In ovo electroporatie van kiजembryo's

Elektroporatie is een techniek die wordt gebruikt om vreemd genetisch materiaal in cellen te introduceren. Elektroporatie van kiजembryo's in het ei, of in ovo elektroporatie, is een waardevol instrument voor ontwikkelingsbiologen omdat de aflevering van genetisch materiaal kan worden gelokaliseerd tot specifieke weefsels en specifieke ontwikkelingsmomenten. Deze video introduceert de basisprincipes van in ovo elektroporatie, beschrijft de essentiële stappen van de procedure en bespreekt hoe deze techniek kan worden gebruikt om biologische processen tijdens de ontwikkeling te bestuderen.

Laten we beginnen met een herhaling van de basisprincipes van elektroporatie om te begrijpen hoe dit kan worden gebruikt om DNA in een cel te krijgen.

Ten eerste wordt micro-injectie gebruikt om het DNA in directe nabijheid van een doelcel af te leveren. Het DNA kan echter het plasmamembraan niet penetreren om de cel binnen te dringen.

Om dit probleem op te lossen, wordt een elektrische stroom toegepast om de stabiliteit van het membraan te verstoren, waardoor poriën ontstaan. Een tweede gevolg van dit elektrische veld is de migratie van het negatief geladen DNA naar de positieve elektrode. Hierdoor worden alleen cellen aan de zijde van de injectieplaats die dichter bij de positieve elektrode ligt, getransfecteerd met het DNA.

Nu u bekend bent met de basisprincipes, bespreken we hoe u embryo's voorbereidt voor electroporatie. Als u embryo's moet gebruiken die ouder zijn dan Hamburger Hamilton stadium 20, is het raadzaam om uw kuikens buiten de schaal te kweken, of ex ovo, voor een betere toegang tot het weefsel. Deze video richt zich op electroporaties die worden uitgevoerd op vroege embryo's die zich binnen de schaal ontwikkelen, of in ovo.

Om te beginnen moeten de eieren worden uitgebroed in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C totdat ze het gewenste ontwikkelingsstadium hebben bereikt. Terwijl de eieren worden uitgebroed, bereidt u de instrumenten voor injectie en electroporatie voor. Maak eerst capillaire naalden door een glazen pipet van 0,5 mm te trekken met een pipettentrekker. Om de pipet te openen, plaatst u deze onder een microscoop en breekt u een klein stukje van de tip af. Bereid vervolgens de injectieoplossing voor, die een passende verdunning van uw construct moet bevatten, evenals een kleurstof om u te helpen de geïnjecteerde oplossing te visualiseren.

Om de vloeistofstroom in de naald te beheersen, bevestigt u deze aan een handbediende mondpipet. Alternatief kan de naald worden geladen op een micro-injector, die instelbare luchtdrukpulsen levert. Vul de naald door de tip in de injectieoplossing te dompelen en negatieve druk toe te passen.

Naast naalden heeft u ook elektroden nodig. Deze bestaan uit twee blootliggende draden die door een adapter aan elkaar zijn bevestigd. Een paar kabels verbindt de elektroden met de elektrische pulsgenerator, of electroporator, die de pulsduur, frequentie en spanning regelt. Voor bediening zonder gebruik van de handen kan de electroporator worden geactiveerd door een voetpedaal.

Zodra de eieren klaar zijn, snijdt u een venster in de schaal en voegt u enkele druppels fysiologische zoutoplossing toe, zoals Hanks, om te voorkomen dat het embryo uitdroogt. Positioneer het ei onder een microscoop zodanig dat het weefsel van belang toegankelijk is voor de naald. Doorboor vervolgens het embryo met de capillaire naald en breng de oplossing aan door voorzichtig druk uit te oefenen.

Nu we het construct hebben geïnjecteerd, is het tijd om de elektroporatie uit te voeren. Positioneer de elektroden zodanig dat ze zijn ondergedompeld in de Hank's-oplossing en het betreffende weefsel gecentreerd tussen hen in ligt. Druk op het voetpedaal om de elektrische stroom toe te passen en let op de vorming van bellen rond de elektroden.

Zodra de elektroporatie is voltooid, verwijdert u de elektroden uit het embryo en veegt u ze schoon met 70% ethanol. Voeg een paar druppels zoutoplossing toe, aangevuld met antibiotica om infectie te voorkomen, en verzegel het venster met tape. Plaats de eieren tot slot terug in de incubator voor verdere ontwikkeling voorafgaand aan de fenotypische analyse.

Nu we alles hebben geleerd over in ovo electroporatie, kijken we naar enkele voorbeelden van hoe wetenschappers deze techniek toepassen in ontwikkelingsonderzoek.

Om te beginnen kan electroporatie worden gebruikt om genexpressie te blokkeren door de aflevering van knockdown-constructen. In dit voorbeeld werden cellen van de ontwikkelende neurale buis ge-electroporeerd met gene silencing-constructen. De embryo's kregen de tijd om zich te ontwikkelen, waarna axontrajecten tussen normale en knockdown-monsters werden vergeleken om de genetische controle van axonale geleiding te beoordelen.

Aan de andere kant kan in ovo electroporatie ook worden gebruikt om een eiwit in een subset van cellen tot expressie te brengen door een plasmide te introduceren dat een eiwitcoderend gen en een promotor bevat: een sequentie die RNA-polymerase bindt om de transcriptie te initiëren. Hier hebben wetenschappers een enkel gen in cellen van het embryonale brein afgeleverd. Weefselkleuring om zowel het eiwitproduct van dit gen als markers van specifieke neurale subtypen te detecteren, laat zien dat het ge-electroporeerde gen de neurale ontwikkeling verandert.

DNA-constructen die fluorescerende eiwitten coderen, kunnen ook via electroporatie worden geïntroduceerd om cellen en structuren tijdens de ontwikkeling te visualiseren. Dit maakt live-imaging van complexe processen mogelijk, zoals de ontwikkeling van het ruggenmerg, wat inzicht geeft in de dynamiek van celbewegingen over tijd.

U heeft zojuist de introductie van JoVE over in ovo electroporatie bekeken, een nuttige techniek voor het inbrengen van genetisch materiaal in kuikens. Deze video besprak de basisprincipes van electroporatie, de stappen die nodig zijn om kuikens te injecteren en te electroporeren, en de toepassingen van deze techniek in het huidige ontwikkelingsonderzoek. Bedankt voor het kijken!