Niet-invasieve beeldvorming van gedissemineerde candidiasis in de zebravis Larven

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van technieken voor het infecteren van zebravislarven met de schimmelpathogeen candida albicans. Eerst wordt een fluorescerende schimmelcultuur klaargemaakt en worden de visembryo's gecoat. Vervolgens worden de vissen op een aros-injectieschaal opgelijnd.

Candida albicans wordt via het oor van elke vis in het ventrikel van de achterhersenen geïnjecteerd, vervolgens ingebed in laag-smeltende agarose en gevisualiseerd met epifluorescentiemicroscopie. Uiteindelijk kan deze methode worden gebruikt om de interactie tussen gastheer en pathogeen non-invasief in beeld te brengen in de complexe omgeving van de gastheer, in plaats van in het vereenvoudigde systeem van een Petrischaal. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals injectie in de staartvinader, is dat er een gelokaliseerde infectie wordt gecreëerd die niet leidt tot een letale gedissemineerde ziekte.

Verder maakt deze techniek een efficiënte injectie van de inherent grote C bucan-cellen in kleine zebravissenlarven mogelijk. Begin met het uitstrijken van een candida albican-stock op een gist-pone. Incubeer de dextrose-agarplaat overnight bij 37 °C om de koloniën te laten groeien.

Zodra de kolonies zichtbaar zijn, gebruik een steriele houten stok om een geïsoleerde kolonie op te pikken en los de gist op in vijf milliliters vers gist Extract Pepto dextrose-bouillon in culturenbuisjes van 16 bij 150 millimeter. Plaats de cultuur op een weefselkweek-roltrommel, uitgerust met een reageerbuiswiel, en incubeer deze gedurende de nacht bij 37 °C. Verplaats de volgende dag één milliliter van de cultuur naar een Eppendorf-buisje van 1,5 milliliter en centrifugeer dit bij 14.000 ×g gedurende één minuut om de cellen te pelletteren; verwijder vervolgens het supernatant en vortex de pellet om deze los te maken.

Resuspendeer de cellen in één milliliter PBS, vortex en centrifugeer ze opnieuw. Verwijder vervolgens het supernatant en herhaal deze wasstap. Herhaal dit in totaal drie keer om alle resterende kweekmedium te verwijderen.

Zodra de cellen zijn gewassen, telt u deze in een hemocytometer bij een verdunning van 1:100 in PBS. Voor een cultuur van 12 uur kunt u drie tot vier keer 10⁸ cellen per milliliter verwachten. Resuspendeer de gist tot een uiteindelijke concentratie van 10⁷ cellen per milliliter.

Gebruik een zeef om zebravisembryo's uit een kweektank te verzamelen op de dag vóór de injectie en bewaar deze in een eierwateroplossing die 60 mg/mL instant ocean zouten in steriel gedeïoniseerd water bevat. Plaats de embryo's vervolgens gedurende 24 uur bij 33 °C met een licht-donkercyclus van 12 uur. Dit maakt de ontwikkeling van het embryo tot het prim 25 larvale stadium mogelijk, het optimale stadium voor infectie op de dag van de infectie.

Breng de embryo's met een transferpipet in 60 milliliter eierwater over naar een extra diepe Petrischaal. Gebruik vervolgens een dissectiemicroscoop en Dumont-pincetten om de embryo's te ontkapselen. Dit kan worden bereikt door het chorion voorzichtig open te trekken, vergelijkbaar met het openen van een zak chips, totdat de vis eruit springt.

Zodra alle embryo's zijn ontdaan van de chorio-membraan, wordt de Petrischaal geschud om de vissen naar het midden te bewegen. Draag de vissen over naar het deksel van de schaal, verwijder het medium en vervang dit door vers eيwater. Voeg de vissen toe aan het verse eiwater.

Bereid met een transferpipet een oplossing van 200 µg/mL tricaine methanesulfonaat voor om de vissen te anesthetiseren. Verzamel 20 tot 50 embryo's en plaats deze gedurende één tot twee minuten, of totdat ze stoppen met bewegen, in de anesthesie-oplossing. Zet ondertussen de injectie-eenheid aan en controleer of de druk op pulse staat, de pulsduur op negen is ingesteld en de tegendruk-eenheid op 3 PSI staat.

Open langzaam het ventiel van de stikstoftank totdat de injectiedruk 30 PSI bereikt. Vul vervolgens een micropipet met vijf µL van de gevortexte Candida albicans-oplossing en plaats deze in de micropipethouder. Plaats een extra diepe Petrischaal met water op de tafel van de dissectiemicroscoop en stel de positie van de micropipet zo in dat deze in beeld is en de tip slechts gedeeltelijk in het water is ondergedompeld.

