Kweek van kuikens ex ovo

Het kuiken is een veelzijdig modelorganisme voor de studie van ontwikkelingspaden, omdat het grootste deel van de ontwikkeling buiten het lichaam van de moeder plaatsvindt. Desondanks verhindert de eierschaal de toegang tot het embryo voor sommige vormen van experimenten. Gelukkig kunnen kuikens buiten de schaal worden uitgebroed, of “ex ovo,” met behulp van enkele gangbare laboratoriumbenodigdheden. In deze video leert u over de principes van ex ovo-cultuur, de stapsgewijze procedures voor twee verschillende cultuurmethoden en de toepassingen van deze techniek in ontwikkelingsstudies.

Voordat we bespreken hoe kuikens ex ovo worden gekweekt, gaan we in op enkele principes van deze techniek. Binnen het ei ontwikkelt het kuiken zich in nauwe associatie met het vitelline membraan dat het eigeel omringt. Het resterende volume is gevuld met albumine, of eiwit, wat het embryo beschermt en dient als eiwitbron.

Kweek buiten de schaal kan worden uitgevoerd via een volledige eigeelkweek, waarbij alle ei-inhoud in een eenvoudige container wordt gebruikt. Als alternatief kunnen embryonale weefsels worden uitgesneden en gekweekt in een ex ovo explantaatkweek. Beide technieken hebben duidelijke voordelen ten opzichte van het gebruik van venster-eieren.

Ten eerste is het maken van een venster in kippenembryo's in een later stadium gecompliceerd vanwege de aanwezigheid van veel cruciale bloedvaten, die zich ontwikkelen binnen de membranen die het kuiken omringen. Dit maakt de ex ovo-methode bij voorkeur geschikt voor het werken met kuikens in latere stadia.

Ten tweede zijn ex ovo-kweekopstellingen beter geschikt voor beeldvorming met een hoge resolutie, omdat ze in beeldvormingsapparatuur passen.

Bovendien stelt het verwijderen van embryo's uit de schaal een groter aantal weefsels bloot voor experimentele manipulaties, zoals microchirurgie en micro-injectie.

Aangezien het kuiken voor bescherming en essentiële mineralen afhankelijk is van de eierschaal, vereist de overleving van het embryo zonder deze structuur extra zorg. Zo moet de behuizing zijn ontworpen om een steriele, vochtige omgeving te handhaven, en moeten voedingsstoffen worden geleverd in de vorm van albumine of kweekmedium. Voor langdurige kweek is ook vermalen schaal nodig als calciumbron. Bovendien is spanning op de membranen die het embryo ondersteunen belangrijk voor een normale ontwikkeling, waardoor een succesvolle ex ovo-kweek daarnaast afhankelijk is van een behuizing die de normale membraanmorfologie behoudt.

Nu u op de hoogte bent van de basisprincipes, is het tijd om aan de slag te gaan met de eieren! Om eieren voor ex ovo-kweek van de hele dooier voor te bereiden, begint u met het incuberen ervan bij 37,5 °C tot vlak voor het gewenste stadium.

Terwijl u wacht, bereidt u de behuizing voor. Petrischalen, weegbakjes en hangmatjes worden veelvuldig gebruikt om de inhoud van het ei vast te houden. Steriliseer eerst alle componenten door behandeling met UV-licht of ethanol.

Bereid daarnaast een buitenkamer voor die gevuld is met steriel water om de luchtvochtigheid tijdens de incubatie te handhaven.

Wanneer de eieren klaar zijn, plaatst u ze enkele minuten in een horizontale positie, zodat het embryo naar boven drijft. Breek vervolgens de onderkant van de schaal en breng de inhoud van het ei voorzichtig over in de behuizing. Dek tot slot het behuizingsvat af om de luchtvochtigheid te behouden en plaats de opstelling in een incubator totdat de gewenste leeftijd voor verdere verwerking is bereikt.

Een alternatieve ex ovo strategie, explantaatkweek, vereist enkele aanvullende stappen nadat het embryo uit de schaal is verwijderd.

Bij deze techniek wordt het vitellijnmembraan voorzichtig van de dooier gescheiden, waarbij het ontwikkelende embryo wordt meegenomen.

Vervolgens wordt het membraan gemonteerd om de spanning te behouden, wat kan door het weefsel strak rond een glazen ring te trekken of door eenvoudige hechting aan filterpapier.

Na de montage wordt kweekmedium toegevoegd om het weefsel te bedekken, en wordt het embryo in een bevochtigingskamer geplaatst.

De geëxplante embryo's kunnen nu worden teruggeplaatst in een incubator voor maximaal 24 uur verdere ontwikkeling.

Na het leren van de principes en methoden van ex ovo-cultuur zijn we klaar voor wat experimenten met pluimvee.

ex ovo-cultuur is bijzonder nuttig wanneer genexpressie in oudere embryo's moet worden gewijzigd. Een methode hiervoor is electroporatie, waarbij een elektrische stroom wordt gebruikt om celmembranen permeabel te maken voor de afgifte van genetisch materiaal. Omdat ex ovo-gecultiveerde embryo's ook zeer toegankelijk zijn voor beeldvorming, kan de opname van genetisch materiaal eenvoudig worden gevalideerd via fluorescentie-imaging van volledige embryo's.

Real-time imaging van celdynamiek is eveneens mogelijk met behulp van ex ovo-cultuur. Menselijke kankercellen kunnen tumoren vormen door bloedvaten van het chorioallantoïs-membraan van de kip, of CAM, te coöpteren. Na tumorvorming kunnen fluorescerende deeltjes direct in de bloedbaan worden geïnjecteerd en in real-time worden gevolgd. Accumulatie van deeltjes in tumorweefsel kan worden gebruikt als indicator voor angiogenese, oftewel de vorming van nieuwe bloedvaten.

Hoewel volledige embryo's kunnen worden gekweekt met explantaattechnieken, vereisen sommige experimenten dat embryonale weefsels vóór de cultuur worden gedisseceerd. Zo kan zich ontwikkelend neuraal weefsel worden uitgesneden en gekweekt op glazen dekglasjes. Na een incubatieperiode kan een specifieke populatie cellen, bekend als de neurale lijst, worden waargenomen terwijl deze vanuit het weefsel migreert. Behandeling met experimentele stoffen en timelapse-imaging kunnen vervolgens worden gebruikt om factoren te testen die de celmigratie controleren.

U heeft zojuist de JoVE-handleiding voor ex ovo-cultuur van kuikens bekeken. Deze video behandelde de principes van ex ovo-cultuur, de basis van whole-yolk- en explantaatmethoden, en enkele manieren waarop deze technieken tegenwoordig in laboratoria worden toegepast. Bedankt voor het kijken!