 영역에서 신호 강도를 모니터링하면 신호가 감소하기 시작하는 시점을 쉽게 판단하여 최대 신호 강도에 도달했음을 나타낼

우리는 최대값 부근에서 발생하는 세 개의 연속적인 이미지의 평균을 취하여 최종 값으로 사용합니다. 이미지가 만족스러우면 불소에서 마우스를 제거하고 케이지에서 깨어나도록 합니다. 일반적으로 마우스는 15분 이내에 깨어납니다.

원하는 시간 경과 후 생물 발광 이미지가 획득됩니다. 동물은 조직학에 사용되는 조직 절편에서 희생될 수 있습니다. 자, 이제 생체 내 이미징 절차를 모두 마쳤으므로 결과를 자세히 살펴보고 실험실의 이전 연구도 살펴볼 수 있습니다.

다음은 피하 기형종을 가진 3마리의 생쥐의 생물 발광 이미지입니다. 생물 발광 신호 데이터는 이미징 소프트웨어에 의해 자동으로 수행된 마우스의 흑백 사진에 오버레이되었습니다. 이것은 반딧불이 루시퍼라아제(firefly luciferase)로 가능한 종방향 이미징 유형의 예입니다.

이 경우, 초기 주입 후 인간 배아 줄기 세포를 심장에 직접 주입했습니다. 대부분의 세포는 심장 상공의 생물 발광이 감소하는 것에서 알 수 있듯이 다음 주에 죽습니다. 검은색 화살표에 유의하십시오.

이식에서 살아남은 인간 배아 줄기세포는 궁극적으로 심장에 기형종을 형성하며, 이는 약 14일째부터 급격히 증가하는 신호로 시각화할 수 있습니다. 7일째에는 빨간색 화살표로 표시된 두 번째 생물 발광 영역이 있음을 알 수 있는데, 이는 인간 배아 줄기 세포가 복부로 심장으로 추가로 누출되었음을 나타냅니다. 이것은 매우 일반적입니다.

방금 시험관 내에서, 그리고 살아있는 쥐에 이식한 후 루시페라제 리포터 유전자를 안정적으로 발현하는 인간 배아 줄기세포의 생물 발광 이미지를 획득하는 방법을 보여드렸습니다. 이 방법을 사용하면 조직 분석을 위해 많은 수의 동물을 희생할 필요 없이 세포 증식의 반복적인 이미징 및 모니터링이 가능하며, 이는 세포 정량화에 본질적으로 부정확할 수 있습니다. 마우스에서 이 절차를 수행할 때 올바른 농도의 delucci를 사용하고 노출 간격이 너무 길어 생물 발광 이미지가 포화되지 않도록 하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.