Knip vervolgens met een pincet de naald van de gepoolde pipet ongeveer drie millimeter vanaf de punt af. Als de naald succesvol is afgeknipt, moet de vloeistof gedispenseerd worden wanneer de voetpedaal van de injectie-eenheid wordt ingedrukt. Meet het gedispenseerde volume met een gegradueerde objectglasplaat en pas vervolgens de druk aan zodat het volume van de gedispenseerde vloeistof 0,21 millimeter in diameter is, of net kleiner dan de pupil van een zebravisembryo.

Zodra de microscoop is ingesteld en de vissen zijn gesedateerd, wordt het schaaltje volgezogen om de vissen naar het midden te trekken, waarna ze met een transferpipet worden opgenomen. Tik voorzichtig tegen de zijkant van de pipet zodat de vissen naar de punt zakken. Plaats de vissen vervolgens met een zo klein mogelijk volume voorzichtig in een voorverwarmd larvaal injectieschaaltje op 28 °C.

Lijn de vissen voorzichtig uit met een gladde glazen staaf. Verwijder vervolgens met een papieren handdoek zoveel mogelijk vloeistof uit de schaal. Plaats de aros-schaal met de vissen onder de microscoop totdat zowel de naald als de eerste vis duidelijk in beeld zijn.

Controleer of elke vis nog leeft door te letten op een zichtbare hartslag. Als de vis dood is, gooi deze dan weg en ga door naar de volgende. Beweeg de glazen naald naar de vis terwijl u inzoomt.

Voer deze handeling uit en steek vervolgens de naald voorzichtig in de cirkelvormige structuur van het oor van de vis, met de twee oorstenen die zich vlak achter het oog bevinden. Zodra de naald op positie is, injecteert u de gist met behulp van de voetpedaal. Als de naald correct is geplaatst, zal het ventrikel in de achterhersenen van de vis na de injectie licht opzwellen; trek de naald terug en herhaal de procedure bij de volgende vis.

Het gehele proces mag niet langer dan 15 of 20 minuten duren, anders zullen de vissen na deze tijd uitdrogen en sterven. De gist zal bovendien naar de bodem van de micropipet zakken, wat kan leiden tot een ongelijkmatige infectie, variërende doses en/of verstopping van de verzamelde micropipet. Zodra alle vissen zijn geïnjecteerd, gebruik dan eierwater om ze van de aros af te spoelen en in een schone Petrischaal met 60 milliliters eierwater te plaatsen.

Plaats de schaal vervolgens bij 28 °C. Sluit de stikstofklep en zet de injectieschakelaar op 'continu' om de druk in de tankleiding te ontlasten. Wanneer de druk tot nul is gedaald, zet u de schakelaar terug op 'puls' en schakelt u de injectie-eenheid uit.

Begin met het anesthetiseren van de geïnfecteerde vissen in tricaïnolmethaansulfaat zoals eerder beschreven. Zodra de vissen zijn geanesthetiseerd, wordt met een pipet één vis tegelijk overgebracht naar een Petrischaal met 0,4% low-melt agar. Gebruik vervolgens een transferpipet en zorg dat er zo min mogelijk agar wordt meegevoerd.

Verplaats elke vis vanuit de Petrischaal naar één putje van een glazen imaging-schaal met ongeveer 0,2 milliliters en 0,4% low-melt agarose, aangevuld met 200 micrograms per milliliter anestheticum bovenop de vis, zodat de binnenste cirkels gevuld zijn en een dunne laag agarose zich over de bodem van het putje verspreidt. De vissen kunnen nu tot 24 uur lang worden geïmaged met een omgekeerde microscoop met een laser-scanning confocale systeem. Vijf uur na het infecteren van zebravissen met rood fluorescentie *Candida albicans*.

De gist is zichtbaar in de achterhersenen van de vis in FL I one EGFP-vissen; bij vissen zoals deze zijn het vasculaire endotheel en macrofaagachtige cellen in het hele lichaam van de vis fluorescent. Deze worden hier in het groen getoond, vijf uur na infectie. De gist is binnen 24 uur zichtbaar binnen de macrofaagachtige cellen.

De infectie is verspreid langs het dorsale staartweefsel, waar de gist opnieuw kan worden aangetroffen in FTIC-cellen. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u Candida albicans micro-injecteert in het ventrikel van de achterhersenen van zebrafish in stadium Prim 25, inclusief: één, het voorbereiden van de schimmelcultuur; twee, het anesthetiseren van zebrafish-larven; drie, het micro-injecteren in het ventrikel van de achterhersenen.

En ten vierde, het voorbereiden van geïnfecteerde larven voor confocale beeldvorming.